杂交瘤技术流程
杂交瘤技术
2. 细胞融合技术
分泌抗体 短命 脾细胞 (B淋巴细胞)
长命 不分泌抗体
骨髓瘤细胞
分泌抗体 长命 杂交瘤细胞
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3. 杂交瘤细胞的筛选
脾细胞 (B淋巴细胞)
骨髓瘤细胞
杂交瘤细胞பைடு நூலகம்筛选出
脾细胞脾细胞
不能长期存活
骨髓瘤细胞 骨髓瘤细胞
脾细胞 骨髓瘤细胞
不能长期存活
28
HAT培养基筛选
B淋巴细胞： HGPRT+，TK+ 骨髓瘤细胞： HGPRTˉ或TKˉ 杂交瘤细胞： HGPRT+，TK+
HGPRTˉ或TKˉ细胞在HAT培养基上不能存活； HGPRTˉ与TKˉ细胞融合或与正常细胞融合后的
杂交细胞，可在HAT培养基上存活。
18
HGPRTˉ细胞的筛选
可人为地筛选或致突变，诱发一些细胞缺乏 HGPRT或缺乏TK，如用毒性药物8-氮鸟嘌呤（8azaguanine，8-AG)作用于细胞株，可选育出 HGPRTˉ细胞株，这是因为HGPRT+细胞利用了8AG后，因合成毒性核苷酸而死亡。
存活但短命 死亡
存活
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（三）单克隆抗体的制备过程
30
三个基本环节和两个决定因素
选
择 培
免疫鼠
培养筛选
取脾细胞 骨髓瘤细胞系
饲 养
养 基
细 胞
（HAT）
融合
31
1、免疫小鼠和脾细胞的制备
免疫动物：6~8周龄BALB／c小鼠 免疫抗原：各种病毒、细菌、细胞或可溶性抗原。一
般可溶性抗原用完全佐剂效果较好。 免疫途径：皮下、腹腔或静脉注射 免疫程序：基础免疫2次，静脉再加强免疫1次。 免疫后3~5天解剖，取脾细胞配制成适量浓度细胞悬液
杂交瘤技术(hybridoma technique)基本程序与方法 6
杂交瘤技术（hybridoma technique）基本程序与方法 6（2）杂交瘤细胞的复苏杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞或其他细胞在液氮中保存，若无意外情况时，可保存数年至数十年。
复苏时融解细胞速度要快，使之迅速通过最易受损的 -5℃?0℃，以防细胞内形成冰晶引起细胞死亡。
通常情况下，冻存时细胞数量多，生长状态好的杂交瘤细胞系以及其他细胞的复苏可采用以下方法，这也是各个实验室普遍采用的程序。
即复苏时，从液氮中取出安瓶，立即在37℃水浴融化，待最后一点冰块快要融化时，从水浴中取出，置冰浴上。
用5-10ml HT培养基稀释，1000r/min 10分钟，弃上清，再悬浮于适量HT培养基中，转入培养瓶或24孔板，置37℃，7.5% CO2培养。
如果细胞存活力不高，死细胞太多，可加104-105/ml小鼠腹腔细胞进行培养。
不过，冻存的细胞并不都能100%复苏成功，其原因较多，如冻存时细胞数量少或生长状态不良，或复苏时培养条件改变或方法不当，也可能细胞受细菌或支原体污染，以及液氮罐保管不善等。
在出现上述情况时，可采用一些补救方法复苏这些细胞，如小鼠皮下形成实体瘤法，脾内接种法，小鼠腹腔诱生腹水和实体瘤法，以及96孔板培养法等。
6、单抗特性的鉴定（1）单克隆性的确定包括杂交瘤细胞的染色体分析、单抗免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定和单抗纯度鉴定等。
①杂交瘤细胞的染色体分析对杂交瘤细胞进行染色体分析可获得其是否是真正的杂交瘤细胞的客观指标之一，杂交瘤细胞的染色体数目应接近两种亲本细胞染色体数目的总和，正常小鼠脾细胞的染色体数目为40，小鼠骨髓瘤细胞SP2/0为62-68，NS-1为54-64；同时骨髓瘤细胞的染色体结构上反映两种亲本细胞的特点，除多数为端着丝点染色体外，还出现少数标志染色体。
另一方面，杂交瘤细胞的染色体分析对了解杂交瘤分泌单抗的能力有一定的意义，一般来说，杂交瘤细胞染色体数目较多且较集中，其分泌能力则高，反之，其分泌单抗能力则低。
杂交瘤技术和单克隆抗体技术PPT课件模板
制备单克隆抗体
从筛选得到的杂交瘤 细胞中提取单克隆抗 体，进行纯化和定量 。
应用单克隆抗体
将单克隆抗体应用于 临床诊断、治疗和基 础研究等领域。
单克隆抗体技术的实验操作流程
免疫原制备
制备免疫原，如抗原蛋白或多糖等，并进行 纯化和定量。
免疫动物
将免疫原注射入动物体内，刺激机体产生特异 性抗体。
制备杂交瘤细胞
杂交瘤技术和单克隆
抗体技术ppt课件模
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2024-01-11
目录
• 杂交瘤技术简介 • 单克隆抗体技术简介 • 杂交瘤技术与单克隆抗体技术的比
较 • 杂交瘤技术与单克隆抗体技术的实
验操作流程 • 杂交瘤技术与单克隆抗体技术的应
用案例
01
杂交瘤技术简介
杂交瘤技术的定义
杂交瘤技术是一种将免疫系统的B淋巴细胞与骨髓瘤细 胞融合，形成杂交瘤细胞的技术。
单克隆抗体的应用领域
01 肿瘤诊断与治疗
用于肿瘤的早期诊断、靶 向治疗、免疫治疗等。
03
免疫性疾病。
02 感染性疾病
用于诊断和治疗病毒性肝 炎、艾滋病等感染性疾病 。
04 心血管疾病
用于诊断和治疗冠心病、
心肌梗死等心血管疾病。
杂交瘤技术与单克隆抗体技
杂交瘤技术与单克隆抗体技
04
术的实验操作流程
杂交瘤技术的实验操作流程
准备免疫动物
选择适宜的免疫动物 ，如小鼠或大鼠，并 进行免疫接种，刺激 机体产生特异性抗体 。
制备杂交瘤细胞
将免疫动物的脾细胞 与肿瘤细胞融合，形 成杂交瘤细胞。
克隆化筛选
通过选择性培养基筛 选出能够产生所需抗 体的杂交瘤细胞，并 进行克隆化培养。
杂交瘤技术和单克隆抗体技术
四、免疫系统能将外来微生物和分子与本身成份区别开来。
五、系统记忆每一次与外来抗原旳遭遇
免疫反应遇到同一抗原时一次比一次强，具有特异性。免 疫记忆能够延续动物终身。
六、免疫反应旳许多性质是经过克隆选择拟定旳
一种抗原活化一种淋巴细胞。当淋巴细胞表面受体结合 抗原时，B淋巴细胞就被活化，分泌抗体被刺激而增殖（急 剧分裂克隆）。
重链分子量为5.5kDlt；轻链分子量为2.5kDlt。 二、不同类型抗体旳区别
IgG、IgM、IgA、IgE和IgD因重链形式不同而有所区别。 它们旳重链分别称作γ、μ、α、ε和δ。
重链旳不同使这些蛋白具有不同形式旳免疫功能，而且在 完毕反应成熟旳不同阶段发挥作用。这些差别主要是因为Fc 片段上旳蛋白序列不同所致。
四、抗体重链旳分子构造
重链旳序列也存在可变区和恒定区（图2-1）。IgG重链具 有一种可变区和三个恒定区，每区含110个氨基酸，其他重 链具有附加旳恒定区。
IgG重链序列也显示γ链有四种亚类，即：IgG1、IgG2a、 IgG2b和IgG3。鼠重链多肽编码区在第12染色体上。
五、重链和轻链旳可变区形成抗原结合位点
B细胞：分泌抗体，并在细胞表面携带同一抗体旳修饰型， 功能相当于受体。
毒性T细胞：携带结合抗原旳细胞表面受体。 辅助T细胞：在控制B细胞和细胞毒性T细胞反应方面起关 键旳调整作用。
体液介导旳适应性免疫反应：体液反应引起产生可结合外 来抗原旳循环抗体，由B淋巴细胞产生，由辅助T淋巴细胞 介导是抗体技术旳基础。
HAT选择培养基：HAT培养基是指在细胞培养基中加有次黄 嘌呤（H）、氨基喋呤（A）或氮丝氨酸（A）和胸腺嘧啶核 苷（T）旳培养基。细胞为合成DNA所需要旳嘌呤和嘧啶，可 由两条途径取得。一条为主要途径，即从磷酸核糖焦磷酸 （PRPP）和谷氨酰胺合成肌苷酸（IMP），进而转变为脱氧 鸟苷三磷酸（dGTP），及从脱氧尿苷酸（dUMP）合成脱氧 胸苷酸（dTMP），再转变为脱氧胸苷三磷酸（dTTP）。这 一合成途径，可为加入旳会克制为嘌呤或嘧啶合成提供甲基旳 二氢叶酸还原酶旳叶酸类似物A所阻断。此时，只有HGPRT+ 和TK+细胞才干经过另一条应急途径，利用外加旳核苷酸旳 “前体”H来合成IMP和利用T来合成dTMP，而得以有活下 来。相反，HGPRT－和TK－细胞则将因无法利用H和T来合成 DNA而死亡。所以，在HGPRT－和TK－细胞融合后，应用 HAT培养基即可将经过基因互补而同步取得HGPRT和TK酶 旳杂种细胞筛选出来。
杂交瘤技术基本程序与方法
杂交瘤技术基本程序与方法一、杂交瘤技术的诞生淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。
1975年8月7日，Kohler和Milstein在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity）的著名论文。
他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。
融合由仙台病毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培养基（HAT）中生长进行选择。
在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+，但不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HA T培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性，而在HAT培养基中存活下来。
实验的结果完全像起始设计的那样，最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。
用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤，即所谓杂交瘤。
生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体，即单克隆抗体。
这一技术建立后不久，在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改进。
杂交瘤细胞筛选实验报告
一、实验目的本实验旨在通过细胞融合技术，获得具有无限增殖能力和特异性抗体分泌能力的杂交瘤细胞。
通过筛选和克隆化，最终获得纯化的单克隆抗体。
二、实验原理杂交瘤细胞筛选技术是利用细胞融合技术，将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌某种抗体的淋巴细胞融合，形成杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞具有肿瘤细胞无限增殖的特性，同时保留淋巴细胞分泌特异性抗体的能力。
通过筛选和克隆化，获得纯化的单克隆抗体。
三、实验材料1. 试剂：聚乙二醇（PEG）、HAT培养基、抗原、酶联免疫吸附剂（ELISA）、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠lgG抗体、包被液、脱脂奶粉、洗涤液、底物显色液、终止液等。
2. 仪器：倒置显微镜、细胞培养箱、超净工作台、冰箱、酶标仪、微量移液器、恒温箱、96孔板等。
3. 实验动物：小鼠。
四、实验步骤1. 细胞融合：将骨髓瘤细胞和分泌某种抗体的淋巴细胞按照一定比例混合，加入PEG诱导细胞融合。
2. 细胞培养：将融合后的细胞接种于含有HAT培养基的培养瓶中，在细胞培养箱中培养。
3. 细胞筛选：经过1-2周的培养，筛选出能够存活并无限增殖的杂交瘤细胞。
4. 特异性抗体筛选：采用ELISA方法，将抗原固相在微孔板上，将杂交瘤细胞培养上清加入微孔板中，检测抗体与抗原的结合情况。
5. 克隆化：将筛选出的阳性杂交瘤细胞进行克隆化，确保获得纯化的单克隆抗体。
6. 阳性杂交瘤细胞筛选：利用间接ELISA方法，检测克隆化后的杂交瘤细胞是否产生特异性抗体。
五、实验结果1. 细胞融合：成功将骨髓瘤细胞和分泌某种抗体的淋巴细胞融合。
2. 细胞培养：在HAT培养基中，杂交瘤细胞能够存活并无限增殖。
3. 细胞筛选：经过筛选，获得能够存活并无限增殖的杂交瘤细胞。
4. 特异性抗体筛选：ELISA结果显示，部分杂交瘤细胞能够产生特异性抗体。
5. 克隆化：对筛选出的阳性杂交瘤细胞进行克隆化，获得纯化的单克隆抗体。
6. 阳性杂交瘤细胞筛选：间接ELISA结果显示，克隆化后的杂交瘤细胞均能产生特异性抗体。
杂交瘤技术
（三）整个细胞融合过程大约要6-7分钟 ①37℃水浴箱；RPM1 1640含15%牛血清 100ml；不含牛血清RPM1 1640 100ml，和50%PEG三者均置于37 ℃ 水浴备用。 重叠二个烧杯中。玻璃烧杯以盛37 ℃ 的水，作为超净工作台临时水浴用。 50ml离心管，锥形底，台式离心机， 1-10ml刻度吸管，秒表，96孔和24孔 塑料组织培养板。
5 . 小鼠免疫脾细胞 大多数情况下，并不需要高度免疫， 其原则为： 可溶性抗原，则将100ug抗原的铝沉 淀物与2X109灭活百日咳杆菌腹腔注 射,1-3周后再用10ug水溶性抗原， 腹腔或静脉注射以加强免疫，三天 后脾细胞进行融合
细胞抗原，初次和加强免疫用2X107 细胞或略少些，腹腔注射。最后免 疫后三天进行细胞融合。 如果用要高度免疫的小鼠作脾细胞， 则小鼠必须进行休息3-4周后，再作 最后的加强免疫。 免疫脾细胞配制成1.5X108~6.0X108 用于融合
可溶性抗原或 颗粒性抗原
免疫鼠（末次免疫后3-5d） 解剖取脾制成细胞悬液
骨髓瘤细胞SP2/0
饲养细胞 正常鼠腹腔液 离心计数
取对数生长期制成 细胞悬液 离心1000rpm 10min计数 1000rpm 10min计数 1.5-6x108 1:1或4:1 1.5x108 混合，离心1000rpm 10min 去上清，加PEG融合（预温） 加无血清1640稀释（预温） 1000rpm 10min离心去上清 加HAT培养液 分装培养板 37℃ 5% CO2培养 逐日观察，隔日换液，HAT两周，HT一周后， 改用正常培养 检测抗体（+） 克隆化，扩大培养冻存
前一日分装于培养板 37℃ 5% CO2 过夜
（一）三个基本环节和二个决定因素
选 择
淋巴细胞杂交瘤(hybridoma)单克隆抗体技术 2
淋巴细胞杂交瘤(hybridoma)单克隆抗体技术 2(三) 骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。
常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63 Ag8.653 等。
骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。
小牛血清的浓度一般在10～20％，细胞的最大密度不得超 10６／ml，一般扩大培养以1∶10稀释传代，每3～5天传代一次。
细胞的倍增时间为16～20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。
一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性，每3～6月应用 8～AG(8氮杂鸟嘌呤)筛选一次，以防止细胞的突变。
保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于9 5％，也是决定细胞融合的关键。
(四) 免疫脾细胞免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞��浆母细胞。
一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。
脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。
一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的２倍，细胞数为２×10８左右。
二、细胞融合，选择杂交瘤(一) 细胞融合流程(1) 取对数生长的骨髓瘤细胞SP2／0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。
(2) 同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。
(3) 将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm,8分钟。
(4) 弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。
(5) 轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。
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杂交瘤技术流程
引言：
杂交瘤技术是一种重要的细胞和分子生物学研究方法，可以用于合成抗体、研究蛋白质功能以及筛选抗肿瘤药物等领域。
本文将介绍杂交瘤技术的流程，包括细胞融合、筛选和鉴定杂交瘤等环节。
一、细胞融合
细胞融合是杂交瘤技术的第一步，旨在将抗体产生细胞与肿瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。
具体步骤如下：
1.1 收集抗体产生细胞和肿瘤细胞：抗体产生细胞可以来自小鼠或人类免疫系统，而肿瘤细胞则常使用骨髓瘤细胞等。
1.2 调整细胞浓度：将抗体产生细胞和肿瘤细胞分别离心，去除培养基，然后重新悬浮在含有多种营养物质的培养基中，使其浓度适宜。
1.3 细胞融合：将抗体产生细胞和肿瘤细胞按照一定比例混合，加入聚乙二醇等融合剂，使细胞融合。
1.4 培养杂交细胞：将融合后的细胞放入含有适宜培养基的培养皿中，利用恒温培养箱进行培养，以促使杂交细胞的生长和繁殖。
二、筛选杂交瘤细胞
筛选杂交瘤细胞是为了从大量的融合细胞中筛选出能够产生特定抗体的杂交瘤细胞。
具体步骤如下：
2.1 选择培养基：准备含有适宜培养条件的培养基，其中可能包含抗生素等物质以抑制非杂交细胞的生长。
2.2 稀释细胞：将培养皿中的杂交细胞适当稀释，使其分散在培养基中。
2.3 培养杂交细胞：将稀释后的杂交细胞转移到含有适宜培养基的培养皿中，继续在恒温培养箱中培养。
2.4 筛选条件：根据所需抗体的特性，设置相应的筛选条件，如添加特定抗原、采用酶联免疫吸附实验等。
2.5 筛选结果：通过观察培养皿中细胞的形态、颜色等特征，确定是否产生了目标抗体的杂交瘤细胞。
三、鉴定杂交瘤细胞
鉴定杂交瘤细胞是为了确认所筛选出的细胞确实具有产生特定抗体的能力，并且可以稳定地传代。
具体步骤如下：
3.1 克隆化：将筛选出的杂交瘤细胞进行克隆化，即分离成单个细胞，并分别培养在不同培养皿中。
3.2 培养单克隆细胞：将克隆化后的单克隆细胞继续在恒温培养箱中培养，观察细胞生长情况，筛选出生长良好的细胞。
3.3 鉴定抗体产生能力：采用ELISA、免疫组化等方法，检测培养上述细胞的上清液，确定其是否具有产生特定抗体的能力。
3.4 稳定传代：选取具有产生特定抗体能力的细胞进行传代，以确保杂交瘤细胞的稳定性和可持续性。
结论：
杂交瘤技术是一种重要的实验方法，通过细胞融合、筛选和鉴定杂交瘤，可以获得具有产生特定抗体能力的细胞株。
这项技术在药物研发、免疫学研究等领域具有重要应用价值，对推动科学研究和促进医学发展起到了积极作用。