实时荧光定量pcr原理及引物设计
荧光定量pcr的原理方法
荧光定量pcr的原理方法
荧光定量PCR（Fluorescent Quantitative PCR，qPCR）是一种用荧光信号量化检测PCR产物的方法，用于定量分析目标DNA或RNA的含量。
荧光定量PCR的基本原理如下：
1.引物设计：设计特异性引物，使其能够特异性地扩增目标DNA或RNA序列。
2.模板DNA或RNA的提取：从样品中提取目标DNA或RNA。
3.cDNA合成：对于RNA样品，需要首先将RNA反转录成cDNA，作为PCR 的模板。
4.Real-time PCR扩增反应：将模板DNA或cDNA与引物和荧光探针一起加入PCR反应体系中，进行实时PCR扩增。
PCR反应体系中还包括核苷酸，聚合酶和缓冲液等。
5.荧光信号检测：随着PCR的进行，荧光探针被解旋成单链，释放出与之配对的荧光染料。
荧光染料产生荧光信号，信号强度与扩增产物的数量成正比。
6.荧光信号检测系统：荧光信号检测系统实时检测PCR反应体系中的荧光信号，并将其转换成数值。
7.标准曲线绘制：通过使用已知浓度的标准品进行一系列稀释，绘制出标准曲线。
标准曲线将荧光信号强度与目标DNA或RNA的初始浓度之间建立了一个标准关系。
8.样品定量：通过对样品的荧光信号强度进行测量，并使用标准曲线进行插值计算，确定样品中目标DNA或RNA的初始浓度。
荧光定量PCR具有高灵敏度、高特异性、宽动态范围、低检测限和快速分析等优点，广泛应用于分子生物学和疾病诊断等领域。
实时荧光定量PCR的原理操作及其应用
实时荧光定量PCR的原理操作及其应用实时qPCR的基本原理是利用DNA模板进行PCR扩增，并通过特定荧光探针或抑制剂标记扩增产物，荧光信号的强度与目标模板数量成正比。
PCR扩增过程中，荧光信号逐渐累积，通过荧光检测系统实时监测荧光的强度变化，可以获取PCR扩增曲线，并通过比较样品的荧光信号与标准曲线建立一个浓度与荧光信号的转换关系，从而确定样品中目标物质的数量。
实时qPCR的操作过程通常包括以下几个步骤：1.准备反应体系：根据所需扩增物质选择合适的引物和探针，并根据样品数量和扩增条件计算所需反应体系的配方。
反应体系中通常包括DNA模板、引物、探针、dNTPs、缓冲液和DNA聚合酶等。
2.设定PCR程序：根据不同引物的特性和样品的要求，设置PCR程序。
PCR程序通常包括一个初始变性步骤，多个循环变性/退火/延伸步骤和一个终止步骤。
循环变性/退火/延伸步骤的温度和时间通常根据引物的需求进行设定。
3.反应体系装填：将反应体系装入PCR管或耐热反应板中，确保样品和反应物均匀分布。
4.实时监测：将PCR反应体系置于实时荧光PCR仪中，根据设定的PCR程序进行扩增，并实时监测荧光信号的累积变化。
5.数据分析：根据荧光信号的变化情况，可以绘制PCR扩增曲线，并通过计算荧光信号的阈值周期数（Ct值）来确定样品中目标物质的相对数量。
比较不同样品的Ct值，可以进行定量分析。
实时qPCR具有广泛的应用。
1.基因表达分析：可以通过实时qPCR检测特定基因在不同组织或样品中的表达水平，从而研究基因在生理和病理过程中的作用。
2.病原体检测：实时qPCR可以用于快速、准确地检测和鉴定病原体，如细菌、病毒和寄生虫等，对于临床诊断和流行病学研究具有重要意义。
3.检测基因突变：实时qPCR可以用于检测个体中基因突变的存在与否，并进行基因型分析，从而研究与疾病相关的突变和遗传变异。
4.微生物学研究：可以通过实时qPCR检测微生物的数量和动态变化，了解其在环境中的分布和生物地理学特征，以及其在食品安全、环境保护等方面的应用。
概述荧光定量PCR技术的基本原理
概述荧光定量PCR技术的基本原理
荧光定量PCR技术是一种用于定量测量目标DNA序列数量的技术。
它基于普通PCR技术，但在PCR反应中引入了一种荧光探针，以实现对产物扩增过程的实时监测和定量测量。
实现荧光定量PCR的基本原理如下：
1. 选择适当的引物和荧光探针：引物用于特异性扩增目标DNA序列，而荧光探针用于标记并检测PCR产物的存在。
2. 引物和荧光探针的设计：引物的设计要确保特异性扩增目标DNA序列，而荧光探针通常由一个荧光染料和一个荧光淬灭器组成，荧光染料在引物与目标DNA序列结合时发荧光信号，而荧光淬灭器则抑制荧光信号。
3. PCR反应条件的设置：包括扩增温度、循环数等参数的设置，以确保高效的PCR扩增反应。
4. 实时监测PCR反应：在PCR反应过程中，荧光探针与目标DNA序列结合并发荧光信号，荧光信号的增加与PCR产物的扩增过程成正相关。
通过荧光信号的强度可以定量测量目标DNA序列的数量。
5. 分析数据：根据荧光信号的强度和扩增循环数，可以绘制荧光增幅曲线，并通过内部标准物质或标准曲线来计算目标DNA序列的浓度。
荧光定量PCR技术具有高灵敏度、高特异性和高准确性的优点，可以用于基因表达分析、突变检测、病原体检测等领域。
实时荧光定量PCR原理
实时荧光定量PCR原理1.PCR基本原理PCR通过在不断循环的体系中复制和放大特定DNA片段，从而实现DNA的快速扩增。
PCR反应通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，DNA的双链结构被解开，形成两条单链DNA。
在退火步骤中，引物与目标DNA的互补序列结合，形成引物-目标DNA结合复合物。
在延伸步骤中，DNA聚合酶通过追加互补碱基，并使用引物作为起始点，在目标DNA的基础上合成新的DNA链。
实时荧光PCR是对传统PCR技术的改进，它通过添加荧光探针（也称为探针引物）来实时监测PCR反应的进程。
荧光探针通常由两部分组成：一个荧光标记物和一个定向增效子。
在PCR反应的延伸步骤中，荧光探针与目标DNA的互补序列结合，并被PCR酶切割，导致荧光信号被释放。
3.原理图解实时荧光PCR通常需要使用一个双喷嘴热循环仪（Thermal Cycler），其中一个喷嘴用于控制样品的温度，另一个喷嘴用于实时监测PCR反应的进程。
具体的PCR反应流程如下：-备制PCR试剂：将PCR反应所需的试剂混合均匀，包括DNA模板、引物、荧光探针和内参物。
-生成PCR产物：通过一系列的循环反应，将DNA模板放大成大量的PCR产物。
-荧光信号监测：PCR反应过程中，荧光探针与PCR产物的结合会释放荧光信号。
实时荧光PCR系统通过探测和记录PCR反应体系中的荧光信号，并在每个循环结束时测定信号强度。
4.数据解读和PCR效率计算实时荧光PCR的结果通常以荧光信号的周期阈值（Ct值）表示，Ct值是荧光信号强度超过背景噪音的循环数。
Ct值越低，表示PCR产物浓度越高，反之亦然。
根据Ct值，可以计算PCR的效率。
效率（E）的计算公式为：E =10^(-1/slope) - 1，其中slope为荧光曲线的斜率。
效率越接近1，表示PCR反应越有效。
5.RT-qPCR的应用RT-qPCR可应用于多个领域，包括基因表达分析、病原体检测和药物开发等。
实时荧光定量PCR技术的原理及其应用
实时荧光定量PCR技术的原理及其应用引言实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种细胞遗传学和分子生物学研究中常用的分子检测技术。
它能够迅速、准确地进行DNA或RNA的定量测量，并在许多领域中广泛应用，例如基因表达分析、病原微生物检测和病毒定量等。
本文将重点介绍实时荧光定量PCR技术的原理和一些典型应用。
实时荧光定量PCR技术原理实时荧光定量PCR技术是在传统PCR反应的基础上发展而来的一种PCR变体。
其原理可以简单概括为光信号的实时检测和荧光强度的定量分析。
实时荧光定量PCR技术的具体步骤如下：1.引物与探针设计在实时荧光定量PCR反应中，合适的引物和探针设计是至关重要的。
引物用于在反应中特异性地扩增目标DNA或RNA序列，而探针则用于荧光信号的检测。
引物和探针的设计需要确保其与目标序列的亲和力和特异性，以避免非特异性扩增和假阳性结果。
2.标定曲线制备为了进行定量分析，需要事先制备一条标定曲线。
标定曲线通常是通过浓度已知的目标序列的一系列稀释样品制备的。
这些稀释样品经过PCR扩增后，荧光信号的强度与初始浓度呈线性关系。
通过测量待测样品的荧光信号强度，并利用标定曲线进行外推，可以获得目标DNA或RNA的定量结果。
3.PCR反应体系组装PCR反应体系的组装需要考虑到引物和探针的最优浓度，以及反应缓冲液、酶和模板DNA或RNA的最佳配比。
此外，反应体系中还需要加入辅助成分，如酶抑制剂和荧光染料，以提高PCR反应的特异性和灵敏度。
4.实时荧光检测及数据分析在PCR反应进行过程中，荧光信号会随着目标DNA或RNA的扩增而增强。
实时荧光定量PCR仪会实时监测和记录荧光信号的变化情况，并生成扩增曲线。
通过分析荧光信号的增长速度和荧光信号的峰值，可以确定目标DNA或RNA的起始浓度。
实时荧光定量PCR技术应用1. 基因表达分析实时荧光定量PCR技术在基因表达分析中被广泛应用。
实时荧光定量pcr的原理
实时荧光定量pcr的原理
实时荧光定量PCR是一种基于聚合酶链反应（PCR）的技术，用于测量DNA或RNA分子的数量。
它通过将荧光探针引入PCR反应混合物中，利用荧光信号的增加来定量PCR过程中
的DNA合成。
实时荧光定量PCR原理的核心是荧光探针的使用。
荧光探针
通常包含一个荧光染料和一个与其配对的探针序列。
在PCR
过程中，荧光探针与PCR引物一起在目标序列的特定位置结合，并被DNA聚合酶酶切为两个片段。
当荧光探针与目标序列结合时，荧光染料受到荧光共振能量转移的影响，导致荧光信号暗淡。
随着DNA合成的进行，DNA
聚合酶将到达荧光探针的剪切位点，荧光染料被释放并发出荧光信号。
实时荧光定量PCR设备配有一个光学检测系统，能够在PCR
反应混合物中的每一个循环中检测荧光信号的强度。
该系统测量荧光信号的增加，并将其转化为相应的荧光单位。
通过与标准曲线比较，可以确定在每个PCR循环中合成的
DNA量。
标准曲线是在已知浓度下制备的DNA模板的荧光强度与其相对DNA浓度之间的关系。
通过测量荧光信号的强度，并用标准曲线进行校正，可以得到PCR反应混合物中目标
DNA的初始数量。
因此，实时荧光定量PCR可以定量测量PCR反应中的DNA
合成，并提供高灵敏度和准确性的结果。
它广泛应用于分子生物学、遗传学、病原体检测等领域，成为许多实验室中常用的技术。
实时荧光定量PCR的原理及实验
实时荧光定量PCR的原理及实验无论是对遗传病(如地中海贫血和血友病)、传染病(如肝炎和艾滋病)或肿瘤进行基因诊断，还是研究药物对基因表达水平的影响，或者监控药物和疗法的治疗效果，定量pcr技术都可以发挥很大作用。
定量pcr技术的最新进展是实时荧光定量。
该技术借助于荧光信号来检测pcr产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到pcr每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定ct值，从而根据ct值确定起始dna拷贝数，做到了真正意义上的dna定量。
这是dna定量技术的一次飞跃。
根据最终得到的数据不同，定量pcr可以分为相对定量和绝对定量两种。
典型的相对定量如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。
根据所使用的技术不同，荧光定量pcr又可以分为taqman探针和sybr green i荧光染料两种方法。
比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精确；荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更为简便。
在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定。
定量实验与定性实验最大的不同，是要考虑统计学要求并对数据进行严格的校正，以消除偶然误差。
因此重复实验和设立内对照非常重要。
由于各种各样的客观原因，这一点在实践中往往被轻视或忽视，需要着重强调。
当然，与定性实验一样，定量pcr也要设立阴性和阳性对照，以监控试剂和实验操作方面可能出现的问题。
1为什么终点定量不准确？我们都知道理论上pcr是一个指数增长的过程，但是实际的pcr扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是s形曲线。
这是因为随着pcr循环的增多，扩增规模迅速增大，taq酶、dntp、引物，甚至dna模板等各种pcr要素逐渐不敷需求，pcr的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。
当所有的taq酶都被饱和以后，pcr就进入了平台期。
由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的pcr反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。
实时荧光定量PCR的原理
实时荧光定量PCR的原理1.PCR反应：2.荧光探针：实时荧光定量PCR通常使用两种类型的荧光探针来检测扩增过程：探针型Ta qMan探针和缺失型探针。
其中，探针型Ta qMan探针包含一个引物序列和一个标记荧光物。
在反应的延伸过程中，引物结合到目标序列上，同时荧光物会被系统特定的DNA聚合酶切断，从而释放出荧光信号。
缺失型探针则使用两个引物来结合目标序列的两个不同区域，其中一个引物上标记了荧光物，另一个引物上是荧光物对应的抑制剂。
当两个引物结合到目标序列上时，抑制剂阻止荧光物的释放，从而抑制荧光信号。
这两种探针的核心原理是通过荧光信号的释放或抑制来定量PCR扩增过程中的产物。
3.荧光信号检测：实时荧光定量PCR使用荧光实时检测系统检测PCR反应过程中的荧光信号。
常见的检测系统包括荧光比色法、熔解曲线分析法和荧光信号累积法等。
荧光比色法是将PCR反应体系加入一种荧光染料，其荧光信号随着PCR过程中产物的累积而增加。
熔解曲线分析法则通过逐渐升高温度，分析PCR产物的特征性熔解温度，从而确定PCR反应的特异性。
荧光信号累积法利用PCR反应产物与荧光探针的结合释放出的荧光信号的数量与产物量成正比的原理，定量PCR产物的数量。
4.数据分析：实时荧光定量PCR的数据分析通常使用阈值循环数（Ct）方法。
Ct值定义为PCR反应的循环数，PCR产物的荧光信号超过设定阈值的循环数。
Ct值越小，说明待测DNA的起始量越多。
通过建立标准曲线，将待测样品的Ct值与标准曲线对应的起始DNA量进行比较，从而计算出待测样品的目标DNA的起始量。
总体来说，实时荧光定量PCR通过引入荧光探针并使用荧光信号检测系统，实现对PCR反应中的产物进行实时定量。
其原理简单可靠，广泛应用于基因表达、突变检测、病毒定量等领域，是分子生物学研究中不可或缺的工具之一。
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相对定量
典型应用领域: mRNA 表达水平的检测(e.g. 细胞因子, 肿瘤) 基因定量 (e.g. 染色体缺失) 研究疾病的微小残留病灶(MRD) GMO 检测…
检测病原体载量(e.g. legionella, anthrax)
筛选抗生素抗性基因(e.g. MRSA, VRE) 水质监测…
qRT-PCR的定量分析方法
RNA提取及逆转录
• 注意事项 样品量和Trizol的加入量一定要按比例，不能随意增加样品量或 减少Trizol量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降 解。 实验过程必须严格防止RNase的污染。 DNase （RNase-free） RRI （Recombination RNase Inhibitor）
GAPDH 5.8S,18S, 28S RNA ß2-microglobulin G6PDH PBGD aldolase HPRT U3, U8, ... ornithin decarboxylase ... multigene family; 10-30 genes; > 200 in mouse mostly pseudogenes pseudogenes no pseudogenes no pseudogenes no pseudogenes pseudogenes pseudogenes Pseudogenes : tumors : lung, pancreatic, colon cancer : insulin, EGF : Non-Hodgkin lymhoma abnormal expression in tumors : kidney, stomach tumor : hormones, oxidant stress, growth factors
qPCR
数据分析
样品处理
细菌样品 收集1-5*109细菌，置于液氮 研磨，加入1mL Trizon，混匀，高温（55℃） 细胞样品 收集1-5*107细胞，加入1mL Trizol，混匀，进行RNA提取或者放置于-80℃冰箱 动物样品 取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5 mL离心管中，加入 1ml Trizol充分匀浆。
逆转录-实时荧光定量PCR （RT-）qRT-PCR
（RT-）qRT-PCR （Reverse transcription） quantitative real time PCR RT-PCR Reverse transcription-PCR Real-time PCR
样品处理
RNA提取 及逆转录
qRT-PCR的标记方法
特异性荧光标记 • Taqman探针法
与目标序列互补
• TaqMan探针的特性： (1).5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 (2).3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) (3).探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分 开，发荧光 (4).Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
RNA提取及反转录
• 将处理好的样品置于室温，静置5 min • 加入0.2mL氯仿，振荡15s，静置5 min • 4℃离心，12000g× 15min，取上清 • 加入等体积异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min • 4℃离心，12000g× 10min，弃上清 • 加入1ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g× 5min，弃上清 • 晾干，加入适量的DEPC H2O溶解（65℃促溶10-15min）。
qRT-PCR的标记方法
非特异性荧光标记 • 熔解曲线
• 对PCR产物加热，随着温度的升高，双链扩增产物逐渐解链，导致荧光强度 下降，到达某一温度时，会导致大量的产物解链，荧光急剧下降。利用该特 点以及不同PCR产物其Tm值的不同，因此使其荧光信号发生迅速下降的温 度也不同，可通过此对PCR的特异性进行鉴定。
表达水平在所有样品中是持续、稳定的：正常组织 vs. 肿瘤组织 表达水平不受实验条件变化的影响：处理样本 vs. 未处理的样本
Gene Genomic structure / pseudogenes
• 看家基因 (Housekeeping genes) ß-actin multigene family; > 20 genes; 1 active locus ：编码有基础细胞功能的蛋白 : hormones of tyroid gland 20 pseudogenes : stomach tumor multigene family; pseudogenes 质 g-actin
• Taqman MGB探针
• 分子信标
qRT-PCR的标记方法
非特异性荧光标记 • SYBR Green Ⅰ是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有 绿色激发波长的原料。
qRT-PCR的标记方法
非特异性荧光标记 • SYBR Green I作用原理
qRT-PCR的标记方法
非特异性荧光标记 • SYBR Green I标记注意事项 • SYBR Green I与任何dsDNA进行结合后散发荧光，因此如果反应 体系中有非特异性扩增或者引物二聚体的生成，也将同时被检测， 从而导致检测结果不准确。 • 设计合适引物，防止非特异性扩增。 • 反应结束后必须做熔解曲线分析。
qRT-PCR的定量分析方法
相对定量分析方法 • 内参基因的作用：利用内参基因 (=内源性对照) 对样本间的差异 进行归一化处理 • 内参基因可以修正： 样品起始量的差别 样品中核酸回收率的差别 样品中可能的RNA降解 不同样品中核酸质量的差别 加样差
qRT-PCR的定量分析方法
相对定量分析方法 • 理想的内参基因
与常规PCR技术比较 常规PCR对扩增终产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准 确定量，无法对扩增反应实时监测。
qRT-PCR的化学原理
• 起点定量：起始DNA量是样本中原来的DNA量，更有意义，重现 性好，误差小。 • 终点定量：终点DNA的量是经过PCR放大的量，存在部分“失 真”，并非研究所期望的数据，误差大。
qRT-PCR的化学原理
• 典型的PCR扩增四个阶段
qRT-PCR的化学原理
• 三个概念
基线（Baseline）：是指在PCR扩增反应 的最初数个循环里，荧光信号变化不大。 接近一条直线，这样的直线即是基线。
荧光域值（threshold）的设定：一般将 PCR反应前 15个循环的荧光信号作为荧 光本底信号，荧光域值是PCR 3-15个循 环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设 定在 PCR扩增的指数期。
绝对定量分析方法
• 绝对定量一般通过标准曲线来确定目的基因在样本中的分子数目，即通常所 说的拷贝数。 • 绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品，必须做标准曲线。
qRT-PCR的定量分析方法
绝对定量分析方法 • 标准品的制备 • 严格意义上的操作要求将PCR产物切胶后进行胶回收，并进行质 粒的连接、转化到感受态大肠杆菌中，质粒在大肠杆菌中增值后 提取质粒，并用分光光度计测定含有PCR产物的质粒的OD值，借 此来确定质粒的摩尔量，将已知摩尔量的质粒做5倍或10倍的连 续梯度稀释，做成质粒标准品，这是准确测定样品中目的基因模 板量的定量基础。 • 现在也有的不做质粒，直接测定纯化后的PCR产物的摩尔量，然 后梯度稀释PCR产物，以此来作为标准品。
qRT-PCR的数学原理
在扩增产物达到阈值线时: XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M 方程式(1)两边同时取对数得: log M=log X0 (1+Ex)Ct (2) 整理方程式(2)得: log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M (3) log(1+Ex) *Ct= -log X0 + log M (4) Ct= -log X0 + log M (5) log(1+Ex)
qRT-PCR的定量分析方法
绝对定量分析方法 • 标准品拷贝数计算
标准曲线的绘制
未知样品的绝对定量
qRT-PCR的定量分析方法
相对定量分析方法 • 绝对定量通常在需要确定转录本绝对拷贝数的条件下使用，但在 有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对 基因表达差异即可。如X基因在经过某种处理后表达量是增加了 还是减少了，这时只需要用相对定量的方法就可以得到结果，而 不需要对标准品进行定量来确定浓度。由于系统误差的原因，不 同的样品很难获得相同量的RNA，这时就有必要引入管家基因来 对所有样品进行归一化处理(RNA 量校正)，然后再对不同样品之 间的目的基因表达量进行比较。
qRT-PCR的化学原理
• 三个概念
Ct值：C(Cycle)，t（threshold）表示每个 PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所 经历的循环数。研究表明，各模板的Ct值与 该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系， 起始拷贝数越多，Ct值越小。反之亦然。利 用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线， 其中横坐标代表起始拷贝数的对数。纵坐标 代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值， 即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝 数。
qRT-PCR的标记方法
特异性荧光标记 • Taqman探针法工作原理
每扩增一条DNA分子， 释放一个荧光信号， 可以在循环过程中任 一点检测荧光
qRT-PCR的标记方法
特异性荧光标记 • Taqman探针的设计原则
qRT-PCR的标记方法
特异性荧光标记 • Taqman探针法
• 优点
(1).极高的特异性和准确性：由于探针法除了引物序列的特异性之外，还有探 针序列的特异性，从两个方面保证了所 扩增基因的特异性。 (2).良好的重复性