实时荧光定量pcr原理及应用
实时荧光定量PCR的原理操作及其应用
实时荧光定量PCR的原理操作及其应用实时qPCR的基本原理是利用DNA模板进行PCR扩增，并通过特定荧光探针或抑制剂标记扩增产物，荧光信号的强度与目标模板数量成正比。
PCR扩增过程中，荧光信号逐渐累积，通过荧光检测系统实时监测荧光的强度变化，可以获取PCR扩增曲线，并通过比较样品的荧光信号与标准曲线建立一个浓度与荧光信号的转换关系，从而确定样品中目标物质的数量。
实时qPCR的操作过程通常包括以下几个步骤：1.准备反应体系：根据所需扩增物质选择合适的引物和探针，并根据样品数量和扩增条件计算所需反应体系的配方。
反应体系中通常包括DNA模板、引物、探针、dNTPs、缓冲液和DNA聚合酶等。
2.设定PCR程序：根据不同引物的特性和样品的要求，设置PCR程序。
PCR程序通常包括一个初始变性步骤，多个循环变性/退火/延伸步骤和一个终止步骤。
循环变性/退火/延伸步骤的温度和时间通常根据引物的需求进行设定。
3.反应体系装填：将反应体系装入PCR管或耐热反应板中，确保样品和反应物均匀分布。
4.实时监测：将PCR反应体系置于实时荧光PCR仪中，根据设定的PCR程序进行扩增，并实时监测荧光信号的累积变化。
5.数据分析：根据荧光信号的变化情况，可以绘制PCR扩增曲线，并通过计算荧光信号的阈值周期数（Ct值）来确定样品中目标物质的相对数量。
比较不同样品的Ct值，可以进行定量分析。
实时qPCR具有广泛的应用。
1.基因表达分析：可以通过实时qPCR检测特定基因在不同组织或样品中的表达水平，从而研究基因在生理和病理过程中的作用。
2.病原体检测：实时qPCR可以用于快速、准确地检测和鉴定病原体，如细菌、病毒和寄生虫等，对于临床诊断和流行病学研究具有重要意义。
3.检测基因突变：实时qPCR可以用于检测个体中基因突变的存在与否，并进行基因型分析，从而研究与疾病相关的突变和遗传变异。
4.微生物学研究：可以通过实时qPCR检测微生物的数量和动态变化，了解其在环境中的分布和生物地理学特征，以及其在食品安全、环境保护等方面的应用。
实时荧光定量PCR技术在细菌检测中的应用
实时荧光定量PCR技术在细菌检测中的应用实时荧光定量PCR技术（Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction）是一种精确、快速的检测方法，广泛应用于生物医学研究和临床诊断中。
本文将讨论实时荧光定量PCR技术在细菌检测中的应用，并介绍其原理和优势。
一、实时荧光定量PCR技术原理实时荧光定量PCR技术基于传统的PCR原理，通过不断复制并扩增DNA片段，然后采用荧光信号检测系统实时监测PCR过程中的DNA合成数量。
在PCR过程中，引物与靶DNA片段结合并引发DNA合成，同时荧光探针与靶DNA片段结合释放出荧光信号。
荧光信号量与靶DNA的初始数量成正比，通过实时监测荧光信号的强度，可以实时定量测量靶DNA的含量。
二、实时荧光定量PCR技术在细菌检测中的应用1. 快速检测细菌的存在：实时荧光定量PCR技术可以在较短的时间内检测出细菌的存在与数量。
传统的培养方法需要一定的时间来培养细菌，而实时PCR技术几乎可以立即提供结果，帮助及时采取相应的措施。
2. 检测细菌的耐药性：实时荧光定量PCR技术可以检测出细菌对抗生素的耐药性。
通过检测细菌的特定基因或突变，可以判断其对不同抗生素的敏感性，为合理使用抗生素提供指导。
3. 检测细菌的毒力：实时荧光定量PCR技术可以检测细菌的毒力相关基因，帮助研究人员判断细菌的致病能力。
4. 监测细菌感染动态：由于实时PCR技术具有快速、准确等优势，可以用于监测细菌感染的动态变化。
在临床诊断中，可以通过实时PCR技术监测患者体内细菌的数量变化，从而评估治疗效果。
三、实时荧光定量PCR技术的优势1. 高灵敏度：实时荧光定量PCR技术可以检测到非常低浓度的细菌。
在样品中只存在几个细菌时，也能够准确检测出来。
2. 高特异性：实时荧光定量PCR技术通过特异性引物和探针的设计，可确保只扩增目标细菌的DNA片段，并排除其他DNA的干扰。
3. 高准确性：实时PCR技术通过实时监测PCR过程中的荧光信号，可以快速、准确地确定细菌的存在与数量。
实时荧光定量PCR技术的原理及应用
实时荧光定量PCR技术的原理及应用在PCR扩增反应结束之后，可对扩增产物进行定性和定量的分析。
但是无论定性还是定量分析，分析的都是PCR终产物。
但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经PCR扩增之前的起始模板量。
例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。
在这种需求下荧光定量PCR技术应运而生。
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，实现了PCR从定性到定量的飞跃。
1.实时荧光定量PCR技术的基本原理在实时荧光定量PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。
所谓实时荧光定量PCR技术，是指通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。
每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。
一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段, 荧光信号指数扩增阶段和平台期。
在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。
而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA 拷贝数。
只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。
在扩增曲线中：荧光阈值(threshold)是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光本底信号(baseline)标准差的10倍；Ct值的含义是指在PCR循环过程中,荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数,也就是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环次数；Rn+表示每点测量的荧光强度,代表反应管含有模板DNA ;Rn-表示荧光基线强度,代表反应管不含有模板DNA,其在理想情况下是一条平线,只具有背景荧光数值;ΔRn表示PCR过程中,探针降解的量,也即PCR产物的量；基线( baseline)是背景曲线的一段,范围为从反应开始不久荧光值开始变得稳定,到所有反应管的荧光都将要但是还未超出背景。
实时荧光定量PCR技术的原理及其应用
实时荧光定量PCR技术的原理及其应用引言实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种细胞遗传学和分子生物学研究中常用的分子检测技术。
它能够迅速、准确地进行DNA或RNA的定量测量，并在许多领域中广泛应用，例如基因表达分析、病原微生物检测和病毒定量等。
本文将重点介绍实时荧光定量PCR技术的原理和一些典型应用。
实时荧光定量PCR技术原理实时荧光定量PCR技术是在传统PCR反应的基础上发展而来的一种PCR变体。
其原理可以简单概括为光信号的实时检测和荧光强度的定量分析。
实时荧光定量PCR技术的具体步骤如下：1.引物与探针设计在实时荧光定量PCR反应中，合适的引物和探针设计是至关重要的。
引物用于在反应中特异性地扩增目标DNA或RNA序列，而探针则用于荧光信号的检测。
引物和探针的设计需要确保其与目标序列的亲和力和特异性，以避免非特异性扩增和假阳性结果。
2.标定曲线制备为了进行定量分析，需要事先制备一条标定曲线。
标定曲线通常是通过浓度已知的目标序列的一系列稀释样品制备的。
这些稀释样品经过PCR扩增后，荧光信号的强度与初始浓度呈线性关系。
通过测量待测样品的荧光信号强度，并利用标定曲线进行外推，可以获得目标DNA或RNA的定量结果。
3.PCR反应体系组装PCR反应体系的组装需要考虑到引物和探针的最优浓度，以及反应缓冲液、酶和模板DNA或RNA的最佳配比。
此外，反应体系中还需要加入辅助成分，如酶抑制剂和荧光染料，以提高PCR反应的特异性和灵敏度。
4.实时荧光检测及数据分析在PCR反应进行过程中，荧光信号会随着目标DNA或RNA的扩增而增强。
实时荧光定量PCR仪会实时监测和记录荧光信号的变化情况，并生成扩增曲线。
通过分析荧光信号的增长速度和荧光信号的峰值，可以确定目标DNA或RNA的起始浓度。
实时荧光定量PCR技术应用1. 基因表达分析实时荧光定量PCR技术在基因表达分析中被广泛应用。
荧光定量pcr实验原理与应用
荧光定量pcr实验原理与应用荧光定量PCR（qPCR）是一种高灵敏度、高特异性的DNA扩增技术，通过检测PCR反应体系中的荧光信号实时监测DNA的合成量。
这种技术结合了传统PCR的高效性和荧光探针的高度特异性，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因定量、基因型鉴定等领域。
一、原理荧光定量PCR利用荧光信号与PCR产物数量呈正比的原理，通过实时监测PCR反应过程中荧光信号的强度变化来确定反应体系中模板DNA的初始量。
在PCR反应中，荧光探针与特定的DNA序列结合，并发出荧光信号。
随着PCR反应的进行，产物数量逐渐增加，荧光信号也随之增加。
通过检测荧光信号的增长曲线，可以确定初始模板DNA的数量。
二、应用1.基因表达分析：荧光定量PCR可用于实时监测基因的表达水平，通过检测靶基因的mRNA量来研究基因在不同条件下的表达情况。
2.病原体检测：荧光定量PCR可用于快速准确地检测病原体的存在，如病毒、细菌等，对临床诊断和疾病监测具有重要意义。
3.基因定量：荧光定量PCR可用于定量分析基因拷贝数、基因表达水平等，对基因功能研究和疾病诊断有重要作用。
4.基因型鉴定：荧光定量PCR可用于检测基因型多态性，如单核苷酸多态性（SNP）、插入缺失等，用于遗传学研究和个体鉴定。
三、优势与传统PCR技术相比，荧光定量PCR具有以下优势：1.高灵敏度：荧光信号与PCR产物数量呈正比，可实现低拷贝数DNA的检测。
2.高特异性：荧光探针设计精准，可准确识别靶基因序列，避免非特异性扩增。
3.实时监测：可实时监测PCR反应过程中的荧光信号，得到实时、准确的反应动态信息。
4.高准确性：荧光定量PCR结果稳定可靠，可用于定量分析和比较研究。
荧光定量PCR作为一种高效、高灵敏的DNA定量技术，在生命科学研究、临床诊断、食品安全监测等领域具有广泛应用前景。
随着技术的不断发展和完善，荧光定量PCR将在更多领域发挥重要作用，为科学研究和临床实践提供强有力的支持。
功能基因组-荧光实时定量PCR原理及应用
沙门氏菌是人畜共患病的病原体，也是食源性疾病最常见的
病原体。目前对沙门氏菌的检测主要常规微应用生物学方法，但
是常规的检测比较费时费力。孔繁德等应用TaqMan探针定量PCR 检测方法，建立了快速检测沙门氏菌的RT-PCR方法，其检测灵敏 度比常规PCR方法高100倍，为沙门氏菌的检测提供一种更加快速 和灵敏的检测方法。羊痘也是动物病中最为严重的一种，常规诊 断羊痘感染的方法费时又费力并且特异性和敏感性不高。不能满 足快速准确诊断的要求。康文玉等参建立的TaqManPCR技术，该
荧光实时定量PCR原理及应用
l 实时荧光定量PCR检测技术的原理
RQ—PCR技术是通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用 荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量 的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。
Ct值(cycle threshold，Ct)，即PCR扩增过程中扩增产物的荧
GreenI染料不会发出荧光。使荧光信号的强度与PCR扩增产物
的增加同步。其原理如图6所示。SYBR GreenI在实时定量检测 方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结合，仅需2个用 于扩增的引物，不需设计探针对其标记。成本更低廉。不必因 模板不同而特别定制，设计的程序通用性比较好。
图6 SYBR Green 1荧光实时定量PCR 原理
如：应用封闭的检测，虽然减少了扩增后电泳的检测，但是不能
检测扩增产物的大小；荧光定量PCR的复合式检测因为荧光素种 类和检测光源而受限；实时定量PCR实验成本比较高，并不能成 为常规检测的主要技术手段。
但是定量PCR技术已经从粗略定量和半定量发展到精确的实时定 量和绝对定量。检测手段从扩增样品终点法到扩增过程中动态
实时荧光定量PCR技术详解和总结
实时荧光定量PCR技术详解和总结
一、什么是实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称RT-qPCR）是一种PCR扩增技术，具有灵敏度高、重复性好等特点，可以在实时监测PCR扩增过程中特定片段DNA的产生。
它可以用来检测细胞中其中一特定基因mRNA的表达水平，从而揭示基因活动和表达情况，同时用于特定基因检测，如非病毒性疾病的病原检测以及芯片高通量分析等。
二、实时荧光定量PCR的基本原理
实时荧光定量PCR其基本原理就是利用PCR技术，在特定温度、适当时间内，将少量的模板 DNA 放大成数十亿倍以上。
实时荧光定量PCR的一大特点就是，它能够在实时监测PCR的扩增过程中，随时得知扩增物（amplicon）的数量。
根据扩增的量，从而确定所检测样本中的特定片段DNA的数量，即“定量”。
实时荧光定量PCR可实现定量检测，是因为它引入了一种特殊的参考基因，即“内参基因”，其用来抵消PCR条件、酶种类、反应液等的影响，从而测定量结果的准确性。
三、实时荧光定量PCR的实验步骤
（一）模板提取和核酸纯化：根据实验材料，提取DNA或RNA模板，进行核酸纯化，获得纯度较高的核酸。
（二）制备PCR反应液：制备由dNTPs、PCR酶、聚合酶等试剂组成的PCR反应液，根据所要检测的基因。
实时荧光定量pcr原理
实时荧光定量pcr原理实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）是一种用于检测和定量DNA或RNA的技术。
它结合了PCR技术和荧光探针技术，能够实时监测PCR反应过程中的荧光信号变化，从而实现对目标核酸的定量分析。
本文将介绍实时荧光定量PCR的原理及其在科研和临床中的应用。
实时荧光定量PCR的原理基于PCR技术，PCR是一种体外扩增DNA的方法，通过DNA聚合酶酶链反应（PCR）使目标DNA序列在体外得到扩增。
而实时荧光定量PCR则在PCR反应中引入了荧光探针，利用荧光信号的变化来监测PCR反应的过程。
在实时荧光定量PCR中，通常使用的荧光探针包括SYBR Green和TaqMan探针。
SYBR Green是一种DNA结合染料，它能够与PCR反应中产生的双链DNA结合并发出荧光信号，因此可以用来监测PCR反应的进程。
TaqMan探针则是一种双标记探针，包括一个荧光素和一个荧光淬灭器，它能够在PCR反应中特异性结合目标DNA序列并发出荧光信号，因此可以用来定量PCR反应中的目标DNA。
实时荧光定量PCR的原理可以简单概括为，首先，将待扩增的DNA样品与引物和荧光探针一起加入PCR反应体系中；然后，利用热循环装置对PCR反应体系进行多次循环加热和降温，使目标DNA序列得到扩增；在PCR反应过程中，荧光探针与目标DNA结合并发出荧光信号，这些信号会被实时监测和记录下来；最后，通过分析监测到的荧光信号的变化，可以计算出PCR反应体系中目标DNA的起始量，并进行定量分析。
实时荧光定量PCR在科研和临床中有着广泛的应用。
在科研领域，实时荧光定量PCR可以用于基因表达分析、病原微生物检测、基因型分析等方面，其高灵敏度和高特异性使其成为了研究人员进行生物学研究的重要工具。
在临床诊断中，实时荧光定量PCR可以用于疾病的早期诊断、疾病的病原体检测、药物代谢酶基因型分析等方面，其快速、准确和可靠的特点使其成为了临床诊断中不可或缺的手段。
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RNA Virus 74bp amplicon
HBV (CY5)
DNA virus 81bp amplicon
实时定量PCR应用
➢绝对定量 ➢相对定量 ➢SNP分析
应用之一：病原体检测与定量
绝对定量（检测起始模板数的精确拷贝数－病原 体的多少）
• 标准品（如质粒）：做系列梯度稀释 • 待测样本 • 阴性对照（NTC）
应用之二：基因表达差异分析
1
2
3
4
应用之二：基因表达差异分析
应用之三：SNP分析
两条探针分别针对不同等位基因
G T
A
A
T G
C
C
应用之三：SNP分析
FAM TET
1
FAM TET
2
应用之三：SNP分析
1
2
Thank you！
选择吉泰，选择成功！
本文观看结束！！！
谢谢 欣 赏！
C(t)值与阈值
[DNA]
Ct Ct
Ct Cycle
阈值threshold 检测极限
荧光定量PCR原理
• 起始模板浓度的对数 与C(t)值成反比
如何定量
① 绘制标准曲线 ② 所测样本C(t)值 ③ 定量
标准曲线
通过已知起始拷贝数的标准品作出的标准曲线，根据样品的Ct值，依据 Log起
， 始拷贝量与Ct的线性关系 就可以计算出样品中所含的模板量
实时荧光定量PCR原理及应用
张达威 上海吉泰生物科技有限公司
主要内容
• 荧光定量PCR原理 • 荧光定量PCR方法与应用
荧光定量PCR定义
在PCR反应体系中，加入荧光集团， 利用荧光信号的累积对PCR反应过程 实时监控，最终对初始模板进行定量。
传统PCR定量与实时定量PCR
➢ 传统的PCR定量是一种终点法的检测： 动态范围受限 检测重现性极差
Acceptordye (Quencher)
unbound probe free in solution
Light Taq
energy transfer
Light emission
Light
Light emission
Taq
Taqman探针：是与目的序列互补的
寡聚核苷酸，5‘端标记荧光报告集团， 3’端标记荧光淬灭集团，探针完整时 不发出荧光，水解后发出荧光。
➢ 不能区分引物二聚体，单链二级结构，非特异
性产物 ➢需要做熔解曲线分析产物的单一性
SYBR green 是一个很好的初级化学试剂，价格上存在优势， 在试验验证和问题分析上非常有用。
熔解曲线分析
单一峰，无非 特异性产物， 定量准确
有杂峰，有非 特异性产物， 定量不准确
Taqman探针法
Reporterdye
特点： ➢ 特异性高：只有引物和探针都和
同一模板结合时才能检测 ➢完全实时监测：一分子荧光信号对 应一条DNA链的产生 ➢多通道检测：可以在一次反应中同 时检测多个不同目的基因序列
Taqman 三通道实验
Daniel Candotti - Cambridge, UK
HCV (FAM)
RNA virus 65bp amplicon
应用之一：病原体检测与定量
1
2
3
4
应用之一：病原体检测与定量
应用之二：基因表达差异分析
相对定量：基因表达量上升或者表达被抑止的 倍数 •两种样品：Calibrator（对照，如正常组织） 与Sample（待测样品） •两个基因：目的基因与看家基因
应用之二：基因表达差异分析
Calibrator
Gene of Interest Ct
目的基因
Sample Ct
Ct1
Normalizer
Ct
Ct
Ct2
看家基因
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
应用之二：基因表达差异分析
/ Ct1
基因表达差异＝2
2 Ct2
＝2 Ct1 - Ct2
应用之二：基因表达差异分析
RNA抽提
定量PCR
RT
cDNA产物
系列稀释
两个基因的扩增效率
传统PCR与实时定量PCR
终点检测
重复性好 精确度高
Ct
误差小
阈值与CT值
• 阈值threshold ：在荧光信号指数扩增阶段， 在扩增曲线任意位置上人为设定的一个值， 一般我们将荧光阈值的缺省设置是 3-15 个 循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。
• CT=cycle threshold即阈值循环数：荧光信 号达到阈值设定值时PCR所经历的循环数。
➢ 实时定量PCR依靠荧光信号的扩增进行检测： 灵敏度高 重复性 好 动态范围宽 高通量
Gel-based quantification
11,500 counts / 5200 counts = 2.2 fold difference
Real-time quantification
Ct 18 and Ct 22, 2^(4 Ct shift) = 16 fold difference
荧光定量PCR方法
➢荧光染料法 ➢荧光探针法
染料和探针
DNA binding SYBR Green I™
TaqMan®
Probe based detection
Molecular Beacons
Taq
Taq
SYBR Green法作用机理
SYBR Green:
➢最大吸收波长约为 497nm ，发射波长最大约 为 520nm ➢染料只与双链DNA小沟结合，单链不结合 ➢游离时荧光信号非常低，结合后荧光信号强度 增强1000倍