流式细胞术基本原理
流式细胞术——原理,操作及应用(一)
流式细胞术——原理,操作及应用(一)流式细胞术——原理,操作及应用1. 原理•流式细胞术（Flow Cytometry）是一种用于分析和计数悬浮在溶液中的个体细胞的技术。
•通过利用激光器激发细胞或微粒上荧光探针或吸光染料产生的荧光信号或散射光信号进行检测和分析。
2. 操作步骤样本制备•通过细胞培养、组织消化等方法获得需要检测的细胞样品。
•样本可能需要进行染色或标记以便于特定细胞或分子的检测。
流式细胞仪设置•调整激光器和探测器以适应所用标记物的激发和发射波长。
•设置仪器参数，如流速、放大倍数等。
数据采集和分析•将样本注入流式细胞仪，使其以单个细胞的方式流过激光束。
•通过荧光或散射光信号来检测和记录每个细胞的特征。
•利用专业软件对采集到的数据进行分析和解读。
3. 应用免疫表型分析•流式细胞术可以用于检测和分析细胞表面标记物的表达情况。
•可以用于分离和鉴定各种免疫细胞亚群，如T细胞、B细胞和NK 细胞等。
细胞周期分析•通过染色剂标记DNA，流式细胞术可以区分细胞的不同周期阶段。
•可以用于评估细胞增殖能力和细胞周期的营养、药物等因素影响。
细胞凋亡检测•利用荧光探针标记凋亡标记物，流式细胞术可以检测和计数凋亡细胞比例。
•可以用于评估药物对细胞凋亡的影响以及疾病状态的分析。
粒子分析•可以用于分析和鉴定不同大小、不同形状的微粒，如细胞、细胞器、胞外囊泡等。
•可以用于研究细胞的分泌和吞噬过程等。
其他应用•流式细胞术还可用于检测和分析细胞内钙离子浓度、细胞内蛋白、RNA和DNA含量等。
•可以应用于疾病诊断、药物筛选、生命科学研究等领域。
以上是流式细胞术的原理、操作步骤及一些常见应用的介绍。
流式细胞术的广泛应用使其成为现代生命科学研究和临床实践中必不可少的技术之一。
第二讲：流式细胞术原理FSC与SSC
第二讲：流式细胞术原理FSC与SSC我们在第一讲：流式细胞术概述中介绍了流式细胞术是什么，能够检测哪些样本的哪些参数，三大系统以及数据的呈现形式；另外，我们前段时间为大家分享了常用流式细胞仪荧光参数。
这一讲，实验小白为大家简单介绍一下流式细胞术的基本原理以及FSC和SSC这两个参数的用处。
流式细胞术原理在一定的压力下，鞘液带着细胞通过喷嘴中心进入到流式照射室，在流式照射室的分析点，激光照射到细胞发生散射和折射，发射出散射光（包括前向散射光和侧向散射光）；同时细胞所携带的荧光素被激光激发并发射出荧光。
前向散射光（Forward scatter, FSC）和侧向散射光（side scatter, SSC）检测器把散射光转变成电信号。
而荧光则被聚光器收集，不同颜色的荧光被双色反光镜转向不同的光电倍增检测器，把荧光信号也转变成电信号。
这些电信号再经过数据化处理后输入电脑并储存，即可对细胞进行分析或分选。
流式细胞术中的三大系统根据工作原理，流式可以划分为液流系统、光学检测系统和电子控制系统三大系统：液流系统：流动室及液流驱动系统。
光学检测系统：激光光源及光束形成系统；聚焦光源透镜、各种滤光片；光电倍增管（PMT）收集不同波长荧光信号。
电子控制系统：荧光信号转换为电信号，并将信号放大；电信号转化为数字信号；流式软件：收集，分析，数据和图片的输出。
液流系统单细胞液流的形成我们在第一讲中就介绍了流式细胞术就是利用流式细胞仪对处在快速直线流动状态的单细胞进行逐个分析的技术。
那么单细胞液流是如何形成的呢？重点：FSC和SSC参数实验小白将实验样本制备成单细胞悬液，染色后就可以上机检测了。
单细胞悬液在上述的液流系统带动下逐个通过流式细胞仪的检测点，经过机器内部复杂的处理后，我们就可以得到一系列的数据。
然而，不管您是做什么流式实验，最先得到的都是FSC和SSC数据。
即使样本没有经过任何染色，您也可以得到FSC和SSC数据。
流式细胞术的技术原理
流式细胞术的技术原理将待测细胞染色后制成单细胞悬液。
用一定压力将待测样品压入流动室，从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。
流式细胞仪通常以激光作为发光源。
经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。
这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。
光散射信号反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。
荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号，计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理。
检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。
单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。
细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。
在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液滴之中。
将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。
流式细胞术应用例子1.白血病的诊断和治疗：FCM采用各种抗血细胞表面分化抗原(CD)的单克隆抗体，借助于各种荧光染料(异硫氰基荧光素FITC，藻红蛋白PE等)测定一个细胞的多种参数，以正确地判断出该细胞的属。
2.首先需要把实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液，用荧光染料(碘化吡啶PI)染色后对细胞的DNA含量进行分析，将不易区分的群体细胞分成三个亚群(G1期，S期和G2期)，DNA含量直接代表细胞的倍体状态，非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关。
流式细胞仪(Flow Cytometer)基本原理
流式细胞术的特点
检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； 检测参数：多参数； 检测特点：单细胞水平分析； 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； 检测结果：精度高、准确性好； 可对目标细胞进行分选；
2、流式细胞术光信号检测
光信号的类型 散射光信号：与标记荧光素无关，
是细胞的固有参数。
FL1-FITC stain
D、 FMO对照
多色实验中，阴性对照和单染对照并不是严谨的设门对照， FMO对照区分阴性群体和阳性群体更准确。
Fluorescence Minus One 荧光减一对照
(-) PE
FITC
PE
补偿调节引起背景荧光增强。 颜色越多背景荧光越强，限制了多色流式技术的发展。
C、 单标对照 Single Staining Control
由于荧光素的宽发射谱特点，荧光通道间有光谱重叠现象。 多色流式实验的时候需要通过补偿调节消除光谱重叠影响。
FL1 530/30 FL2 585/42
FITC 发射谱
PE 发射谱
Wavelength
补偿调节方法：
FL-2(PE)
1、流式细胞术简介
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式细胞仪为检 测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的 理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。
流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集细胞与分子生物学、 流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光 化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种高科技仪器。
粘连 细胞 死细胞
死细胞 或碎片
肿瘤细胞株FSC/SSC散点图
加药处理后FSC/SSC散点图
流式细胞技术原理
流式细胞技术原理
流式细胞技术是一种高效的细胞分析方法，它可以对单个细胞进行快速、准确的分析。
该技术主要基于细胞在流动状态下通过激光束时所
产生的散射和荧光信号，通过对这些信号的测量和分析，可以获得有
关细胞形态、大小、表面标记物、内部结构和功能等方面的信息。
流式细胞技术基本原理如下：
1. 细胞样品制备：将待检测的细胞样品进行处理，如离心、洗涤等操作，使其达到单个细胞状态，并加入荧光染料或抗体等标记物，以便
在流式仪中进行检测。
2. 细胞在流式仪中流动：将制备好的样品注入到流式仪中，在高速液
体流动中被逐个单独地通过激光束。
3. 激光束照射：当细胞通过激光束时，会发生散射和荧光现象。
散射
现象包括前向散射（FSC）和侧向散射（SSC），前者与细胞大小相关，后者与细胞复杂程度和内部结构相关。
荧光现象则是标记物受激发后
发出的荧光信号，可以用于检测细胞表面标记物或内部结构。
4. 信号检测：流式仪会收集细胞产生的散射和荧光信号，并将其转化
为电信号，通过光电倍增管等装置进行放大和转换。
同时，流式仪还
会记录细胞通过激光束的时间和位置信息。
5. 数据分析：通过对上述收集到的信息进行分析，可以得到有关样品
中细胞数量、大小、形态、表面标记物、内部结构和功能等方面的信息。
这些数据可以用于研究细胞生理学、病理学、药理学等领域。
总之，流式细胞技术利用了细胞在流动状态下产生的散射和荧光信号，通过对这些信号的测量和分析，实现了对单个细胞的快速、准确分析。
该技术在生命科学研究中有着广泛应用，在临床诊断、药物筛选等方
面也有着重要作用。
FCM(流式细胞术检测)原理及临床应用
流式细胞术(flow cytometry FCM)是利用流式细 胞仪对单个生物颗粒(红细胞、白细胞、各类组织细 胞、血小板、微生物等)以及人工合成微球的物理和 生物学特性进行多参数定量分析，并能对特定细胞 群体加以分选的分析技术。
FCM的工作原理
流式细胞仪组成：
1.液流系统 2.光学系统 3.数据处理系统
双标记或多标记分析：目前使用的流式细胞仪 能用一个激光束激发检测三色甚至四色荧光信 号。检测时需注意荧光补偿。
常用免疫荧光染料组合
荧光染料 FITC+PE
激发波长 （nm）
488
发射波长（nm） 525、575
颜色 绿色、橙色
FITC+PeCy5
488
525、675
绿色、红色
FITC+ECD
488
实体瘤以多倍体居多；
G0 期：DNA 合成静止期 G1 期：DNA 合成前期 S 期： DNA 合成期 G2 期：DNA 合成后期 M 期： 细胞分裂期
DNA 倍体 2N 2N
2N-4N 4N 4N
DNA非2倍体出现是鉴别良性与恶性肿瘤的特异性指 标:
良性肿瘤和正常组织良性增生不出现DNA非2倍体细 胞而恶性肿瘤常可出现异倍体细胞；
过去认为 FCM测定残存白血病细胞不可靠， 因为现用的 McAb不能鉴别正常血细胞与白血 病细胞。虽然至今尚未发现白血病细胞特异抗 原，但近来有人提出根据白血病细胞的以下特 征， FCM检测的敏感度可明显提高
白血病细胞的某些抗原表达量明显高于相应 的正常血细胞
如小儿ALL，其CDl0+细胞的荧光强度可 高达3-4个对数值，而其 CD45则为弱阳性或 阴性。
525、625
流式细胞术的原理和应用
流式细胞术的原理和应用1. 引言流式细胞术（Flow Cytometry）是一种广泛应用于生命科学研究和临床诊断的技术。
通过使用流式细胞仪，可以对生物细胞进行快速、精准的多参数分析，为科学家和医生提供了大量的有关细胞的信息。
流式细胞术已成为生物学领域的重要工具，被广泛应用于细胞分析、免疫表型分析、药物筛选等领域。
2. 原理流式细胞术基于细胞在封闭流动系统中单个通过的原理。
其基本流程包括样本制备、细胞标记、细胞检测和数据分析。
2.1 样本制备样本制备是流式细胞术的第一步，它需要将待检测的细胞样本制备成单细胞悬浮液。
这可以通过细胞培养、组织切片或体液等方式获得细胞样本。
重点是要避免细胞凝聚和聚集，以确保细胞在流式细胞仪中单个通过。
2.2 细胞标记细胞标记是流式细胞术的关键步骤之一。
它使用荧光染料或抗体等标记物与目标细胞发生特异性反应。
荧光染料可以通过不同的通道发出不同波长的荧光信号，从而实现多参数分析。
细胞表面标记的抗体通常与荧光素共价结合，以产生可检测的荧光信号。
同时，可以利用染料进行细胞内部器官或分子的标记，以更详细地研究细胞的功能和结构。
2.3 细胞检测细胞检测是流式细胞术中最关键的步骤之一。
它通过流式细胞仪将标记后的细胞悬浮液以单个细胞的形式通过单个检测区域。
这些细胞在流式细胞仪中被激活并产生荧光信号。
光电传感器将捕获和记录这些荧光信号，并将其转化为数字信号，供数据分析使用。
2.4 数据分析数据分析是流式细胞术的最后一步。
通过对获得的荧光信号的数字化处理，可以获得有关细胞的详细信息，包括细胞表面标记物的表达水平、细胞数量统计、细胞大小等信息。
数据分析可以使用专业的流式细胞仪软件完成，也可以使用其他数据分析软件进行更复杂的数据处理。
3. 应用流式细胞术作为一种全面、高通量的细胞分析技术，广泛应用于各个领域。
3.1 免疫学研究流式细胞术在免疫学研究中得到了广泛应用。
通过对免疫细胞的表面标记物进行检测，可以评估免疫细胞亚群的数量、功能和表达水平。
流式细胞术原理
流式细胞术原理流式细胞术原理概述：1.什么是流式细胞术：流式细胞术是将多种特定条件下的离体细胞（即细胞不在原生质上）置入一个流式细胞仪，并利用各种仪器和仪器注入液体，通过细胞之间物质交换，使其在有限时间内受到良好的刺激、富集和选择，从而在定量和质量上均匀地输出体外驯化后的细胞。
2.流式细胞术应用：（1）表型分析：基因表达分析、蛋白质表型分析、抗原检测以及多种分子诊断测试；（2）免疫学应用：免疫细胞排序（FACS）、免疫细胞鉴定、免疫细胞功能分析；（3）其他研究：血液细胞分离以及人类疾病细胞的示蹤。
3.Flow Cytometry的原理：首先，将活细胞置于流式细胞术仪中，然后，在仪器里运动，在仪器里的运动速度是一个恒定的流动；接着，激光会从另一边投射进去，在有特定滤波器的情况下，激光射线就会倒射，与细胞中存在的染料结合，以此来分析表达位点上的基因和蛋白的表达情况，并且在此过程中会记录下所有的数据；最后，细胞会流经检测仪的椭圆形游标，当单束仪检测到某个细胞时，就会发出一个电信号，这样就可以将其标记出来，最后可以将所有细胞记录下来，便于分析表达位点或者染料反应情况，从而分析细胞的类型及其分布情况。
4.Flow Cytometry技术优势：（1）快速：流式细胞术可以在几秒钟内完成大量细胞的分析；（2）灵敏：细胞可以通过可调的激光强度以及多样的滤波器在流式细胞术下被准确检测；（3）准确：使用低酵母可以对细胞表面抗原以及内在细胞特性有更加准确的测定；（4）方便：整个实验过程只需要较少的样本量即可完成，且可以重复性进行，从而可以进行大量的分析和比较。
综上所述，流式细胞术是目前用于研究表型分析、免疫细胞排序以及细胞表面抗原及细胞内特性检测等多个研究领域，功能强大，分析快速准确，整个实验过程便捷、经济等特点，极大地拓展了体外实验、单细胞研究和诊断测试领域，成为细胞及分子生物学研究的有力工具。
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– 激发光源 – 光束收集系统
பைடு நூலகம்• 电子系统
– 光电转换器 – 数据处理系统
• 细胞分选系统
– 喷嘴 – 电偏转板 – 样本收集器
1.2.1 液流系统
鞘液
鞘液
• 鞘流技术：根据层流原理发 展起来的技术，可以实现两 种液体的同轴流动，样本细 胞流位于轴心稳定流动，外 面包裹有鞘液(sheath)。
流式细胞术的特点
• 检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； • 检测参数：多参数； • 检测特点：单细胞水平分析； • 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； • 检测结果：精度高、准确性好； • 可对目标细胞进行分选；
• 流式：单个细胞分析，收集每个细胞的数据，更精准； • WB ：群体分析，得到多个细胞的平均值。
FACS Calibur 双激光四色， 市场覆盖率最高
LSR II 双激光六色，三激光八色， 四激光十色，分析型最高配
FACS Canto II 双激光六色， 三激光八色
FACS Verse双激光六色，三 激光八色
BD公司分选型流式细胞仪
FACSVantage SE FACSAria III
Influx
– 激光特点：单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照。 – 现在仪器常配有仪器选配2-4根激光器，波长多为488nm、
633nm和355nm、405nmUV；
（ 二 ） 光 束 成 行 系 统
细胞流动方向
FCM的单细胞照明技术：这种椭圆形光斑的检测区保证样 本中的细胞是一个一个分别受到最大光照。
流式细胞仪的发展及商品化
• 1934 Moldavanl: First try (固定式细胞分析-流动式)； • 1953 Crosland-Taylor: 鞘流系统(解决难题)； • 1956 Coulter原理(血细胞计数器)； • 1965 Kamentsky: 分光光度计定量细胞成分和散射光应用； • 1967 Kamentsky等设计了细胞分选的装置； • 1969 Vandilla等: 第一台荧光检测细胞计(鞘流聚焦、激光)； • 1972 斯坦福大学: 研制出荧光激活细胞分选仪(FACS)； • 1973 BD公司与斯坦福大学合作，研制生产第一台商用流
式细胞仪-FACS Ⅰ。 • 1975 Kohler和Milstein: 单克隆抗体技术(促进流式发展)。
1979年 国家科委重点项目： 研制国内第一台激光流式细胞仪
1982年 国内第一台三参数激光流式细胞 1984年 国家科委组织科研成果的鉴定验 1985年 获国家卫生部科技成果乙等奖； 1985年--1990年 灵敏度、信噪比、更多
1.1 流式细胞术简介
• 流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式 细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个 细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量 分析和分选的技术。
• 流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集细胞与分子 生物学、流体力学、激光技术、光电子技术、计 算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术 为一体的一种新型高科技仪器。
1.2.2 光学系统
（一）激发光源 ：激光器
• 气体激光器：氩离子(488nm、355nm)、氦氖(633nm)、氪离子 (647nm)、氪氩(568nm)；
• 染料激光器：如氩离子激光泵浦的Rhodomin 6G水溶液染料激 光器，发出550-650nm可变波长激发光；
• 半导体激光器：价格低、结构简单、寿命长。BD的FACS Calibur 已采用635nm半导体激光器。
（三）光收集系统
• 滤光片的组成
– 长通滤片(LP)：只允许特定波长以上的光束通过； – 短通滤片(SP)：只允许特定波长以下的光束通过； – 带通滤片(BP)：只允许一定波长范围内的光束通过。
流式分选仪研制开发； 计算机四参数软件； 样品制备、医学生物学
流式细胞仪的分类
• 分析型流式细胞仪
– 细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用。
• 分选型流式细胞仪
– 既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选； – 进样管道较长，还需要保持无菌状态，所以分选型流
式细胞仪一般只用于分选。
BD公司分析型流式细胞仪
流式细胞术
---原理、操作及应用
生物化学与分子细胞生物学系 流式实验室 地址：西7楼107室 电话：63846590-776423
教学参考书
• 实用流式细胞术彩色图谱。王树奎、周振英主编。2004.4
• 临床流式细胞分析。王建中主编。上海科学技术出版社。 2005.8
• 流式细胞术原理与应用教程。吴后男编。北京大学医学出 版社。2008.2
• 流体动力学聚焦：稳定的液 流从截面积较大的部分流入 截面积较小的部分后，有一 个聚焦收缩作用，细胞流直 径被约束在10-20um，避免 了多个细胞重叠进入检测区。
细胞流
激光照射点 流体动力学聚焦示意图
（一）流动室和液流驱动系统
• 流动室(flow cell, flow chamber)是流式细胞仪的核心部件。 流动室中，被测细胞逐个通过，并在此与激光正交。
进样孔
鞘液Sheath 荧光信号 激光束
流动室结构图：单细胞发生器
液流驱动系统
（二）进样速率控制
10 psi
10 psi
10.2 psi
10.8 psi
• 通过改变样本压力可以调节样本的进样速率，而这并 不是提高样本流的流速，而是改变了细胞之间的距离。
• 高速时样本流变宽，单位时间内流经激光照射区的细 胞数就增加，这样会导致变异系数增加。
• 实用流式细胞术-血液病篇。刘艳荣主编。北京大学医学 出版社。2010.9
• 流式细胞术。陈朱波、曹雪涛编。科学出版社。2010.10
主要内容
• 一、流式细胞仪结构和原理
– 流式细胞术简介 – 流式细胞仪的结构组成 – 流式细胞仪的光信号检测 – 流式细胞术数据的存贮、显示与分析 – 流式分选
• 二、流式细胞术操作与技巧 • 三、流式细胞术在生物医学中的应用
Beckman Coulter流式细胞仪
Epics XL 单激光四色，市场 FC 500 单激光或双激光五色， Gallios 三激光十色，分
覆盖率高，分析型
市场覆盖率高，分析型
析型
CyAn三激光九色，分析型
MoFlo XDP 高端分选型
1.2 流式细胞仪的结构组成
• 液流系统
– 流动室 – 液流驱动系统