细菌总数的测定
细菌总数的测定
细菌总数的测定一、准备工作1.准备好培养基（一般为普通营养琼脂培养基），称取28克培养基粉末，放入1000ml锥形瓶中，量取800ml蒸馏水倒入，放入搅拌子在搅拌器上，将溶液搅拌均匀后，再取出搅拌子（用铁棒吸出），然后用报纸包扎锥形瓶口，待灭菌。
2.取洗净干燥的培养皿，根据水样准备培养皿数，一般原水样稀释三个倍数，处理后水样稀释两个倍数，每个做两个平行样。
每十个培养皿一组，用报纸包扎好待灭菌。
3.移液枪头的灭菌：洗干净后放入盒中排列整齐，盖上盒盖，在盒子外面包一层报纸，再用橡皮筋扎紧，待灭菌。
4.小试管：每次用完都要将小试管刷洗干净，洗净后倒放在试管架上备用，如当天需要做细菌实验则将所需数量的每根试管内各加入9ml蒸馏水，赛上橡皮塞，7支一捆用报纸将试管口扎好，待灭菌。
5.250ml采样瓶及锥形瓶（加有适量玻璃珠）需提前灭菌，方便采样人员随时取用，灭菌好的采样瓶可保存一周，灭菌时每个瓶口都要用报纸包扎好。
6.标签纸准备：事先将所需的数量准备好，写上编号，以备操作时取用。
二、灭菌1.高压蒸汽锅的使用：灭菌前应先检查国锅内水位，应保持在水位标示处，过多过少都不好，放入准备步骤中待灭菌的物品，盖上小盖，然后再盖外盖，对正后对角旋好各个旋钮，使其受力均匀不至于在灭菌的过程中跑气（压力上不去即为跑气），然后关上安全阀打开放气阀，打开高压蒸汽锅开关，调好灭菌时间（一般灭菌30min），待放气阀放气声很大后关上放气阀，蒸气锅即开始依据设计的时间灭菌，此时压力表指针在1.5左右，灭菌完毕后，关上开关，待压力表指针在0处，打开安全阀放气后，才能开盖。
蒸气锅底部水若变脏则需清洗并换水。
2.细菌实验所需玻璃器皿一般需要灭菌30min。
3.净化工作台的使用：先用75%酒精灯擦拭台面，紫外灯和照明灯隔一段时间擦拭一下，并用软布擦拭干净，然后关上门，打开紫外灯按钮，照明消毒30min后再打开送风按钮，一直到实验前才关闭紫外灯，打开照明灯。
细菌总数测定操作规程
细菌总数检测操作规程1 原理试样经过处理，稀释至适当浓度，在一定条件（如使用特定的培养基，在温度30℃±1℃培养72h±3h等）下培养后，所得1g（mL）试样中所含细菌总数。
2 试剂与仪器2.1 所用器具三角烧瓶、玻璃珠、具塞试管、培养皿、1000μL枪头、5mL枪头、称量勺、接种环、接种针、移液器2.2 仪器：分析天平、恒温培养箱、微型振荡器、超净工作台、高压灭菌锅2.3 所用试剂和培养基营养琼脂取营养琼脂32.0g，加入蒸馏水1L，搅拌加热至完全溶解，分装三角瓶，121℃高压灭菌15min，备用。
3、操作步骤3.1配制0.85%生理盐水。
称取氯化钠8.5g溶于1000mL蒸馏水中。
3.2三角烧瓶加入生理盐水90mL和玻璃珠，试管中加入生理盐水9mL，121℃灭菌30min。
（三角烧瓶个数与样品数量一致，试管数量与稀释次数相关）3.3将1000μL枪头、培养皿、5mL枪头、称量勺，121℃灭菌30min。
（注意计算数量）3.4将枪头、培养皿置于烘箱103℃烘干。
（1-3步需提前一天完成）3.5对称量房间进行紫外灭菌30分钟，关灯静置60 min。
以无菌操作取样品10g于含90mL 生理盐水三角烧瓶中，于振荡器上振荡30min，制成1:10的均匀稀释液。
3.6用1000μL枪头吸取1:10稀释液1mL，沿管壁慢慢注入含有灭菌生理盐水9mL的试管中，于振荡器上混合均匀，制成1:100的均匀稀释液。
3.7另去一只1mL灭菌吸管，按照上述操作方法，作10倍递增稀释，如此每递增稀释一次，即更换一支灭菌吸头。
3.8选择2个~3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个培养皿。
3.9稀释液移入培养皿后，及时将凉至46℃±1℃的培养基（可放置46℃±1℃水浴锅内保温）注入培养皿约15mL，小心转动培养皿使试样与培养基充分混匀（从稀释试样到倾注培.养时间不能超过30min）。
水环境卫生细菌学检测—细菌菌落总数的测定
2.2 平板涂布法
先制作平板；
取样品（无菌水）0பைடு நூலகம்1ml放入平板 上，涂抹棒均匀涂抹平板表面，直至 无残存样品（无菌水）；
翻转放置。
平板涂布
2. 3注意事项
保证无菌操作要求，同时注意不得影响样品中的微生物（培养基不得 太烫，取样时不要离火焰太近）；
制作平板时培养基不得沾附底面之外的侧面甚至盖上，未凝固前不得 翻转；
混匀器
四、接种培养
1.培养数量
不稀释样：样品、无菌水（无菌对照），共2 个培养，每个培养需培养3个平板（重复）；
需稀释样：最大稀释样及前两个稀释样、无 菌水，共4个培养，每个培养需培养3个平板 （重复）；
预先在培养皿底面标记清楚培养稀释度、操 作人、时间等信息。
培养皿标记
2. 接种平板
2.1 混合平板法
三、样品的稀释
主要针对样品中含较多微生物的水样（水源水、污水）；
自来水、饮用水一般不需稀释，可直接取样培养。
1. 分装无菌水 取数支无菌试管，标记10－1、10－2、……,每试管分装9ml无菌水 或无菌生理盐水。 （也可分装好后再灭菌）
稀释所需的数量级根据样品中微生物量的估计而定，一般轻度 污染水稀释到10－3，重度污染水可稀释到10－5、10－6。
对于不利于细菌生长的污染物，常需检测对应专门微生物及污染 物含量的直接检测。
二、稀释平板培养计数法
细菌的个体微小，直接观察、计数困难； 单个细菌经过培养可长成肉眼可见的菌落； 要设法避免多个细菌长成1个菌落，常需对 样品进行稀释处理。
稀释平板培养菌落
1.测定的程序：
样品稀释 接种平板 培养 菌落计数 报告
不同稀释度不得使用同一移液管，防止交叉影响及污染；
细菌总数的测定方法
细菌总数的测定方法
细菌总数的测定方法可真是太重要啦！它能让我们清楚地了解环境或样本中细菌的数量情况。
那具体是怎么操作的呢？首先要准备好培养基，比如常用的营养琼脂培养基。
然后就是采样啦，这可不能马虎，一定要保证采样的代表性和准确性。
接下来把样品进行适当稀释，这一步要细心哦，不然可就不准确啦！再把稀释后的样品接种到培养基上，要均匀分布哟！最后就是培养啦，在适宜的温度下培养一段时间。
这里要注意的是，操作过程一定要严格无菌，避免污染，不然结果就不准确咯！而且稀释度的选择也很关键呢，要根据实际情况合理选择。
在这个过程中，安全性那是相当重要的呀！毕竟是和细菌打交道嘛。
所有的操作都要在无菌环境下进行，保证操作人员不会受到细菌的侵害。
稳定性也不容忽视呢，只有保证每次操作的一致性，才能得到可靠的结果呀。
那细菌总数的测定方法都有哪些应用场景和优势呢？哇塞，那可多了去啦！在食品行业，可以检测食品的卫生状况，保障我们的食品安全，这难道不是超级重要的吗？在医疗卫生领域，可以监测环境的细菌污染情况，为疾病防控提供依据呢。
它的优势就在于简单易行、成本较低，而且能快速得到结果呀。
就拿食品生产企业来说吧，通过定期检测生产环境中的细菌总数，可以及时发现问题，采取措施改进生产工艺和卫生条件，从而避免食品安全问题的发生。
这不是实实在在的效果吗？
细菌总数的测定方法真的是非常实用且重要的呀！它能帮助我们更好地了解和控制细菌的存在，保障我们的生活和健康呢！。
细菌总数名词解释
细菌总数名词解释细菌总数，又称菌数，是指一个立方体内所含的细菌的总数。
细菌总数的计算方法为：以样本中所含菌数占总样本菌数的百分率表示，如每克干固体标本或每毫升液体标本中所含的菌数，即为细菌总数。
细菌总数常用每克（或毫升）干固体标本或每毫升（或毫升）液体标本中所含的细菌菌落数来表示，它表示某一个地区、某一环境中所有存在于固体或液体培养基上的细菌菌落总数。
同时细菌总数也可作为细菌学研究、细菌污染及医疗事业防疫措施的依据之一。
细菌总数测定仪器主要有光密度计和光计数管。
前者的读数原理为折射原理，后者的读数原理为散射原理。
在大多数情况下，当需要估计菌数总量时，可采用光密度计；如果需要测定浓度范围很宽的标本中的细菌菌数总量，则可采用光计数管。
但是在液体培养基中进行测定时，只能使用光密度计。
测定细菌总数的光密度计按结构特点又可分为自然光密度计和荧光显微镜两种。
光密度计有一套检测系统和计数系统。
它们一起保证了读数的准确性。
在使用光密度计测定细菌总数时，需对标本稀释成不同的稀释度，然后以一定的稀释度从标本中吸取适量的菌悬液，装入反应管内，加满冷凝管，使之与空气隔绝，在显微镜下进行计数。
由于菌悬液中各细菌的分布状态不一致，有些细菌密集在上层，而有些细菌则沉降到底部。
因此在使用光密度计测定总菌数时，应同时取几管混匀，以便观察。
在正常情况下，菌悬液经10— 20分钟就会被均匀分散开，这时可看到红色视野中出现许多白色小圆圈，或看到红色视野里有细小的圆形光亮区。
随着细菌总数的增加，红色视野中小圆圈的直径逐渐变小，红色视野逐渐缩小。
当菌数达到一定数量时，圆圈消失，变成无数小亮点，最后细胞集结成云雾状或团块状。
1、数值测定法用肉眼、光镜或低倍镜观察标本，计算在一定体积或重量的细菌菌体所占的百分比。
2、化学测定法用化学药品、酶制剂处理标本，通过颜色反应和显色反应来计数细菌菌体，有关细菌数量的计数单位还有个细胞，活菌数，活菌个数等。
细菌总数的测定
相连，南部及西南部与老挝、越南和缅甸唇齿相依；
• 多民族省区；云南有25个少数民族、贵州有17个、广西有 11个，民族文化绚丽多姿“三里不同风，五里不同谷，大
节三六九，小节天天有” 。
二、西南区的旅游环境特征
岩溶旅游资源/民俗文化旅游资源得天独厚； 地形复杂多样，地文景观丰富多彩； 热带、亚热带季风气候孕育了繁茂的森林景
观；
二、西南区的旅游环境特征
现代文明与传统文化交相辉映的城市风光； 南北兼容、中西合璧的文化； 旅游配套服务完善，旅游资源以自然与人造景观最富特色。
三、岩溶旅游资源
岩溶旅游资源的概念
旅游需求市场较大； 旅游资源分布不平均，云南多民族、广西具有滨海资
源、贵州多瀑布；
三、岩溶旅游资源
• 岩溶旅游资源的价值
– 美学观赏价值 – 科学考察价值 – 生态环境价值 – 文化传承价值
四、民俗文化文化旅游资源
– 民俗文化文化概念：是指民间民众的风俗生活 文化的统称。也泛指一个主题、民族、地区中 集居的民众所创造、共享、传承的风俗生活习 惯。它具有普遍性和传承性和变异性。
1mL
9mL稀释液 1：100
1mL
9mL稀释液 1：1000
1mL
每个稀释度
做两个平皿
1mL
1mL
1mL
1mL
倾注平皿
将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿 约15ml，并转动平皿，混合均匀。
6、培养及计数
培养条件：倒置于36±1℃温箱内培养48±2h
计数时间：到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放 置于0－4℃，但不得超过24h。
细菌总数的检验方法
细菌总数的检验方法1 试验器材: 样品、无菌水、制备好的营养琼脂培养基200 ml 装于三角瓶、装有三、四十粒玻璃珠的三角瓶一个、平板数套、1 ml 吸管、计数器、试管。
2. 试验步骤:2.1 在无菌条件下取样品10ml。
2.2 用1 ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1ml ，置于9 ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀成1:100稀释液。
2.3 另取1 ml灭菌吸管吸，按上述操作顺序作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1ml 灭菌吸管。
2.4 根据对样品的污染程度选择2到3个适宜的稀释度分别在作10倍递增稀释液的同时,即以吸取该稀释度的吸管,吸取1ml 稀释液，置于灭菌平板内，每个稀释度作2个平板。
2.5 稀释液移入平板后，立即将冷却至45°C的营养琼脂基约15 ml倾入平板中,并转动平板使混合均匀。
2.6待琼脂凝固后翻转平板,置于37°C 恒温培养箱内培养24小时或48小时，计算平板内菌落数目，将细菌菌落乘以稀释倍数，即得每毫升样品中所含菌落总数。
3 菌落计数方法:3.1 平板内菌落计数时，可用肉眼观察,必要时用放大镜。
3.2 在记下各菌落数后，求出同稀释度的各平板的平均数。
4 菌落计数的报告4.1平板菌落数的选择:选取菌落数在30到300之间的平板作为菌落数测定标准。
一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板内的菌落平均数。
其中一个平板有较大片状菌落生长时。
不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数。
若片状菌落不到平板的一半，而其余部分又很均匀,则可计算半个平板后乘以2以代表全平板的菌落数。
4.2 稀释度的选择4.2.1 应选择平均菌落数在30到300之间的稀释度，乘以稀释倍数来报告它。
4.2.2 若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30到300之间，应视二者之比如何来决定，若其比值小于2，应报告其平均数。
若大于2，则报告其中较小的数字。
介绍几种新的水中细菌总数检测方法
介绍几种新的水中细菌总数检测方法
1.流式细胞术：利用流式细胞仪将水样中的细菌进行分析和计数。
这种方法可以快速、高效地获取大量细菌数据，并且还可以进行不同种类细菌的分类和分析。
2. 基于荧光的检测方法：这种方法利用细菌表面的荧光素来进
行检测。
通过添加特定的荧光素探针，可以在短时间内快速、准确地测量水中细菌总数。
3. 基于DNA技术的检测方法：这种方法通过提取水样中的DNA，利用聚合酶链式反应(PCR)等技术来进行检测。
这种方法可以检测到
非常微小的细菌数量，而且还可以进行不同种类细菌的分子生物学鉴定。
4. 浸润法：这种方法是将一定量的水样浸润在适宜生长条件下
的培养基上，然后通过培养基上产生的菌落来计算水中细菌总数。
这种方法具有简单、易操作等特点，但是需要较长时间的培养过程。
5. QPCR技术：这种方法是一种快速、灵敏的检测细菌数量的方法，它利用荧光探针来放大和检测DNA序列。
这种方法可以在数小时内完成检测，而且可以检测不同种类的细菌。
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细菌总数的测定
水与人类的生产活动和日常生活息息相关。
经济建设的高速发展，往往会使生活用水的水源水受到水中有害有毒物质的污染；而生活污水、人、畜粪便会使甚或用水的水源水受到腐生性微生物的污染。
被污染的水都不宜饮用。
当水体中含大量的病原问生物是往往会引起传染病的发生，人体和动物体的肠道中大约有400多种细菌，虽然，其中的腐生菌进入水体不会引发人类的疾病，但随着粪便一起排除的致病菌，如霍乱弧菌、伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、阿米巴虫、脊髓灰质炎病毒和传染性感染病毒等致病性微生物，则会引发人体的肠道传染病。
为保护人体健康，防止因水源水污染而造成的疾病发生和流行，必须对生活用水及其水源水进行严格的水中细菌学检查。
测定水样是否合乎引用标准，一般包括：水中细菌总数测定和大肠菌群测定。
本实验以自来水和天然水为水样进行细菌总数的测定
一、实验目的
（1）学习水样的采取和水样中细菌总数测定的方法
（2）了解和掌握平板菌落计数的原则
二、试验原理
水中的细菌数可反映出水体被有机物污染的程度。
细菌总数越多，说明水中有机物的含量就越高，本试验应用平板菌落计数来测定水样中的细菌总数。
由于水中细菌的种属不一，它们对营养成分和生长条件的要求差别很大，不可能设计出一种培养基在同一固定的条件下，能满足水中所有细菌的营养要求使其都能生长繁殖，形成菌落。
然而，肠道中的绝大多数腐生性和致病性的细菌，可在营养丰富的牛肉膏蛋白胨培养基上进行生长，出现肉眼可见的菌落，虽然这样设计出来的水中细菌的总数实际上是一种近似值，但它基本上能代表水样中细菌的数量。
故而水中的细菌总数的测定和计算是指：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，1ml水样，经37℃，24h培养后所生出来的总菌数（包括腐生和致病细菌），我国饮用水的
卫生学指标规定：在1ml自来水中细菌总数不得超过100个（1×102）。
三、试验材料和用具
（1）培养基牛肉膏蛋白胨琼脂培养基
（2）用具灭菌三角烧杯（体积为50ml或100ml），具玻塞的试剂瓶（体
积为250ml，需灭菌），灭菌培养基（Ф=9cm ），灭菌吸管或灭菌的
塑料吸嘴，稀释水样用无菌水（在Ф16mm×160mm试管中加9ml
蒸馏水，灭菌），酒精
四、试验方法
（1）以无菌操作、用10倍稀释法稀释水样。
（2）用平皿倾注制备待测水样平皿。
五、实验内容
1、水样的采取
（1）自来水先将自来水龙头用火焰（酒精灯火用长柄镊子夹酒精棉球）灼烧2-3min灭菌，再开启水龙头水水流出5min。
以灭菌三角烧杯接取水样，待测（为节约用水，自来水龙头一次灭菌后，试验者依次采取水样）。
（2）池塘水、河水或湖水应取距水面10-15cm的深层水样。
先将已灭菌具玻
璃的试剂瓶，瓶口向下浸入水中，在水中翻转式瓶口向上，开启瓶塞，待水盛满后，在水中将瓶塞盖好，再取出水面。
取样后应立即进行试验。
如不能马上进行试验，应于4℃冰箱保存。
2、细菌总数测定
（1）自来水（以下操作均需用无菌操作法进行）
○1用灭菌吸管或微量家养器吸取1ml水样，注入灭菌培养中，共做2个平皿。
○2分别向平皿中倾注15-20ml熔化并冷却到45℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，制成平板，并立即轻轻摇匀（切忌溅到皿盖上），使水样于培养基充分混合。
○3取另一平皿，只加培养基，不加水样，作为空白对照平板。
○4待培养基充分凝固后，倒置于37℃温箱内，培养24h，进行菌落计数。
○52个平板的平均菌落数即为1ml水样的细菌总数。
（2）池塘水、河水或湖水
○1水样稀释。
取1ml水样水加入到第一支装有9nl无菌水的试管中，振荡均匀，水样被稀释10倍，稀释度为10-1，再从此管中吸取1ml稀释水样介入到第二支装有9ml无菌水的试管中，振荡均匀，水样被稀释100倍，稀释度
为10-2，如此稀释则水样被稀释1000倍，10000倍……稀释度分别为10-3、10-4、……。
稀释倍数视水样污浊程度而定，中度污浊水样可稀释到10-3~10-4，中度污浊水样可稀释到10-4~10-5。
○2吸取稀释后水样
方法1：用无菌吸管或微量加以昂起分别从低稀释度向高稀释度吸取1ml水
样，即10-1（1ml）→10-2（1ml）→10-3（1ml），每一稀释度需用一支无菌吸
管或塑料吸嘴，不可用同一吸管连续吸取，不然，培养后出现的菌落数偏高，误差大。
方法2：用同一无菌吸管或微量加样器，可从高浓度向低浓度连续吸取1ml
水样，即10-3（1ml）→10-2（1ml）→10-1（1ml），由于高稀释度10-3比10-2
的菌数少，用同一吸管逐次连续吸取1ml，培养后的菌落数，偏差不大，此法快速，简便。
○3向每一个加油不同稀释度水样的平皿内，倾注15-20ml培养基，混匀，每个稀释度做2皿，计数时取2个拼版菌落数的平均数，作为该稀释度的菌落数。
另作不加水样平板为空白对照。
○437℃温箱，倒置培养24h，进行菌落计数。
3、菌落计数方法
（1）计算相同稀释度的平均菌落数细菌的菌体是微小的颗粒，在水中呈悬浮状态而不像可溶性化学药品在水中均匀分布呈真溶液。
由于细菌在水中分布不均一，故取时1ml菌悬液中菌数的随机性很大，在加上水样与培养基的混合不够充分，有是培养后平板中长出的菌落不单一，成片状菌苔，故部分成片状。
技术是，若其中一个平板有较大片状菌苔生长时，弃之，不采用。
取另一无片状菌苔的平板菌落数作为该稀释度的平均菌落数。
若片状菌苔仅占整个平板的1/2，而其余的菌落分布十分均匀，则可将菌落数乘以2代表
全平板的菌落数，然后，再按下述原则机端该稀释度的平均菌落数。
（2）首先选择平均菌落数在30-300之间稀释度的平板，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘以稀释倍数，作为该水样的细菌总数进行报告。
如表一中例次1，10-2,稀释度平板的平均菌落数为164，而10-2为1365，10-3为20，均不在30-300范围内，故取10-2 稀释度164个菌落数为平均菌落数，以16400或1.6×10-4个/ml作为该水样的细菌总数。
（3）若有两个稀释度的平均菌落数均在30-300之间，则按两个稀释度菌落总数的比值来决定取数。
如比值小于2，应取两者的平均值，乘以稀释倍数进行报告，如表1中例次2，10-2,稀释度的平均菌落数为295，10-3为46，两者均在30-300的范围内，而菌落数比值为1.6（10-3为46，换算成10-2为
460，10-2为295，则460÷295=1.55≈1.6），取量稀释度菌落数的平均值为
37750（29500+46000）÷2=37750，以37750或3.8×104个/ml作为该水样的细菌总数。
同法计算，表1中例次3的菌落数的值大于2，则取其较小的细菌总数271（10-2）进行报告。
（4）若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的品均菌落数乘以稀释倍数进行，见表1中的例次4。
（5）若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释配属进行报告。
见表1中的例次5.
（6）若所有稀释度的平均菌落数均均不在30-300之间，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数进行报告，见下表中例次6。
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基
牛肉膏0.3-0.5g 琼脂 2.0g
蛋白胨 1.0g 蒸馏水100ml
氯化钠0.5g
pH 7.2-7.4 ，0.1MPa压力，你20-30min。
配制液体培养基时不加琼脂；半固体培养基加0.3%-0.5%琼脂。
该培养基。