实时荧光定量PCR原理
实时荧光定量PCR方法简介
实时荧光定量PCR方法简介一．实时荧光定量PCR的基本原理理论上，PCR过程是按照2n（n代表PCR循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。
但在实际的PCR反应过程中，随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增长进入平台期。
因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性.如采用常规的终点检测法（利用EB 染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量),即使起始模板量相同经PCR扩增、EB染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。
为了能准确判断样品中某基因转录产物（mRNA）的起始拷贝数，实时荧光定量PCR采用新的参数-—Ct值,定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。
Ct值是如何得到的在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行,定量PCR仪全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。
Ct值的定义Ct值中的“C”代表Cycle（循环）,“t”代表检测threshhold(阈值）,其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对应的横坐标。
Ct值与样品中模板的对应关系Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系(y=ax+b,x代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct值）。
与终点法相比利用Ct值的优势由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数,该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确,重复性也更好。
传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少,从而间接的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。
下图中是96个复孔的实时扩增曲线(完全相同的反应体系、相同的反应protocol、相同的样品起始浓度)，可以看到Ct值具有很好的重复性，而终点的荧光信号强度差异达到300个单位。
实时荧光定量PCR原理
实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
1. Ct 值的定义-- Ct值。
C代表Cycle，t代表（如图1所示）。
2. 荧光域值（threshold）的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 3-153. Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct越多，Ct贝数的对数，纵坐标代Ct值。
因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
4. 荧光化学荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。
现将其原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR 产物形成完全同步。
而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。
2）SYBR 荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
内标在传统定量中的意义1．几种传统定量PCR方法简介：1PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方PCR来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。
实时荧光定量pcr检测核酸的原理
实时荧光定量pcr检测核酸的原理实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR，RT-qPCR）是一种基于聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）的技术，能够快速、准确地定量检测核酸。
RT-qPCR的原理基于PCR的扩增和荧光信号的监测。
PCR是一种通过反复复制DNA片段的方法，它由DNA模板、引物和DNA聚合酶组成。
引物是专门设计的短链DNA片段，它们能够在目标DNA序列的两端精确结合并指导DNA聚合酶的复制。
PCR的循环包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，双链DNA被加热至94-98℃，使其解离成两条单链DNA。
在退火步骤中，引物与单链DNA特异性结合。
在延伸步骤中，DNA聚合酶沿着单链DNA模板合成新的DNA链。
每一个PCR循环会使目标DNA的数量翻倍，经过多个循环，目标DNA的数量会大幅增加。
RT-qPCR通过引入荧光探针实现对PCR扩增产物的实时检测。
荧光探针也是一种短链DNA片段，其中包含一个荧光染料和一个荧光信号抑制器。
荧光信号抑制器通过与荧光染料的近距离接触，抑制了荧光信号的发射。
当荧光探针与PCR扩增产物结合时，荧光信号抑制器与荧光染料分离，荧光信号得以释放。
通过荧光信号的增加可以判断PCR扩增产物的数量。
RT-qPCR的步骤包括样品处理、反转录、PCR扩增和荧光信号检测。
首先，需要从待检测样品中提取出核酸。
然后，通过反转录酶将RNA转录成cDNA，以便后续PCR扩增。
接下来，将引物、荧光探针和PCR反应液与样品一起加入PCR扩增管中。
PCR扩增过程中，荧光探针与PCR产物结合，并释放荧光信号。
PCR扩增和荧光信号检测是在同一反应管中进行的，所以可以实现实时监测。
最后，根据荧光信号的强度，可以计算出PCR扩增产物的初始数量。
RT-qPCR具有高灵敏度、高特异性和高准确性的特点。
它可以在短时间内检测到低浓度的核酸，并且能够区分不同的核酸序列。
实时荧光定量PCR技术原理
实时荧光定量PCR技术原理一、PCR反应：PCR反应是qPCR的关键步骤，它利用DNA聚合酶酶及其附加的DNA 引物扩增靶序列，产生大量特异性放大的DNA片段。
PCR的过程包括三个主要阶段：变性、退火和扩增。
1. 变性（Denaturation）：在94-96℃的高温下，DNA双链解旋为两条单链，使其变性成为模板。
2. 退火（Annealing）：将反应体温降至40-65℃， DNA引物与目标序列的互补部分结合，引物与模板序列的退火温度由其碱基组成决定。
3. 扩增（Extension）：将反应体温升至67-72℃，DNA聚合酶酶依托DNA引物的引导进行DNA链合成，合成一个新的DNA链。
PCR通过不断的循环变性、退火和扩增步骤，每一个循环的两倍增加靶序列的数量，从而迅速放大特定的DNA片段。
二、定量方法：实时荧光定量PCR具有准确、快速、高灵敏度和高特异性的特点，可以定量分析目标序列的初始数量。
qPCR主要通过引入荧光标记和检测体系监测PCR反应的进程，并根据监测到的荧光信号的强弱来确定目标序列的起始浓度。
常用的定量方法包括SYBR Green染料和探针法两种。
1. SYBR Green染料法：这是最常用的定量方法，它利用SYBR Green 染料与DNA结合发出荧光信号。
SYBR Green染料结合到PCR反应中的靶序列上，DNA双链解旋后，SYBR Green染料就可以与靶序列结合，并发出荧光信号。
荧光信号的增加与PCR反应进行的循环次数成正比，荧光信号的曲线由荧光分析仪实时记录，通过建立标准曲线或比较Ct值（Ct，Cycle Threshold，荧光阈值周期，即荧光信号超过背景噪音的最小反应周期数）来确定目标序列起始浓度。
2.探针法：探针法需要合成特异性的探针序列，包含荧光物质和有机磷酸盐类物质。
PCR反应中，探针与靶序列的互补部分结合，作为DNA聚合酶酶的模板，聚合酶在待测的DNA靶序列上进行链合成，荧光小分子物质与酶切开的探针结合发出荧光信号，荧光信号与目标序列的起始浓度成正比。
实时荧光定量PCR原理
实时荧光定量PCR原理1.PCR基本原理PCR通过在不断循环的体系中复制和放大特定DNA片段，从而实现DNA的快速扩增。
PCR反应通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，DNA的双链结构被解开，形成两条单链DNA。
在退火步骤中，引物与目标DNA的互补序列结合，形成引物-目标DNA结合复合物。
在延伸步骤中，DNA聚合酶通过追加互补碱基，并使用引物作为起始点，在目标DNA的基础上合成新的DNA链。
实时荧光PCR是对传统PCR技术的改进，它通过添加荧光探针（也称为探针引物）来实时监测PCR反应的进程。
荧光探针通常由两部分组成：一个荧光标记物和一个定向增效子。
在PCR反应的延伸步骤中，荧光探针与目标DNA的互补序列结合，并被PCR酶切割，导致荧光信号被释放。
3.原理图解实时荧光PCR通常需要使用一个双喷嘴热循环仪（Thermal Cycler），其中一个喷嘴用于控制样品的温度，另一个喷嘴用于实时监测PCR反应的进程。
具体的PCR反应流程如下：-备制PCR试剂：将PCR反应所需的试剂混合均匀，包括DNA模板、引物、荧光探针和内参物。
-生成PCR产物：通过一系列的循环反应，将DNA模板放大成大量的PCR产物。
-荧光信号监测：PCR反应过程中，荧光探针与PCR产物的结合会释放荧光信号。
实时荧光PCR系统通过探测和记录PCR反应体系中的荧光信号，并在每个循环结束时测定信号强度。
4.数据解读和PCR效率计算实时荧光PCR的结果通常以荧光信号的周期阈值（Ct值）表示，Ct值是荧光信号强度超过背景噪音的循环数。
Ct值越低，表示PCR产物浓度越高，反之亦然。
根据Ct值，可以计算PCR的效率。
效率（E）的计算公式为：E =10^(-1/slope) - 1，其中slope为荧光曲线的斜率。
效率越接近1，表示PCR反应越有效。
5.RT-qPCR的应用RT-qPCR可应用于多个领域，包括基因表达分析、病原体检测和药物开发等。
实时荧光定量PCR技术的原理及其应用
实时荧光定量PCR技术的原理及其应用引言实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种细胞遗传学和分子生物学研究中常用的分子检测技术。
它能够迅速、准确地进行DNA或RNA的定量测量，并在许多领域中广泛应用，例如基因表达分析、病原微生物检测和病毒定量等。
本文将重点介绍实时荧光定量PCR技术的原理和一些典型应用。
实时荧光定量PCR技术原理实时荧光定量PCR技术是在传统PCR反应的基础上发展而来的一种PCR变体。
其原理可以简单概括为光信号的实时检测和荧光强度的定量分析。
实时荧光定量PCR技术的具体步骤如下：1.引物与探针设计在实时荧光定量PCR反应中，合适的引物和探针设计是至关重要的。
引物用于在反应中特异性地扩增目标DNA或RNA序列，而探针则用于荧光信号的检测。
引物和探针的设计需要确保其与目标序列的亲和力和特异性，以避免非特异性扩增和假阳性结果。
2.标定曲线制备为了进行定量分析，需要事先制备一条标定曲线。
标定曲线通常是通过浓度已知的目标序列的一系列稀释样品制备的。
这些稀释样品经过PCR扩增后，荧光信号的强度与初始浓度呈线性关系。
通过测量待测样品的荧光信号强度，并利用标定曲线进行外推，可以获得目标DNA或RNA的定量结果。
3.PCR反应体系组装PCR反应体系的组装需要考虑到引物和探针的最优浓度，以及反应缓冲液、酶和模板DNA或RNA的最佳配比。
此外，反应体系中还需要加入辅助成分，如酶抑制剂和荧光染料，以提高PCR反应的特异性和灵敏度。
4.实时荧光检测及数据分析在PCR反应进行过程中，荧光信号会随着目标DNA或RNA的扩增而增强。
实时荧光定量PCR仪会实时监测和记录荧光信号的变化情况，并生成扩增曲线。
通过分析荧光信号的增长速度和荧光信号的峰值，可以确定目标DNA或RNA的起始浓度。
实时荧光定量PCR技术应用1. 基因表达分析实时荧光定量PCR技术在基因表达分析中被广泛应用。
实时荧光定量pcr的原理
实时荧光定量pcr的原理
实时荧光定量PCR是一种基于聚合酶链反应（PCR）的技术，用于测量DNA或RNA分子的数量。
它通过将荧光探针引入PCR反应混合物中，利用荧光信号的增加来定量PCR过程中
的DNA合成。
实时荧光定量PCR原理的核心是荧光探针的使用。
荧光探针
通常包含一个荧光染料和一个与其配对的探针序列。
在PCR
过程中，荧光探针与PCR引物一起在目标序列的特定位置结合，并被DNA聚合酶酶切为两个片段。
当荧光探针与目标序列结合时，荧光染料受到荧光共振能量转移的影响，导致荧光信号暗淡。
随着DNA合成的进行，DNA
聚合酶将到达荧光探针的剪切位点，荧光染料被释放并发出荧光信号。
实时荧光定量PCR设备配有一个光学检测系统，能够在PCR
反应混合物中的每一个循环中检测荧光信号的强度。
该系统测量荧光信号的增加，并将其转化为相应的荧光单位。
通过与标准曲线比较，可以确定在每个PCR循环中合成的
DNA量。
标准曲线是在已知浓度下制备的DNA模板的荧光强度与其相对DNA浓度之间的关系。
通过测量荧光信号的强度，并用标准曲线进行校正，可以得到PCR反应混合物中目标
DNA的初始数量。
因此，实时荧光定量PCR可以定量测量PCR反应中的DNA
合成，并提供高灵敏度和准确性的结果。
它广泛应用于分子生物学、遗传学、病原体检测等领域，成为许多实验室中常用的技术。
实时荧光定量PCR的原理
实时荧光定量PCR的原理1.PCR反应：2.荧光探针：实时荧光定量PCR通常使用两种类型的荧光探针来检测扩增过程：探针型Ta qMan探针和缺失型探针。
其中，探针型Ta qMan探针包含一个引物序列和一个标记荧光物。
在反应的延伸过程中，引物结合到目标序列上，同时荧光物会被系统特定的DNA聚合酶切断，从而释放出荧光信号。
缺失型探针则使用两个引物来结合目标序列的两个不同区域，其中一个引物上标记了荧光物，另一个引物上是荧光物对应的抑制剂。
当两个引物结合到目标序列上时，抑制剂阻止荧光物的释放，从而抑制荧光信号。
这两种探针的核心原理是通过荧光信号的释放或抑制来定量PCR扩增过程中的产物。
3.荧光信号检测：实时荧光定量PCR使用荧光实时检测系统检测PCR反应过程中的荧光信号。
常见的检测系统包括荧光比色法、熔解曲线分析法和荧光信号累积法等。
荧光比色法是将PCR反应体系加入一种荧光染料，其荧光信号随着PCR过程中产物的累积而增加。
熔解曲线分析法则通过逐渐升高温度，分析PCR产物的特征性熔解温度，从而确定PCR反应的特异性。
荧光信号累积法利用PCR反应产物与荧光探针的结合释放出的荧光信号的数量与产物量成正比的原理，定量PCR产物的数量。
4.数据分析：实时荧光定量PCR的数据分析通常使用阈值循环数（Ct）方法。
Ct值定义为PCR反应的循环数，PCR产物的荧光信号超过设定阈值的循环数。
Ct值越小，说明待测DNA的起始量越多。
通过建立标准曲线，将待测样品的Ct值与标准曲线对应的起始DNA量进行比较，从而计算出待测样品的目标DNA的起始量。
总体来说，实时荧光定量PCR通过引入荧光探针并使用荧光信号检测系统，实现对PCR反应中的产物进行实时定量。
其原理简单可靠，广泛应用于基因表达、突变检测、病毒定量等领域，是分子生物学研究中不可或缺的工具之一。
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实时荧光定量PCR原理
所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
1. Ct 值的定义
在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念-- Ct值。
C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。
2. 荧光域值（threshold）的设定
PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 3-15
3. Ct值与起始模板的关系
研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。
因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
4. 荧光化学
荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。
现将其原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。
2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
内标在传统定量中的意义
1．几种传统定量PCR方法简介：
1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。
上游引物用荧光标记，下游引物不标记。
在模板扩增的同时，内标也被扩增。
在PCR 产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。
2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。
在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。
扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。
3）PCR－ELISA法：利
用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。
常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。
2．内标在传统定量中的作用
由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。
同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异（见图4），因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。
加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。
但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。
内标对荧光定量PCR的影响
1．实时荧光定量PCR无需内标
实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。
因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct 值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。
2．内标对实时荧光定量PCR的影响
若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。
但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。
也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。
美国Texas大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比较，得出的结论是：内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方。
Applied Biosystems公司的7700型实时荧光定量PCR仪是全球公认的荧光定量PCR的金标准，可实现多色荧光同时检测，但定量检测仍然采用外标准曲线的方法，而不用内标进行定量。
综上所述，利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。
荧光PCR是分子诊断的热点技术，它将先进的定量PCR与实时PCR技术相结合，西安天隆生产的国产实时荧光定量PCR仪为肝炎艾滋病等重大疾病的定量核酸检测及分子诊断、同时也为沙门氏菌阪崎氏肠杆菌等食品安全检测提供了先进手段。
即使在发达国家，荧光定量PCR仪和基因扩增仪都被广泛用于临床及生物学、医学研究。
由于其极高的灵敏度、极宽的检测范围，以及精确定量、方便快速、无窗口期等优点，美国FDA及我国国家标准已将定量PCR仪规定为确诊禽流感等传染病以及奶粉等食品安全检测的必备仪器。
实时荧光定量PCR仪（real-time qPCR）的发明实现了荣获诺贝尔化学奖的PCR核酸检测、分子诊断的技术飞跃。