流式细胞仪原理和一般用法
流式细胞术——原理,操作及应用(一)
流式细胞术——原理,操作及应用(一)流式细胞术——原理,操作及应用1. 原理•流式细胞术（Flow Cytometry）是一种用于分析和计数悬浮在溶液中的个体细胞的技术。
•通过利用激光器激发细胞或微粒上荧光探针或吸光染料产生的荧光信号或散射光信号进行检测和分析。
2. 操作步骤样本制备•通过细胞培养、组织消化等方法获得需要检测的细胞样品。
•样本可能需要进行染色或标记以便于特定细胞或分子的检测。
流式细胞仪设置•调整激光器和探测器以适应所用标记物的激发和发射波长。
•设置仪器参数，如流速、放大倍数等。
数据采集和分析•将样本注入流式细胞仪，使其以单个细胞的方式流过激光束。
•通过荧光或散射光信号来检测和记录每个细胞的特征。
•利用专业软件对采集到的数据进行分析和解读。
3. 应用免疫表型分析•流式细胞术可以用于检测和分析细胞表面标记物的表达情况。
•可以用于分离和鉴定各种免疫细胞亚群，如T细胞、B细胞和NK 细胞等。
细胞周期分析•通过染色剂标记DNA，流式细胞术可以区分细胞的不同周期阶段。
•可以用于评估细胞增殖能力和细胞周期的营养、药物等因素影响。
细胞凋亡检测•利用荧光探针标记凋亡标记物，流式细胞术可以检测和计数凋亡细胞比例。
•可以用于评估药物对细胞凋亡的影响以及疾病状态的分析。
粒子分析•可以用于分析和鉴定不同大小、不同形状的微粒，如细胞、细胞器、胞外囊泡等。
•可以用于研究细胞的分泌和吞噬过程等。
其他应用•流式细胞术还可用于检测和分析细胞内钙离子浓度、细胞内蛋白、RNA和DNA含量等。
•可以应用于疾病诊断、药物筛选、生命科学研究等领域。
以上是流式细胞术的原理、操作步骤及一些常见应用的介绍。
流式细胞术的广泛应用使其成为现代生命科学研究和临床实践中必不可少的技术之一。
流式细胞术之基本原理及运用
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1.3 流式细胞术光信号检测
光信号的类型 • 散射光信号：与标记荧光素无关，
是细胞的固有参数。 – 前向散射光(forward scatter, FSC); – 侧向散射光(side scatter, SSC).
• 荧光信号
– 自发荧光 ：微弱 – 特异荧光：标记的荧光素分子发出 的荧光，比自发荧光强很多倍。
FITC、Alexa Fluor 488 PE PI PE-Cy5、PerCP APC、AF647
FL3
FL4 640 FL10
• 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素； 各个通道之间的荧光素可以随意搭配。
B 根据抗原表达强弱合理选择 抗体
• 不同的荧光素强度有所不同； • 高表达的抗原可用不太“亮” 的染料，更“亮”的荧光素分 配给表达低的抗原：
流式细胞仪的发展及商品化
• • • • • • • • 1934 Moldavanl: First try (固定式细胞分析-流动式)； 1953 Crosland-Taylor: 鞘流系统(解决难题)； 1956 Coulter原理(血细胞计数器)； 1965 Kamentsky: 分光光度计定量细胞成分和散射光应用； 1967 Kamentsky等设计了细胞分选的装置； 1969 Vandilla等: 第一台荧光检测细胞计(鞘流聚焦、激光)； 1972 斯坦福大学: 研制出荧光激活细胞分选仪(FACS)； 1973 BD公司与斯坦福大学合作，研制生产第一台商用流 式细胞仪-FACS Ⅰ。 • 1975 Kohler和Milstein: 单克隆抗体技术(促进流式发展)。
• 光路系统
– 激发光源 – 光束收集系统
• 电子系统
– 光电转换器 – 数据处理系统
流式细胞术原理及应用
流式细胞术原理及应用
流式细胞术是通过一种名为流式细胞仪的仪器完成的，它能够以非常
高的精确度进行分析和检测。
流式细胞仪通过一根轴，从这个轴上有三根
弹性管，细胞进行注射，从而使细胞在管中行进，细胞同时也受到外界信
号的影响，这种信号可以来自磁场、电场或光场。
当细胞运行到仪器的另
一端时，它们会被照亮，通过一台摄像机可以拍摄到高清晰度的照片，然
后在计算机上进行分析处理。
流式细胞术广泛应用于早筛检、医学诊断、药物发现、药理学实验和
抗生素耐药性研究等方面，它能够更加精确、快速地进行细胞分析。
此外，流式细胞术也可以用于分析抗原抗体，免疫细胞介导的反应，以及细胞因
子如细胞因子和表面受体等的表达情况。
这种技术还可以用来监测血液中细胞水平的变化，如血小板、红细胞、白细胞等。
流式细胞术分析的工作原理及应用
流式细胞术分析的工作原理及应用1. 工作原理流式细胞术（Flow Cytometry）是一种广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域的细胞分析技术。
它基于细胞在流式细胞仪中通过单个细胞传感器单元的原理，可以实时、快速地检测和分析细胞的各种特性。
1.1 流式细胞仪原理流式细胞仪是流式细胞术分析的核心工具。
它将细胞悬浮液注入到一个窄小的液流中，并通过雷射束（Laser Beam）对细胞进行激发。
当细胞经过激发光束时，会发射出特定波长的荧光信号。
流式细胞仪通过光学设备收集并分析这些信号，从而获得关于细胞的信息。
1.2 细胞荧光标记在流式细胞术分析中，细胞通常会被标记上特定的荧光染料，以便测量其特定特征。
这些标记可以是单一的，也可以是多重的，用于同时分析多个参数。
1.3 数据分析流式细胞仪在测量细胞荧光信号的同时，还会记录细胞的大小、形状和荧光强度等参数。
这些数据可以通过特定的软件进行分析和解释，以获得关于细胞数量、细胞类型和细胞功能等方面的信息。
2. 应用领域流式细胞术分析具有广泛的应用领域，在生物医学研究和临床诊断中发挥着重要作用。
2.1 免疫学研究流式细胞术在免疫学研究中广泛应用，可以用于分析免疫系统中不同类型的细胞数量和功能。
通过对白细胞表面标记物的检测，可以检测特定细胞亚群的存在，并研究其在疾病和免疫反应中的作用。
2.2 肿瘤学研究流式细胞术在肿瘤学研究中也扮演重要角色。
它可以用来研究肿瘤细胞的增殖、存活和死亡等关键特性，进而评估药物治疗对肿瘤细胞的影响。
此外，流式细胞术还可以检测循环肿瘤细胞，从而提供肿瘤早期诊断和治疗监测的手段。
2.3 微生物学研究流式细胞术被广泛应用于微生物学研究中，可以用于分析微生物的数量和生物学特性。
通过对细菌、真菌和病毒等微生物的荧光标记，可以确定它们的种类、数量和活性，从而研究其生长规律和致病机制。
2.4 干细胞研究流式细胞术在干细胞研究中也扮演重要角色。
简述流式细胞术的原理与应用
简述流式细胞术的原理与应用一、流式细胞术的原理介绍流式细胞术（Flow cytometry）是一种利用流式细胞术仪（Flow cytometer）对单个活细胞进行多参数分析的技术。
它基于细胞的光学性质和生物化学特性，通过探针标记、荧光染料和细胞表面抗原的相互作用，对细胞进行高速连续检测和分离。
流式细胞术的原理如下：1.细胞悬浮和样本处理：将细胞样品作为悬浮液，通过离心等方法将细胞分散在液体中，去除细胞的团块和碎片，保证单个细胞的流式检测。
2.细胞标记：采用流式细胞术特定的探针和染料对细胞进行标记，以便后续检测和分析。
常用的标记方法包括荧光染料标记、抗体标记和细胞分子探针标记。
3.细胞分离和传送：将标记的细胞悬浮液通过流式细胞术仪，以流速每秒数千个细胞的速度单个分子传送到探测点。
4.光散射与荧光探测：细胞经过流式细胞术仪后，以激光束照射细胞，通过散射光和荧光信号的检测，对细胞进行空间分布和化学信息的获得。
5.数据采集与分析：通过计算机系统采集和记录细胞经过流式细胞术仪后所产生的光散射和荧光信号，在分析软件中对数据进行处理和解读，获得有关细胞的信息。
二、流式细胞术的应用流式细胞术是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的技术，它在细胞学、免疫学、血液学、肿瘤学等领域有着重要的应用价值。
下面列举几个流式细胞术的应用示例：1.血液学研究：流式细胞术结合细胞表面标记和荧光染料标记，可以对血液中的不同细胞类型进行快速的鉴定和数量分析。
例如，通过流式细胞术可对血液中的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞等进行分类和计数，从而判断患者的免疫状态和疾病进展。
2.癌症诊断与治疗：流式细胞术对肿瘤细胞的检测和分析有着重要的作用。
通过流式细胞术，可以检测和定量肿瘤细胞的表面抗原和细胞内信号分子，进一步了解肿瘤细胞的类型、分化程度和增殖状态，为癌症的诊断和治疗提供指导。
3.免疫学研究：流式细胞术能够对免疫系统中的各种细胞类型进行鉴定、计数和功能分析。
流式细胞实验原理及应用
流式细胞实验原理及应用首先，样品准备是流式细胞实验的关键步骤之一、细胞需处于悬浮液中才能通过流式细胞仪。
样品准备包括细胞分离、洗涤和调整浓度等步骤。
通常，细胞样品从组织或培养物中分离，离心沉淀后经过洗涤去除细胞培养液中的残留物，最后将细胞悬浮于缓冲液中。
其次，细胞标记是流式细胞实验的核心步骤之一、在流式细胞实验中，细胞表面或内部的特定分子可以通过适当的标记物进行标记，以便在流式细胞仪中进行检测。
常用的细胞标记方法包括荧光染色、酶联免疫吸附试验（ELISA）和利用特定的抗体与细胞表面受体结合等。
通过流式细胞实验，我们可以通过标记特定分子表达来研究细胞的功能、状态和变化。
最后，细胞检测是流式细胞实验的最后一步。
通过流式细胞仪，可以对标记的细胞进行检测和分析。
流式细胞仪通过激光束照射样品中的细胞，测量细胞发射的荧光信号和散射光等物理性质，从而获得与细胞特性有关的数据。
这些数据可以用于定量和定性分析，例如分析细胞表面标记物的表达水平、颗粒物的大小和形状等。
流式细胞实验在生命科学研究中有着广泛的应用。
它可以用于研究细胞的免疫表型，例如探究免疫细胞亚型的分布和功能状态。
同时，流式细胞实验还可用于分析细胞凋亡、细胞周期、细胞增殖和细胞分化等生理过程。
此外，流式细胞实验还可应用于肿瘤学研究和临床诊断，如肿瘤细胞表面标记物的检测和癌症患者的免疫监测等。
总之，流式细胞实验是一种快速、准确的细胞检测和分析技术。
它通过针对特定分子的标记和仪器的测量，实现对单个细胞的定量和定性分析。
由于其高通量、高灵敏度和高特异性的特点，流式细胞实验被广泛应用于细胞学、免疫学、遗传学等领域，并为相关研究提供了有力的工具和方法。
流式细胞仪原理及操作步骤
流式细胞仪原理及操作步骤流式细胞仪（FCM）是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。
其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断，对淋巴细胞群和亚群进行精确分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。
活细胞免疫荧光技术是用于FCM检测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下，活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的结果。
（一）原理活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。
（二）操作步骤制备活性高的细胞悬液（培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法）↓用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为5×10６～１×10７／ml↓取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb（5～50μl）的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1 ∶20（用DPBS稀释）灭活正常兔血清（或兔抗鼠）荧光标记物，充分振摇↓ 4 ℃30min 用洗涤液洗涤2 次，每次加液2ml 左右1000rpm×5min↓加适量固定液（如为FCM制备标本，一般加入1ml 固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100～500μl 固定液）↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察（标本在试管中可保存5～7 天）（三）试剂和器材1. 各种特异性单克隆抗体。
2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。
3. 10％FCS RPMI1640, DPBS 、洗涤液、固定液（见附录）。
4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
（四）注意事项1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10 倍的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
流式细胞术的原理和应用
流式细胞术的原理和应用流式细胞术是一种广泛应用于生物医学领域的先进技术，它通过对细胞的特定特征进行高效、快速的检测和分析，为科学研究和临床诊断提供了强大的工具。
流式细胞术的原理和应用涉及到许多方面，包括仪器原理、标记技术、数据分析等，下面将对这些内容进行详细阐述。
一、流式细胞术的原理流式细胞术的原理基于细胞在流动液体中依次通过激光束后的单个检测区域，通过检测细胞在不同参数下的散射或荧光信号来获取关于细胞数量、大小、形态、表面标记物等信息。
流式细胞术通常包括以下步骤：1. 样本制备：将样本中的细胞进行适当的处理，如酶消化、离心、过滤等，以获得单细胞悬浮液。
2. 细胞标记：利用标记物（如荧光染料、抗体等）对待测细胞进行特异性标记，以便在流式细胞仪中对其进行检测和分析。
3. 流式细胞仪检测：将标记后的细胞悬浮液通过流式细胞仪，激光束依次照射每个细胞，并通过检测散射光和荧光信号来获得相关信息。
4. 数据分析：通过专门的流式细胞数据分析软件对获得的数据进行处理和分析，获取细胞的数量、特征等信息。
二、流式细胞术的应用1. 免疫学研究：在免疫学领域，流式细胞术可用于分析免疫细胞的类型、数量和功能，如淋巴细胞亚群的鉴定、T细胞的活化状态等，为免疫学研究提供了重要的数据支持。
2. 癌症诊断和治疗：流式细胞术可用于检测肿瘤细胞的类型和数量，分析肿瘤细胞的表面标记物，评估肿瘤的侵袭性和预后，指导临床治疗方案的选择和疗效监测。
3. 干细胞研究：流式细胞术可用于干细胞的鉴定和分离，分析干细胞的表面标记物和多能性，为干细胞研究和应用提供重要的技术支持。
4. 病原微生物检测：流式细胞术可用于检测微生物感染，分析微生物的数量、类型和毒力，评估感染的严重程度和治疗效果。
5. 血液分析：流式细胞术可用于分析血液中各类细胞的数量和功能，如白细胞亚群的鉴定、血小板的活化状态等，为临床诊断和治疗提供重要信息。
流式细胞术作为一种高效、敏感的细胞分析技术，在生物医学领域有着广泛的应用前景。
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流式细胞仪的原理概述
流式细胞仪（Flow Cytometer 简称FCM）是一种自动分析细胞的高端技术设备，其原 理是悬浮在液体中的细胞一个个地依次通过测量区，当每个细胞通过测量区并被激发 光照射时产生光信号，然后被光电倍增管（PMT）转化成电信号，这些信号可以代表 荧光、普通光散射、光吸收或细胞的阻抗等。这些信号可以被测量、存贮、显示，于 是细胞的一系列重要的物理特征和生化特征就被快速地、大量地测定。上述特征可以 是细胞的大小、活性，核酸的数量、酶、抗原等等。仪器还可以根据所规定的参量把 指定的细胞亚群从整个群体中分选出来。
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流式细胞术
流式细胞分析，又称流式细胞术 （flow cytometry，FCM），是以高 能量激光照射高速流动状态下被荧光 色素染色的单细胞或微粒，测量其产 生的散射光和发射荧光的强度，从而 对细胞（或微粒）的物理、生理、生 化、免疫、遗传、分子生物学性状及 功能状态等进行定性或定量检测的一 种现代细胞分析技术。他综合了激光 技术、计算机技术、半导体技术、流 体力学、细胞化学等各门学科。
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特点：
（1）单细胞分析。 （2）快速分析。 （3）多参数相关测量。 （4）定性或定量分析细胞。 （5）统计学意义明显。 （6）分选。
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常用方法： 单抗直接标记
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嵌入性染料
如DAPI、赫斯特、PI等，直接与细胞内的DNA双螺旋结构中 的A-T碱基对结合，从而使细胞在激发光的照射下发特定波长 的光，通过判断发射光的强弱来推算A-T碱基对的多少，从而 得知DNA的倍性关系。
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细胞膜电位、离子、脂类探针
• 现已发现或开发出来了各种细胞膜电位、各类离子、pH值、脂 类探针，运用这些探针在流式细胞仪上可轻易检测各种细胞功能， 可实现一些意想不到的效果。 • 详细信息，见细胞探针公司网站：
与酶基质结合后使用、检测活细胞内酶活性 活细胞内水平检测、MDR 活细胞内线粒体、MDR 基因表达 细胞膜电位 细胞膜电位 细胞内活性酶 细胞内活性酶 活细胞染色 活细胞染色、乙啡叮 同型二聚体-1的双色检测判断细胞 死活
其 它
DiBAC4 (3) DCFH-DA DHR FDA Calcein AM
流式细胞仪的原理
流式细胞仪使用一般方法及技巧
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流式细胞术
流式细胞分析，又称流式细胞术 （flow cytometry，FCM），是以高 能量激光照射高速流动状态下被荧光 色素染色的单细胞或微粒，测量其产 生的散射光和发射荧光的强度，从而 对细胞（或微粒）的物理、生理、生 化、免疫、遗传、分子生物学性状及 功能状态等进行定性或定量检测的一 种现代细胞分析技术。他综合了激光 技术、计算机技术、半导体技术、流 体力学、细胞化学等各门学科。
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常见荧光染料列表
Fluo-3AAMA 钙 Fura RedAAMA BCECF (AM) pH SNARF-l (AM) 506 473 488 488 525 670 535 587A635 细胞内钙离子的检测 细胞内钙离子的检测 细胞内pH 细胞内pH (pH6-9)
•自发荧光：细胞或颗粒在激发照射下会发出各种波长的荧光。白 细胞自发荧光强度为650~1150MESF，血小板及其他颗粒自发荧光 更低 •流式细胞仪精度：分析白细胞要求精度在600MESF以内，分析其 他细胞或颗粒需要更高的精度：200MESF以内
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常见荧光染料列表
染料名称 激发波长 （nm） 488 488/565 488/565 488/565/650 488/565 633 650 488/536 最大发射 波长(nm) 应用 FITC PEARDI ECD 抗 体 PC5/PE-Cy5 PC7/PE-Cy7 Cy5 APC Pl 530 575 613 670 767 670 660 617 一般应用 FITC及2重染色 多重免疫染色用 多重免疫染色用 多重免疫染色用 多重免疫染色用 多重免疫染色用 1色染色体、DNA细胞周期、除去死细胞
675nm
637nm红色激光激发：
APC(别藻兰蛋白）：红色 665nm APC-Cy5(别藻兰蛋白的衍生物）：深红色 710nm
365nm紫外光激发：
DAPI（4，6-咪基-2联苯吲哚）：蓝色 455nm
532nm绿色激光激发：
PE（藻红蛋白）：橙黄色 575nm PE-Dy647 （PE的衍生物）：红色 647nm PE-Cy5（PE的衍生物）：红色 665nm
D N A / R N A
YOYO-l
CPO 7-AAD SYTO16 SYTOX Green TO-PRO-3 DAPI
491
488 546 488 504 642 360
509
530/670 647 518 523 661
DNA细胞周期、除去死细胞
DNA(530)/RNA(670)、网织红细胞检测 G-C特异性、DNA细胞周期、除去死细胞 活细胞染色 DNA细胞周期 除去死细胞 DNA细胞周期
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光学系统
流式细胞仪的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它们 分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器。 在流式细胞仪的光学系统中主要光学原件是滤光片，主要分为三类：
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与流式细胞仪相关的荧光术语
•MESF（Molecules of equivalent soluble fluorochrome）等量可溶 性荧光分子：国际标准单位，用来衡量荧光强度
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荧
光
有些物质，当用光照射时，它吸收了该种波长的光后还会发射 出各种颜色和不同强度的光，而当光停止照射后，这种发射的 光也随之消失，这种发射的光称为荧光(fluorescence)。荧光 的波长比吸收光线的波长要长些。由于物质的分子结构不同， 所吸收的光和所发射的荧光波长也不同。被这些物质吸收的光 称为激发光，产生的发射光即荧光。荧光的颜色多为红、蓝、 绿或黄等。 物质的荧光有两种，一种是自发性荧光，即组织在短波长光照 射下自行发射出的荧光。如，组织中的蛋白质和脂类在紫外线 照射下能发射出微弱的淡蓝色荧光。另一种荧光是诱发荧光， 即细胞与荧光色素结合后，经一定波长的光线照射后发出的荧 光。常用的是诱发荧光，能产生荧光的生物染色剂称为荧光染 料(或称荧光色素)。
激光光束在到达流动室前，先经过透镜，将其聚焦，形成几何尺寸约即短轴 稍大于细胞的直径的光斑。这种椭园形光斑激光能量分布属正态分布 ;为保 证样品中细胞是一个一个分别受到光照并且受照强度十分一致 ,须将样本流 与激光束正交且相交于激光能量分布峰值处 ,台式机FCM的光路调节对用户是 封闭的，即安装时由工程师调试完毕后 ,无需用户作任何调节 , 所以用户操 作十分方便。
3. 光学系统（滤光片组） 4. 信号检测与存储系统 5. 显示、分析系统
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激
光
提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光 源，这是因为由于细胞的快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为１微秒 左右，每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间 和激发光的强度有关，因此要求细胞必须达到足够的光照强度。
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荧光激发与发射原理
激发态
激发 发射
能量损失
能量级 激光
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免疫荧光技术
免疫荧光技术是根据抗原—抗体反 应的原理，先将已知的抗原或抗体 标记上荧光素，制成荧光抗原或抗 体，再用这种荧光抗体(或抗原)作 为探针检测细胞表面或细胞内的相 应抗原(或抗体)。从而使形成的抗 原—抗体复合物上含有标记的荧光 素，利用流式细胞仪检测标本，荧 光素受外来激发光的照射而发生明 亮的荧光(如，黄、绿色或红色等)， 通过确定抗原或抗体的性质、定位 来推断细胞的信息，以及利用定量 技术测定含量。
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电子元件部分
液路
光学接收器
FL3 PerCP, Cy5
FL2 PE
计算机
FL1 FITC
激光， 如： 488nm
SSC
FSC
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流式细胞仪的构造
1. 流动室及液流驱动系统
2. 激光光源及光束形成系统
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Contributions to New Developments in Medical Diagnosis and Microbiology 德国 Partec公司中国服务中心 张向阳