HAT培养基筛选杂交瘤细胞的原理
HAT培养基
HAT培养基
英文名称：HAT medium
定义：
用于筛选具有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)或胸苷激酶(TK)活性缺陷细胞的培养基。
是含有次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)、胸苷(T)和甘氨酸的完全培养基。
在氨基蝶呤(二氢叶酸类似物)存在下，这种酶缺陷的细胞不能通过核苷酸合成旁路合成次黄嘌呤和胸苷。
HPRT和TK缺陷细胞可以在此培养基中生存。
是常用的骨髓杂交瘤细胞选择性培养基。
缺失这两种酶的细胞，在HAT培养基中，应该不能生存，只有发生融合或者其他情况下，才能是细胞重新获得用旁路途径进行DNA合成能力。
二、
HAT培养基也就是指含有这三种物质的细胞培养基。
对￡具有合成DNA原料的核苷酸的形成上，在细胞内具有起始合成途径（denovopathway）和中间合成途径（salvagepa-th■way）。
中间合成途径包括：通过HGPRT的催化作用把次黄嘌呤转化成次黄嘌呤核苷－磷酸(IMP)，通过TK的催化把胸腺嘧啶核苷转化成脱氧胸腺嘧啶核苷－磷酸(dTMP)，再进一步合成核酸。
由于氨基蝶呤可阻碍起始合成途径，所以培养基中含有它时，细胞便只有中间合成途径，所以必须供给核苷酸。
至于缺失中间合成途径的细胞，可失去增殖能力臻于死亡。
根据这一点，不仅把混存于细胞群中的正常细胞，通过试管内培养进行选择，例如嘌呤的中间合成途径缺失株和嘧啶的中间合成途径缺失株，由于可以互补，所以两者的杂种细胞，即使在氨基蝶呤的存在条件下也可以增殖。
在这种情况下，利用HAT培养基可对杂种细胞进行选择。
次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷可作为中间合成途径的原料而进行添加。
抗体的制备方法与原理
抗体的制备方法与原理－单克隆抗体的制备1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。
免疫细胞化学的技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体，由于每种抗原都有几个抗原决定簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。
单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。
单克隆抗体（McAb）的特性和常规血清抗体的特性比较见2-3。
表2—3 单克隆抗体（McAb）和常规免疫血清抗体的特性比较单克隆抗体的制备方法如下。
（一）动物的选择与免疫1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。
目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。
2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。
一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。
常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。
初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）↓3周后第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）↓2～3周加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。
临床免疫学检验名词解释重要知识点上
抗原抗体反应：是指抗原与相应抗体在体内或体外发生的特异性结合反应。
抗原抗体间的结合力涉及静电引力、范德华力、氢键和疏水作用力，其中疏水作用力最强，它是在水溶液中两个疏水基团相互接触，由于对水分子的排斥而趋向聚集的力。
亲和性（affinity）：是指抗体分子上一个抗原结合点与一个相应抗原表位（AD）之间的结合强度，取决于两者空间结构的互补程度。
亲合力（avidity）：是指一个完整抗体分子的抗原结合部位与若干相应抗原表位之间的结合强度，它与亲和性、抗体的结合价、抗原的有效AD数目有关。
抗原抗体反应的特点：特异性、可逆性、比例性、阶段性。
带现象（zone phenomenon）：一种抗原-抗体反应的现象。
在凝集反应或沉淀反应中，由于抗体过剩或抗原过剩，抗原与抗体结合但不能形成大的复合物，从而不出现肉眼可见的反应现象。
抗体过量称为前带，抗原过量称为后带。
免疫原（immunogen）：是指能诱导机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原。
免疫佐剂（immuno adjustvant）：简称佐剂，是指某些预先或与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的物质。
半抗原（hapten）：又称不完全抗原，是指仅具有与抗体结合的能力(抗原性)，而单独不能诱导抗体产生（无免疫原性）的物质。
当半抗原与蛋白质载体结合后即可成为完全抗原。
载体（carrier）：结合后能给予半抗原以免疫原性的物质。
载体效应：初次免疫与再次免疫时，只有使半抗原结合在同一载体上，才能使机体产生对半抗原的免疫应答，该现象称为~。
单克隆抗体（McAB）：将单个B细胞分离出来，加以增殖形成一个克隆群落，该B细胞克隆产生的针对单一表位、结构相同、功能均一的抗体，即~。
多克隆抗体（PcAb）：天然抗原分子中常含多种不同抗原特异性的抗原表位，以该抗原物质刺激机体免疫系统，体内多个B细胞克隆被激活，产生含有针对不同抗原表位的免疫球蛋白，即~基因工程抗体（GEAb）：是利用DNA重组及蛋白工程技术，从基因水平对编码抗体的基因进行改造和装配，经导入适当的受体细胞后重新表达的抗体。
hat选择培养基筛选杂交瘤细胞的原理
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杂交瘤细胞筛选实验报告
一、实验目的本实验旨在通过细胞融合技术，获得具有无限增殖能力和特异性抗体分泌能力的杂交瘤细胞。
通过筛选和克隆化，最终获得纯化的单克隆抗体。
二、实验原理杂交瘤细胞筛选技术是利用细胞融合技术，将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌某种抗体的淋巴细胞融合，形成杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞具有肿瘤细胞无限增殖的特性，同时保留淋巴细胞分泌特异性抗体的能力。
通过筛选和克隆化，获得纯化的单克隆抗体。
三、实验材料1. 试剂：聚乙二醇（PEG）、HAT培养基、抗原、酶联免疫吸附剂（ELISA）、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠lgG抗体、包被液、脱脂奶粉、洗涤液、底物显色液、终止液等。
2. 仪器：倒置显微镜、细胞培养箱、超净工作台、冰箱、酶标仪、微量移液器、恒温箱、96孔板等。
3. 实验动物：小鼠。
四、实验步骤1. 细胞融合：将骨髓瘤细胞和分泌某种抗体的淋巴细胞按照一定比例混合，加入PEG诱导细胞融合。
2. 细胞培养：将融合后的细胞接种于含有HAT培养基的培养瓶中，在细胞培养箱中培养。
3. 细胞筛选：经过1-2周的培养，筛选出能够存活并无限增殖的杂交瘤细胞。
4. 特异性抗体筛选：采用ELISA方法，将抗原固相在微孔板上，将杂交瘤细胞培养上清加入微孔板中，检测抗体与抗原的结合情况。
5. 克隆化：将筛选出的阳性杂交瘤细胞进行克隆化，确保获得纯化的单克隆抗体。
6. 阳性杂交瘤细胞筛选：利用间接ELISA方法，检测克隆化后的杂交瘤细胞是否产生特异性抗体。
五、实验结果1. 细胞融合：成功将骨髓瘤细胞和分泌某种抗体的淋巴细胞融合。
2. 细胞培养：在HAT培养基中，杂交瘤细胞能够存活并无限增殖。
3. 细胞筛选：经过筛选，获得能够存活并无限增殖的杂交瘤细胞。
4. 特异性抗体筛选：ELISA结果显示，部分杂交瘤细胞能够产生特异性抗体。
5. 克隆化：对筛选出的阳性杂交瘤细胞进行克隆化，获得纯化的单克隆抗体。
6. 阳性杂交瘤细胞筛选：间接ELISA结果显示，克隆化后的杂交瘤细胞均能产生特异性抗体。
杂交瘤法制备单克隆抗体的过程
杂交瘤法制备单克隆抗体的过程引言：单克隆抗体在生物医学研究和临床应用中起着重要作用。
其中，杂交瘤法是制备单克隆抗体的一种常用方法。
本文将详细介绍杂交瘤法制备单克隆抗体的过程。
1. 选择免疫原制备单克隆抗体的第一步是选择合适的免疫原。
免疫原可以是蛋白质、多肽、糖蛋白或其他生物大分子。
选择免疫原时需要考虑其抗原性、纯度和稳定性。
2. 免疫动物免疫将选择好的免疫原注射到小鼠等免疫动物体内，激发其免疫系统产生抗体。
免疫过程中需要进行多次免疫，以增加抗体的产生。
通常，第一次免疫后，需要在一定时间间隔内进行多次增强免疫，以提高抗体的效价。
3. 细胞融合免疫动物产生的抗体是多克隆抗体，其中含有多种抗体细胞。
为了制备单克隆抗体，需要将这些抗体细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。
4. 杂交瘤细胞筛选杂交瘤细胞的筛选是制备单克隆抗体的关键步骤。
一般采用HAT （杂交瘤培养液，含有一种离子交换剂、一种抗代谢药物和一种抗生素）培养基进行筛选。
由于骨髓瘤细胞具有无限生长的能力，而免疫细胞不具备，因此只有杂交瘤细胞能在HAT培养基中存活和繁殖。
5. 单克隆抗体鉴定通过ELISA（酶联免疫吸附测定）或其他方法，对杂交瘤细胞进行单克隆抗体的鉴定。
常用的方法包括Western blotting、免疫组化和流式细胞术等。
鉴定合格的单克隆抗体可以进行进一步的扩增和纯化。
6. 单克隆抗体扩增通过体外培养，将单克隆抗体扩增至足够的量。
扩增过程中需要对培养条件进行优化，以提高抗体的产量和纯度。
7. 单克隆抗体纯化通过柱层析、亲和层析、离子交换层析等方法，对扩增后的单克隆抗体进行纯化。
这些方法能够去除杂质，提高抗体的纯度和活性。
8. 单克隆抗体应用纯化后的单克隆抗体可以应用于生物医学研究和临床治疗中。
其应用包括免疫组织化学、免疫荧光、免疫沉淀、免疫电泳等多个方面。
结论：杂交瘤法是制备单克隆抗体的重要方法之一。
通过选择免疫原、免疫动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞筛选、单克隆抗体鉴定、扩增和纯化等步骤，可以制备出高纯度和高活性的单克隆抗体。
安徽省合肥市肥东县第二中学2023年高考适应性考试生物试卷含解析
2023年高考生物模拟试卷注意事项：1．答卷前，考生务必将自己的姓名、准考证号填写在答题卡上。
2．回答选择题时，选出每小题答案后，用铅笔把答题卡上对应题目的答案标号涂黑，如需改动，用橡皮擦干净后，再选涂其它答案标号。
回答非选择题时，将答案写在答题卡上，写在本试卷上无效。
3．考试结束后，将本试卷和答题卡一并交回。
一、选择题(本大题共7小题,每小题6分,共42分。
)1．下列关于植物的克隆技术的叙述，错误的是（）A．高度成熟和分化的植物细胞，仍保持了恢复到分生状态的能力B．由于遗传性的差异，不同种类植物细胞全能性的表达程度不相同C．适当配比的营养物质和生长调节剂可诱导愈伤组织的形成D．二倍体植物的花粉培养得到单倍体的过程属于器官培养2．下列关于细胞的结构与功能的相关叙述中，正确的是（）A．人成熟红细胞无线粒体，其有氧呼吸场所是细胞质基质B．植物细胞叶绿体产生的ATP能用于生长、物质运输等生理过程C．核糖体是蛋白质的“装配机器”，由蛋白质和RNA组成D．根尖分生区细胞中高尔基体与分裂后期细胞壁的形成有关3．哺乳动物受精卵的前几次分裂异常可能导致子细胞出现多核现象。
经研究发现，受精卵分裂时，首先形成两个相对独立的纺锤体，之后二者夹角逐渐减小，形成一个统一的纺锤体。
科研人员用药物N处理部分小鼠（2n=40）受精卵，观察受精卵第一次分裂，结果如图所示。
以下有关实验的分析中，合理的是A．两个纺锤体可能分别牵引来自双亲的两组染色体，最终合二为一B．细胞A最终可能将分裂成为1个双核细胞，1个单核细胞C．细胞B最终形成的子细胞中每个核的染色体条数为40D．药物N抑制两个纺锤体的相互作用，可能和马达蛋白的作用有关4．果蝇的红眼和白眼由一对等位基因（W/w）控制。
让一只纯合的红眼雌果蝇与一只白眼雄果蝇交配得到F1，F1全为红眼；F1雌雄个体随机交配得到F2。
为了确定W/w是位于常染色体上，还是位于X染色体上，下列数据中不需要统计的是（）A．F2中雌性个体的性状分离比B．F2中雄性个体的性状分离比C．F2中白眼果蝇的性别比例D．F2中红眼果蝇与白眼果蝇的比例5．下列有关高中生物实验的叙述，正确的是（）A．观察DNA和RNA在细胞中的分布时，应选择染色均匀、色泽较浅的区域进行观察B．低温诱导洋葱根尖细胞染色体加倍的实验中能观察到同源染色体联会现象C．利用口腔上皮细胞观察线粒体的实验中细胞的完整性遭到破坏D．探究培养液中酵母菌数量动态变化的实验中无需要使用显微镜6．下列有关生物体中有机物的叙述，正确的是（）A．含有C、H、O、N元素的有机物属于生物大分子B．DNA分子解旋后，空间结构改变，将失去其功能C．淀粉、蛋白质、脂肪在氧化分解时都能释放出能量D．性激素是基因表达的直接产物，可调节生命活动7．如图表示动物体温调节过程的部分示意图，图中①、②、③代表激素，当某人走出房间进入寒冷环境时，下列叙述错误的是A．血液中激素①、②、③的含量会增加B．骨骼肌受有关神经支配，不自主战栗C．激素③作用的靶器官只有甲状腺D．激素①、②对垂体的作用效应都为促进8．（10分）生物是一门实验学科，生物学经典实验有很多，下列相关叙述错误的是（）A．赫尔希和蔡斯实验所用材料噬菌体能在肺炎双球菌中增殖B．卡尔文用放射性同位素标记法研究CO2中的C在光合作用中的转移途径C．摩尔根运用假说一演绎法证明了控制果蝇红眼与白眼的等位基因位于X染色体上D．温特实验证明了胚芽鞘弯曲生长是由化学物质引起的，并把这种物质命名为生长素二、非选择题9．（10分）果蝇体内的Ⅳ号染色体多一条（三体）或少一条（单体）均可以存活并能够繁殖，没有Ⅳ号染色体的个体不能存活。
单克隆抗体制备过程中经过两次筛选.
单克隆抗体制备过程中经过两次筛选单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。
第一次筛选的原理与方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。
普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。
其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。
在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。
另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。
因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。
对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。
惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。
第二次筛选的原理和方法：在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HAT培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。
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H A T培养基筛选杂交瘤细
胞的原理
Revised by Liu Jing on January 12, 2021
H A T培养基筛选杂交瘤细胞的原理
HAT培养基是指含有次黄嘌呤（hypoxantin）、氨基蝶呤（aminopterin）和胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidin）三种物质的细胞培养基。
1.细胞内合成DNA原料的核苷酸形成的途径
（1）起始合成途径（de novo pathway）：
由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。
在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程。
（2）中间合成途径（salvage pa-thway）：
利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸。
2.利用HAT培养基筛选杂交瘤细胞
（1）经融合后细胞将以多种形式出现：融合的脾细胞—瘤细胞、融合的脾细胞—脾细胞、融合的瘤细胞—瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。
正常的脾细胞在培养基中存活仅5～7天，无需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易死去。
而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除。
（2）融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的中间合成途径缺失株（例如嘌呤的中间合成途径缺失株和嘧啶的中间合成途径缺失株），即只有起始合成途径。
效应B细胞虽不增殖，但有两条DNA合成途径。
（3）氨基蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻碍起始合成途径。
HAT培养基中含有氨基蝶呤时，细胞只有中间合成途径，所以必须供给核苷酸。
杂交
瘤细胞的起始合成途径被氨基喋呤阻断，但可通过中间合成途径利用以培养基中次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷为原料进行合成。
而缺失中间合成途径的瘤细胞，失去增殖能力。
从而选择出杂交瘤细胞。