流式细胞术(上)
流式细胞术.ppt
信号检测与分析
当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射 时，产生代表细胞内不同物质、不同波长 的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向 空间360度立体角发射，产生散射光和荧光 信号。 以激发图
散射光信号
散射光信号不依赖任何样品的制备技术 （如染色），因此称为细胞的物理参数。
①T淋巴细胞及亚群： 外周血中成熟淋巴细胞主要属于
TCRαβ＋T细胞，可分为Th、Ts、Treg， TCRγδT细胞和NK1.1＋T细胞等，他们 都有一个共同的标志CD3。
a、辅助/诱导性T淋巴细胞（Th）占27-51%， 是主要的功能亚群，主要表达CD3＋CD4＋CD8 －。
b、抑制/细胞毒性T淋巴细胞（Ts）占15-44%， 是 主 要 的 效 应 性 T 细 胞 亚 群 ， 主 要 表 达 CD3＋ CD4 －CD8＋。
因此通过流式细胞仪计数和多参数分析淋巴细胞亚群对了解 淋巴细胞发育、分化、活化和功能成熟，鉴别新的淋巴细胞 亚群具有重要价值；更重要的是通过研究和分析疾病与特异 性淋巴细胞亚群或某些疾病，如免疫性疾病、感染性疾病、 肿瘤等的诊断、治疗、免疫功能重建和器官移植检测有着重 要临床意义。
（1）淋巴细胞及其亚群分析
（三）质料采集和分析过程中 的质量控制
1、标本采集处理
a、组织标本采集： b、标本固定：70%的乙醇固定效果好。 C、单细胞悬液的制备：细胞浓度调整为1×106/ml。 d、石蜡包埋组织的单细胞制备：一般不用。
2、资料采集：一般每个标本应获取1×104。 2×104个有核细胞的荧光和散光系数，白血病 微小残余病变检测应收集5×104个细胞。 3、资料分析；略
缺点；细胞散射光特征丢失较肝素标本快。
（一） FCM单细胞标本的制备
《流式细胞术》PPT课件_OK
❖ 1. DPBS (×10, 贮存液)
NaCl 80g
KCl 2g
蒸馏水加至1000ml
Na２HPO４ 11.5g 临用时用蒸馏水1∶10稀释
KH２PO４ 2g
2. 洗涤液
DPBS
900ml
FCS 50ml 2％)
3. 固定液
DPBS
1000ml
ACD抗凝剂，血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般 细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在8小时之内检测，应将真空采血 管水平室温放置。 ❖ 自身血浆中外周血单个核细胞(PBMCs)：使用肝素钠抗凝的采血后，分 离PBMCs，24小时内分析。 ❖ 组织培养基中的外周血单个核细胞(PBMCs)：用Ficoll分离PBMCs，将细 胞重悬于含10%热灭活胎牛血清(FBS)的RPMI－1640培养基中，调节细胞 浓度为2×106细胞/ml。 ❖ 细胞系与T细胞克隆：调节细胞浓度2×106细胞/mL于新鲜培养基中。 ❖ 冰冻全血与PBMCs：使用1×红细胞裂解液处理活化的外周血或者PBMCs， 用PBS漂洗，并用含1%的BSA及10%的DMSO的PBS重悬，－70℃冻存。 溶化后细胞置于染色管中，加上2～3mL的洗液，离心5分钟后，用破膜 剂对细胞进行破膜和染色。
❖ 2．4℃ 500～1000r/min离心弃去染液。 ❖ 3．加入1.0ml PI染液，4℃避光染色15min。 ❖ 4．400目的筛网过滤1次。 ❖ 5．流式细胞仪分析。
29
Annexin V/PI双染色法
❖ 1．细胞收集：悬浮细胞直接收集10ml的离心管中，而帖壁 细胞先用滴管轻轻吹打，调亡细胞一经吹打可能脱壁，收集 到10ml的离心管中，没脱壁的细胞用0.02％的EDTA消化使之 脱壁，每样本细胞数为（1～5）×106，500～1000r/min离心 5min弃去培养液。
流式细胞术(FCM)的工作原理及其在免疫学上的应用
流式细胞术（FCM）的工作原理及其在免疫学上的应用摘要：流式细胞术(flow cytometry，FCM)是一种可对单细胞进行快速定性、定量分析的新技术。
它借鉴了荧光标记技术、激光技术、单抗技术和计算机技术，具有极高的检测速度与统计精确性，而且从单一细胞可以同时测得多个参数。
随着其分析技术和方法的日臻完善，流式细胞术在临床免疫及科学研究上发挥了非常重要的作用。
本文对流式细胞术的工作原理进行了概括介绍，并对其在免疫学等方面的应用进行了综述，展示了FCM 在免疫学上应用的广阔前景。
关键词：流式细胞术；流式细胞仪；工作原理；免疫学；应用；应用前景流式细胞术(FCM)是70年代发展起来的一种快速对单细胞或微粒定量分析和分选的新技术。
其检测速度之快，统计学精度之高，是其他的方法无可比拟的，可同时从一个细胞中测得多种参数(如DNA、R N A、蛋白质、细胞体积等)进行多参数分析。
流式细胞仪是近代细胞生物学、分子生物学、分子免疫学和单克隆技术、激光技术、电子计算机术等学科高度发展的结晶，在血液学、肿瘤学等学科尤其是在免疫学方面得到广泛应用[1]。
近年来，随着流式细胞免疫学技术的迅速发展，流式细胞术与单克隆抗体技术结合，使细胞表面和细胞内抗原，癌基因蛋白及膜受体的定量检测取得了很大进展。
流式免疫技术克服了普通免疫学方法难以准确定量的不足，形成了流式免疫学独特的科学分支，成为研究细胞免疫学的先进技术之一。
随着科学技术的发展，多种新的荧光探针的不断出现，使FCM技术的应用范围不断扩大，特别是各种各样的荧光探针标记的单克隆抗体和其他蛋白质的出现，为FCM 研究各种组织细胞膜和细胞内抗原、肿瘤性蛋白等开辟了新途径[2]。
1 .流式细胞术与流式细胞仪1.1流式细胞技术：流式细胞技术是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微球，测量其产生的散射光和发射荧光的强度；经染色的细胞或微球在悬液中以单行流过高强度光源的焦点，当每个细胞或微球经过焦点时，发出一束散射光/或荧光；它们经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器光电倍增管或一个固态装置），光检测器把散射光定量转化成电信号，经数字转换器进行数字化后而成整数，然后进行电子存储，以后数据可以调出显示和进行分析；并可能将感兴趣的细胞进行分选[3]。
流式细胞术(免疫学检验课件)
Region设置 Gate设置
第四节 FCM的临床应用
一、淋巴细胞亚群分析
淋巴细胞是机体免疫系统中的一群重要细胞群， 是执行免疫功能和参与免疫调节的免疫活性细胞， 主要分为T细胞、B细胞和NK细胞3大类。
不同淋巴细胞表达的CD抗原都有独自的抗原特性， 在临床疾病发生过程中对各淋巴细胞的CD抗原进 行测定，对于判断机体免疫功能状态、了解免疫 相关疾病的发病机制具有十分重要的意义。
最常用的方法是酶消化法、机械法、化学处理法 和表面活性剂处理法等。
（四）石蜡包埋组织单细胞悬液制备
该制备方法的建立扩大了流式细胞术的应用范围， 有利于进行临床回顾性研究和利用。
常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂脱蜡法和 甲氧-双氧水处理法。
石蜡切片一般适宜厚度是40μm~50μm，脱蜡须彻底， 获取组织后，用酶进行消化处理，消化时间不宜过 长，以免细胞核被消化溶解，经过滤、漂洗后即可 获得单细胞悬液。
三、三参数直方图
三维坐标均为参数 （散射光或荧光）而 非细胞数
对复杂的细胞亚群观 察更为直观、准确， 但对其数据的统计分 析较难
四、多参数组合分析
FCM常常需要分析三个以上的参数，但软件技术 能够无法显示四维空间结构。
随着FCM多色荧光信号检测的发展，所得到的荧 光信号和散射光信号需根据需要进行组合分析以 获得所需的信息。
SSC信号的强弱与 细胞内颗粒结构的 质量成正比，用于 检测细胞内部结构 属性
前向散射光示意图 细胞大小
结构复杂程度
侧向散射光示意图
血
液
白
细
胞
粒细胞
散
点
单核细胞
图
淋巴细胞
荧光信号：由待检细胞上标记的特异性荧光染料 受激光激发后产生。
流式细胞术PPT课件
电荷式分选
lasers
–超声振动器(15-100kHz)
–液流充电系统
–高压偏转板
–收集装置(流式管、培养板)
断裂点(充电) 高压偏转板
29
四路分选原理
电荷式分选装置
30
分选指标
• 分选时间由三方面决定：进样速度、目标细胞所占比例、 需要收集的细胞数。
需要细胞数
目标细胞所占比例(%)
1
5
50
104
• Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的 方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞 DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
• PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。
• AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光， RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
• 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素； 各个通道之间的荧光素可以随意搭配。
FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。
33
B 根据抗原表达强弱合理选择 抗体
• 不同的荧光素强度有所不同；
CD5
• 高表达的抗原可用不太“亮” 的染料，更“亮”的荧光素分 配给表达低的抗原：
99%以上。 • 分选收获率是指被分选出的细胞与原来总细胞的百分比。 • 分选纯度和收获率永远是相互矛盾的，纯度提高，收获率
降低，反之亦然。
– 富集模式(enrich mode) – 纯化模式(purify mode) – 单细胞模式(single cell mode)
流式细胞术精品PPT课件
四、 流式细胞术的应用
1 细胞DNA含量检测：
细胞固定后用PI染色，因为PI特 异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI 的结合量呈良好的线性关系，根据这 个原理，并通过专用的DNA分析软件， 可测出细胞的DNA含量。用于细胞周 期、细胞倍体以及凋亡的检测。
5
• 肿瘤诊断：
•
DNA异倍体的出现是癌变的一个重
• 一、 流式细胞术的概念 流式细胞术（FCM）就是对在的鞘
液包括下的细胞、粒子进行分析和分选 的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧 光标记的。其特点是测量速度快，每秒 钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进 行多参数测量，另一特点是在分析的同 时可把具有指定特征的细胞分离出来， 这就是分选技术。
1
二、流式细胞仪的工作原理
产生及发展，现在CD系统已有247种之多。
细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用
流式细胞仪可对其进行检测分析，可分析
出荧光细胞的含量，也可分析出这种阳性
细胞的CD分子的相对含量。标记的方法一
般用直标法，也可用间标法。荧光探针多
为FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、
APC等。
9
淋巴细胞分类：
•
红细胞表面CD59缺失
18
5 细胞内蛋白的分析：
•
细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分进行荧
光标记，用流式细胞仪进行测量分析，同表型
分析一样，可以测量出这种阳性细胞的数量和
这种蛋白的相对含量。并且，结合细胞表型分
析，进行多标记和多参数分析，可以检测出含
这种蛋白的细胞是属于哪一种表型的细胞。多
用间标法，荧光探针多为FITC。也可以与周期
27
•
流式细胞仪对一个样品提供的结果是否可
流式细胞术
流式细胞术科技名词定义中文名称：流式细胞术英文名称：flow cytometry assay;flow cytometry;FCM其他名称：荧光激活细胞分选法(fluorescence-activated cell sorting,FACS)定义1：一种细胞分选或分析技术。
即以荧光素标记抗体结合相应细胞，用激光束激发单行流动的细胞，根据细胞所携带荧光(强度或类别)进行分选或分析。
测和诊断（三级学科）定义2：一种对悬液中细胞、微生物或细胞器等进行单个快速识别、分析和分离的技术。
用以分析细胞大小、细胞周期、DNA含量、细胞表面分子以及进行细胞分选等。
应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）定义3：用荧光剂对细胞特定成分染色，利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，并能对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。
应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科）流式细胞术（Flow CytoMeter，FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。
简介一种在液流系统中，快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质，并把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的技术。
其特点是通过快速测定库尔特电阻、荧光、光散射和光吸收来定量测定细胞DNA含量、细胞体积、蛋白质含量、酶活性、细胞膜受体和表面抗原等许多重要参数。
根据这些参数将不同性质的细胞分开，以获得供生物学和医学研究用的纯细胞群体。
目前最高分选速度已达到每秒钟3万个细胞。
特点1.测量速度快；2.可进行多参数测量；3.是一门综合性的高科技方法（FCM 综合了光学，电子学，流体力学，细胞化学，免疫学，激光和计算机等多门学科和技术）；4.既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
流式细胞术的基本原理
流式细胞术的基本原理流式细胞术（Flow cytometry）是一种被广泛用于生物学和医学领域的细胞分析和排序技术。
该技术采用激光离子流和散射光学的原理，快速测定单个细胞的生物学和物理特性。
该技术不仅可以进行细胞计数、大小、形态特征、表面结构、细胞周期、代谢活性、细胞分化和生长状态等分析，还可以进行单细胞分选和纯化以及细胞染色体分析等研究。
基本原理流式细胞术的原理是通过射流将单个细胞迅速送入激光束中，该激光束激发细胞中的荧光染料和标记物或散射光学特性，进而检测细胞的光学信号，并进行信号转换和数字化处理，最终得到单个细胞的特异性指标。
流式细胞术的主要组成部分包括样品处理系统、流式细胞分析系统和数据分析系统。
样品处理系统：将细胞样品经过预处理、染色或标记，使其适用于流式细胞分析。
常用的样品预处理方法包括：细胞分离、染色、去除细胞碎片和去除红细胞等。
对于需要分选的细胞，还需要使用细胞排序技术分离目标细胞。
流式细胞分析系统：该系统包括激光、光电倍增管、光学透镜、光学滤波器、样品输送系统和电子系统等。
通过激光激发样品中的荧光染料或标记物，分析细胞的光学特性。
常用的荧光染料包括：FITC、PE、APC、PerCP、Cy5等。
常用的标记物包括：抗体、细胞因子、小分子荧光探针、DNA荧光探针等。
通过修改流式细胞分析仪的配置，可实现不同荧光染料和标记物的测定。
数据分析系统：流式细胞仪测定数据的处理和分析是采用计算机系统完成的。
数据分析的常用指标包括：细胞计数、细胞孔径（大小）、荧光强度（比例和强度）、散射特性等。
一般情况下，在细胞的某个特定荧光标记物上测定的强度与其他群体相比，该指标被用来区分并描述细胞。
流式细胞术的应用流式细胞术被广泛应用于生物医学研究和诊断中。
以下是一些常见的应用领域：1. 分析细胞表面和胞内蛋白表达：通过荧光共轭的抗体和标记物来测定单个细胞膜和胞内蛋白的表达量和分布，从而确定细胞分化状态和生理状态。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
流体的聚焦
高流速适用于定 性测量，样本流 变宽，细胞间距 离缩短，这样在 单位时间内流经 激光照射区的细 胞数量增加，可 以快速获取数据。
光源系统
• 激发光源：需要良好的单色性和单向性 • 按光源种类：弧光灯和激光器 • 按冷却方式：空气冷却激光器和水冷却激光器 • BD公司FACSVantage SE分选型流式细胞仪： 488nm和紫外同时激发
Band Pass
600/100 Band Pass (600/100)
550 - 650 nm (600?0)
<550 nm & >650 nm
PMT
4
Dichroic Filters
PMT
3
PMT
1
PMT
2
Bandpass Filters
Laser
流式细胞仪的光信号
• 散射光信号：散射光分为前向角散射(forward scatter，FSC)和
侧向角散射(side scatter,SSC)，散射光不依赖任何细胞样品的制 备技术(如染色)，因此被称为细胞的物理参数或称固有参数。
• 前向角散射光检测细胞相对大小及其表面积 • 侧向角散射光检测细胞内相对复杂性
前向散射光（FSC）
Laser
FALS Sensor
前向散射光（FSC）
侧向散射光（SSC）
• 它们分别将不同波长的光信号送入到不同的探测器。
Wavelengths
LONG (700nm)
Short Pass
Pass Through Filters
SHORT (500nm)
Transmitted
Blocked
650 Short Pass (600SP)
<650 nm
>650 nm
LONG (700nm)
速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速 的定性、定量分析或分选的技术。
流式细胞仪的发展历史
• 起源: 1934年--- Moldvan毛细管细胞计数仪 • 雏形: 1947年--- Coulter细胞计数器 • 1953年---第一台流式细胞分析仪Coulter Counter Model A • 1974年世界上第一台激光流式细胞仪F• 1997年世界上第一台单激光四色数字化流式细胞仪 • 2003年世界上第一台单激光五色的流式细胞仪 • 2009年世界上第一台三激光十色的分析型流式细胞仪 • …… • 自1981年，北京师范大学生物系引进中国第一台流式细胞仪（FACS Ⅲ， • BDIS）至今，各种型号的流式细胞仪在国内安装使用已超过 400 台
Dichroic Filters
SHORT (500nm)
Transmitted Diflected 90?
650 Short Pass (600SP)
<650 nm >650 nm
Long Pass
550 Long Pass (650LP) >550 nm <550 nm
550 Long Pass (650LP) >550 nm <550 nm
分离不同波长的光信号分别到达不同的光电倍增管(PMT)，PMT将光 信号转换成电信号。
• 电信号输入到放大器放大，放大器分两类：线性放大和对数放大。
电信号的放大
• 细胞DNA含量、RNA含量、总蛋白质含量等的测量一般选用线性放大
测量。
• 在细胞膜表面抗原等的检测时，细胞膜表面抗原的分布有时要相差
几十倍，甚至几万倍。如用线性放大器，将无法在一张图上清晰地 将细胞阳性群、阴性群同时显示出来通常使用对数放大器。
的Coherent Enterprise水冷激光器； 633nm的空冷氦-氖激光器
• Beckman公司EPICS XL分析型流式细胞仪：488nm氩离子空冷激光器
光学系统
• FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片和分光镜等光学元件组成 • 其主要光学原件是滤光片，主要分成4类：
长通滤片(long-pass filter，LP)：允许长于设定波长的光通过； 短通滤片(short-pass filter，SP)：允许短于设定波长的光通过； 带通滤片(band-pass filter，BP)：允许一定带宽的波长通过； 二分镜(dichroic filter)
技术专题
流式细胞术 之
流式细胞仪的结构与原理
韦俊 2013.08
概念
• 流式细胞仪(flow cytometer ,FCM)是集现代物理电子技术、激
光技术、计算机技术于一体的先进科学技术设备，是生命科学研究 领域中先进的仪器之一。
• 流式细胞术(flow cytometry)就是利用利用流式细胞仪对处于快
厦大分析测试中心流式细胞仪
Beckman公司EPICS XL分析型流式细胞仪
BD公司FACSVantage SE分选型流式细胞仪
流式细胞仪的特点
• 实现对单列细胞或生物颗粒进行逐个检测； • 实现高通量检测，最快可达数万个每秒； • 可进行多参数测量，并具有明显的统计学意义； • 定性或定量分析细胞； • 分选特定性状或功能的细胞。
流式细胞仪的基本结构
四大模块：
• 液流系统
• 流动室 • 鞘液SHEATH • 样本流SAMPLE
• 光学系统
• 光源 • 滤片
• 信号检测与转换系统
• 放大电路 • 光电倍增管PMT
• 分析系统
• 计算机
• 分选系统
液流系统
• 流动室：仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。 • 液流驱动系统（压力泵）：空气泵+压力传感器
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
侧向散射光（SSC）
荧光信号
荧光检测器
FALS Sensor
Fluorescence
Fluorescence detector ( FL1,FL2,FL3,FL4,FL5,SS)
Freq
信号检测与转换系统
• 当携带荧光素的细胞与激光正交时，受激发发出荧光，经过滤光片
Injector Tip
Sheath fluid
Fluorescence signals
Focused laser beam
流式细胞仪的流动室和液流驱动系统
低流速促使样本 流变窄，单个细 胞得以依次通过， 这样大多数细胞 可流经激光束的 中心，细胞受激 光照射的能量比 较均一，因而低 流速适用于检测 分辨率要求高的 实验，如DNA分 析。