流式细胞仪(FlowCytometer)基本原理汇总.
流式细胞仪工作原理
流式细胞仪工作原理流式细胞仪（Flow Cytometer）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的仪器，它可以快速、准确地分析和计数细胞、细胞群和微粒。
流式细胞仪的工作原理主要包括样本流动系统、激发光源、光学系统、信号检测系统和数据分析系统。
1. 样本流动系统：流式细胞仪的样本流动系统由进样装置、样本流路和废液收集系统组成。
样本通过进样装置被注入到流动细胞仪中，进入样本流路后以恒定的速度流动。
废液收集系统用于收集已经分析过的样本。
2. 激发光源：流式细胞仪通常使用激光器作为激发光源。
激光器产生的单色激光通过光纤传输到流式细胞仪中，激光的波长可以根据需要进行选择。
常用的激光器波长包括488nm、532nm和633nm等。
3. 光学系统：流式细胞仪的光学系统包括激发光源、光学滤光片、透镜、光电倍增管（PMT）和散射光探测器等。
激发光源照射样本时，样本中的细胞或微粒会发生荧光或散射现象。
光学滤光片用于选择特定波长的荧光信号或散射信号，透镜用于聚焦光线，PMT用于接收和放大荧光信号或散射信号。
4. 信号检测系统：流式细胞仪的信号检测系统主要由光电倍增管（PMT）和散射光探测器组成。
PMT是一种高灵敏度的光电探测器，能够将荧光信号或散射信号转换为电信号。
散射光探测器用于检测样本中的散射光信号，可以分析细胞的大小和形状等信息。
5. 数据分析系统：流式细胞仪的数据分析系统主要包括计算机和相关的数据分析软件。
通过数据分析软件，用户可以对采集到的数据进行处理、分析和图形展示。
常用的数据分析软件包括FlowJo、CellQuest和ModFit等。
流式细胞仪的工作原理是基于细胞或微粒在激光照射下发生荧光或散射现象，通过光学系统收集和检测这些信号，并通过数据分析系统对信号进行处理和分析。
流式细胞仪可以实现对细胞的表型、功能和数量等多个方面的分析，广泛应用于免疫学、细胞生物学、肿瘤学等领域。
以上就是流式细胞仪的工作原理的详细介绍。
简述流式细胞术的原理与应用
简述流式细胞术的原理与应用一、流式细胞术的原理介绍流式细胞术（Flow cytometry）是一种利用流式细胞术仪（Flow cytometer）对单个活细胞进行多参数分析的技术。
它基于细胞的光学性质和生物化学特性，通过探针标记、荧光染料和细胞表面抗原的相互作用，对细胞进行高速连续检测和分离。
流式细胞术的原理如下：1.细胞悬浮和样本处理：将细胞样品作为悬浮液，通过离心等方法将细胞分散在液体中，去除细胞的团块和碎片，保证单个细胞的流式检测。
2.细胞标记：采用流式细胞术特定的探针和染料对细胞进行标记，以便后续检测和分析。
常用的标记方法包括荧光染料标记、抗体标记和细胞分子探针标记。
3.细胞分离和传送：将标记的细胞悬浮液通过流式细胞术仪，以流速每秒数千个细胞的速度单个分子传送到探测点。
4.光散射与荧光探测：细胞经过流式细胞术仪后，以激光束照射细胞，通过散射光和荧光信号的检测，对细胞进行空间分布和化学信息的获得。
5.数据采集与分析：通过计算机系统采集和记录细胞经过流式细胞术仪后所产生的光散射和荧光信号，在分析软件中对数据进行处理和解读，获得有关细胞的信息。
二、流式细胞术的应用流式细胞术是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的技术，它在细胞学、免疫学、血液学、肿瘤学等领域有着重要的应用价值。
下面列举几个流式细胞术的应用示例：1.血液学研究：流式细胞术结合细胞表面标记和荧光染料标记，可以对血液中的不同细胞类型进行快速的鉴定和数量分析。
例如，通过流式细胞术可对血液中的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞等进行分类和计数，从而判断患者的免疫状态和疾病进展。
2.癌症诊断与治疗：流式细胞术对肿瘤细胞的检测和分析有着重要的作用。
通过流式细胞术，可以检测和定量肿瘤细胞的表面抗原和细胞内信号分子，进一步了解肿瘤细胞的类型、分化程度和增殖状态，为癌症的诊断和治疗提供指导。
3.免疫学研究：流式细胞术能够对免疫系统中的各种细胞类型进行鉴定、计数和功能分析。
流式细胞仪原理
流式细胞仪原理简介流式细胞仪是一种常用于细胞分析的仪器，它能够对单个细胞进行快速准确的分析。
通过流式细胞仪，我们可以得到细胞数量、大小、形状、颜色以及表面标记等信息。
流式细胞仪的原理基于流体力学原理、光学原理和电子学原理，下面将详细介绍其工作原理。
流体力学原理流式细胞仪利用流体力学原理将细胞单个地引入到流动液流中，并将其定位在光学路径中。
为了实现这一点，细胞悬浮液会通过一个注射器被推入到流式细胞仪的样本室中。
样本室内的液体流速是可调节的，通常设置为每分钟几百个微升。
液体通过一个窄的注射器喷嘴喷出，与环境空气接触，形成喷雾。
这个喷雾使得细胞在单个状态下被引入液滴，并将其带到一个称为流式细胞仪排样器的设备上。
光学原理流式细胞仪利用光学原理来测量细胞的性质。
当细胞通过流动液体时，一束激光通过细胞，并被细胞的不同组分所散射。
流式细胞仪测量散射的角度和强度来确定细胞的大小和形状。
流式细胞仪上通常有两至三个激光器，每个激光器都有特定的波长。
这些激光器产生的光经过透镜和其他光学元件被聚焦为一束光束。
被聚焦的光束穿过流体中悬浮的细胞，并散射到一个或多个探测器上。
不同角度和强度的散射光被探测器捕获并记录下来。
流式细胞仪的探测器通常分为三种类型：前向散射（FSC）、侧向散射（SSC）和荧光散射（FL）。
前向散射探测器用于测量细胞的大小，侧向散射探测器用于测量细胞的复杂度和内部结构，而荧光散射探测器用于测量细胞的表面标记物。
通过同时测量这些散射光的强度，流式细胞仪可以提供关于细胞的详细信息。
电子学原理除了光学原理外，流式细胞仪还利用电子学原理来处理和分析测量得到的数据。
在流式细胞仪中，探测器将测量到的光信号转化为电流信号。
这些电流信号经过放大、数字化和处理后，可以被计算机分析和展示。
流式细胞仪通常配备有计算机软件，该软件可以解析和分析信号，提取有用的细胞信息。
通过设置特定的参数，我们可以选择性地分析并显示不同类型的细胞。
流式细胞仪(flowcytometer)基本原理
流式细胞仪(flowcytometer)基本原理，详细流式细胞仪（Flow Cytometer）是一种用于细胞计数、细胞分类和细胞特性分析的重要实验室装置。
它能够快速地对成千上万的细胞进行分析，并且可以同时对多种细胞特性进行检测。
流式细胞仪的基本原理涉及到光学和流体力学的结合，这里是一个详细的解释：流体系统（Fluidics）流式细胞仪的流体系统负责将样本中的细胞悬液通过一个狭窄的管道（通常称为流室或喷嘴）输送，使细胞单个通过。
为了实现单个细胞的流动，采用了水力聚焦技术（hydrodynamic focusing），即使用一个不含细胞的剪切流（通常为盐溶液）将细胞流包围起来，迫使它们以单列的形式通过检测区。
光学系统（Optics）当细胞单个通过检测区时，流式细胞仪的光学系统开始发挥作用。
它通常包含一个或多个激光，激光束照射穿过流室的细胞。
细胞对光的散射和吸收会产生前向散射光（Forward Scatter, FSC）和侧向散射光（Side Scatter, SSC），分别与细胞的大小和内部复杂性（如颗粒性或结构）相关。
荧光检测（Fluorescence Detection）除了散射光，如果细胞被荧光标记，那么激光也会激发荧光染料，细胞将发出荧光信号。
不同的染料可以被激发并发出不同波长的荧光，这些荧光通过光学滤镜和分光器被检测，使得可以同时检测多个不同的荧光标记。
数据采集与分析（Data Acquisition and Analysis）每个通过检测区的细胞都会产生散射光和荧光信号，这些信号被光电管或光电倍增管（PMTs）检测，并转换为电信号。
这些电信号随后被数字化，并由计算机软件分析。
软件可以根据用户的需要进行细胞的分类、计数以及各种参数的量化，如细胞大小、颗粒性、荧光强度等。
通过流式细胞仪，研究人员可以进行多种分析，包括但不限于细胞周期分析、活细胞和死细胞的鉴别、细胞亚群的鉴定以及细胞内信号传导的研究。
流式细胞仪工作原理
流式细胞仪工作原理流式细胞仪是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的仪器，它能够对细胞进行快速、高通量的分析和分类。
流式细胞仪的工作原理涉及光学、流体力学和电子学等多个方面。
下面将详细介绍流式细胞仪的工作原理。
1. 光学系统流式细胞仪的光学系统主要包括激光器、光学滤波器、光学透镜和探测器等。
激光器产生高强度的单色激光束，常用的激光器有氩离子激光器、固态激光器和半导体激光器等。
光学滤波器用于选择所需的激发光和荧光信号，以提高检测的准确性和灵敏度。
光学透镜用于聚焦激光束和荧光信号，确保精确的光学成像。
探测器用于接收和转换荧光信号为电信号。
2. 流体力学系统流体力学系统主要包括进样系统、流动装置和排样系统。
进样系统通过吸管或自动进样器将待测样品引入流式细胞仪中。
流动装置通过泵浦将样品以恒定速度注入到流式细胞仪的流动池中。
排样系统则用于收集和处理已经分析过的样品。
3. 细胞分析过程当样品进入流动池后，流体力学系统将样品以单个细胞为单位依次通过激光束。
当细胞通过激光束时，激光束与细胞相互作用，产生散射光和荧光信号。
散射光包括前向散射光、侧向散射光和散射光散射光，用于测量细胞的大小、形状和复杂度。
荧光信号则用于测量细胞中的特定分子标记物，如细胞表面标记物或细胞内染色剂。
4. 探测和数据分析流式细胞仪的探测器会接收和转换散射光和荧光信号为电信号。
这些电信号经过放大和滤波处理后，通过模数转换器转换为数字信号。
数字信号经过计算机处理和分析，生成细胞的散射图和荧光图。
通过分析这些图像，可以得到细胞的特征参数，如细胞数量、大小、形态和荧光强度等。
5. 应用领域流式细胞仪广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域。
在生物医学研究中，流式细胞仪可用于细胞免疫学、细胞生物学、肿瘤学和微生物学等方面的研究。
在临床诊断中，流式细胞仪可用于血液疾病的诊断、免疫表型分析和肿瘤细胞检测等。
总结：流式细胞仪通过光学、流体力学和电子学等原理，实现对细胞的快速、高通量分析和分类。
流式细胞仪(Flow_Cytometer)基础简介
●
FCM的定义
流式细胞仪是指，使细胞（或其 他粒子）以单个方式依次高速通过激 发光束，采集细胞被光照时产生的各 种信号，对信号进行处理，幵对各参 数进行关联分析的一种仪器。
对比
流式细胞仪是一种特殊的显微镜
流式细胞仪
流动的细胞
数量大 高速分选
显微镜
静止的细胞样本
数量少 样本难以再利用
细胞群体特征量分布
流式细胞仪（Flow Cytometer) 基础简介
中科院生物物理研究所 中国科学院蛋白质科学研究平台 2005年3月 刘春春
Hale Waihona Puke 主要内容
流式细胞仪概要 流式细胞仪的工作原理 流式细胞仪测量的对象
什么是流式细胞仪
●
流式细胞仪实物
BD-Calibur
BD FACSVantage
流式细胞仪基本结构
非荧光信号
颗粒度
细胞大小
散射光信号区分裂解后的外周血细胞群
荧光信号
荧光染料被激发而发射的光信号。 定量染色 荧光信号大小 被标记组分含量的定量
多荧光标记胞内多种组分，实现多参数测量
PI＋Annexin－V细胞凋亡检测
DNA 含 量 -PI Annexin-V
PE＋FITC荧光标记检测外周 血裂解后细胞群
光信号收集
光信号分离，导向，各探测通道PMT 接收幵转化为电信号。
激光束
侧向散射 光，荧光
1
二色镜 2
3
细胞
前向 散射 光
收集透镜
带通滤波片 光电倍增管
数据处理
光信号
FSC SSC FL1 FL2 FL3
电信号
对数 线性 线性 线性 对数
流式细胞仪工作原理
流式细胞仪工作原理流式细胞仪（Flow Cytometer）是一种用于细胞分析和排序的仪器。
它可以快速、高效地分析和计数细胞，同时还能够检测细胞的大小、形状、荧光强度等特征。
流式细胞仪的工作原理主要包括样本处理、细胞悬浮液注入、细胞流动、激发光源、荧光信号检测和数据分析等步骤。
1. 样本处理：在使用流式细胞仪之前，需要对样本进行处理。
通常，样本可以是细胞悬液、细胞培养物或者组织样本。
处理包括细胞的采集、离心、洗涤和染色等步骤，以确保样本中的细胞均匀分散并且具有所需的荧光标记。
2. 细胞悬浮液注入：处理后的样本被注入到流式细胞仪的样本室中。
样本室是一个细长的管道，具有一个小孔，称为流动汇聚点。
细胞悬浮液通过流动汇聚点进入流动汇聚室。
3. 细胞流动：细胞悬浮液在流动汇聚室中形成一个窄而稳定的流动柱。
这是通过使用压力或者重力来维持的。
细胞流动的速度可以根据需要进行调整。
4. 激发光源：流式细胞仪使用激光或者其他光源来激发细胞中的荧光物质。
激发光源通常是单色或者多色的，并且具有特定的波长。
当细胞通过激发光源时，荧光标记的份子会吸收光能并发射出特定的波长的荧光。
5. 荧光信号检测：流式细胞仪使用一组光学器件来检测细胞发出的荧光信号。
这些光学器件包括滤光片、光学透镜和光电倍增管。
滤光片用于选择特定波长的荧光信号，光学透镜用于聚焦荧光信号，光电倍增管用于将荧光信号转化为电信号。
6. 数据分析：流式细胞仪将检测到的荧光信号转化为数字信号，并将其传输到计算机上进行数据分析。
数据分析软件可以对细胞进行计数、分类和排序，同时还可以生成细胞分析报告。
流式细胞仪的工作原理基于细胞的荧光特性和光散射特性。
荧光标记的抗体、荧光染料或者荧光蛋白可以与特定的细胞成份结合，并通过检测发出的荧光信号来分析细胞的特征。
此外，细胞的大小、形状和复杂性也可以通过检测散射光来进行分析。
总结起来，流式细胞仪通过将样本中的细胞悬浮液注入到流动柱中，利用激发光源激发荧光标记物，通过荧光信号检测器检测荧光信号，并将其转化为数字信号进行数据分析。
流式细胞仪(Flow Cytometry) 原理简介
侧向散射光(linear)
CD14 PE (log) 前向散射光 (linear) CD45 FITC (log)
R1=单核细胞 (CD14+ve) R2=淋巴细胞 (CD45>单核细胞) R3=中性粒细胞 (CD45<单核细胞)
细胞分选
流式。 大小范围：0.2uM-300uM。 对象类型 细胞类型： （1） 高等真核细胞； （2）酵母； （3）细菌； （4）多细胞的聚集体，如胰岛等。 非生命颗粒： 细胞核、染色体、和其它细胞器以及乳化微球等。
●
FCM的定义
流式细胞仪是指，使细胞（或其 他粒子）以单个方式依次高速通过激 发光束，采集细胞被光照时产生的各 种信号，对信号进行处理，幵对各参 数进行关联分析的一种仪器。
对比
流式细胞仪是一种特殊的显微镜
流式细胞仪
流动的细胞
数量大 高速分选
显微镜
静止的细胞样本
数量少 样本难以再利用
细胞群体特征量分布
非荧光信号
颗粒度
细胞大小
散射光信号区分裂解后的外周血细胞群
荧光信号
荧光染料被激发而发射的光信号。 定量染色 荧光信号大小 被标记组分含量的定量
多荧光标记胞内多种组分，实现多参数测量
PI＋Annexin－V细胞凋亡检测
DNA 含 量 -PI Annexin-V
PE＋FITC荧光标记检测外周 血裂解后细胞群
G1
G2
1 DNA含量
2
1
S
G2/M
细胞周期时相
染色体组型测定
2
1
白血病患者 1/3
4
5
3
Hoechst 33258 （AT）
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
散射光的作用
实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
通过FSC/SSC散点图，gate出目标细胞进行分析。
1、流式细胞术简介
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式细胞仪为检 测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的 理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。
流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集细胞与分子生物学、 流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光 化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种高科技仪器。
FL1
5% 默认阈值
32% 升高阈值后
荧光素和荧光信号
荧光： 荧光素的电子吸收光的能量由低能态转变为高能态， 再回到低能态时释放出的光。
＜ 激发波长
Excitation wavelength
发射波长(荧光波长) Emission wavelength
常用荧光素
<499nm ：蓝色荧光（Blue）；
流式细胞术的特点
检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； 检测参数：多参数； 检测特点：单细胞水平分析； 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； 检测结果：精度高、准确性好； 可对目标细胞进行分选；
2、流式细胞术光信号检测
光信号的类型 散射光信号：与标记荧光素无关，
是细胞的固有参数。 前向散射光(forward scatter, FSC)； 侧向散射光(side scatter, SSC)。
7-AAD（7-氨基放线菌素D 545, 647 ） 以插入的方式与DNA链的G-C碱基 对结合，不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚 358, 456） 可以非嵌入方式与DNA链上 的A-T碱基对特异性结合。变异系数明显小于其他染料，一种理想的DNA 定量染料。
标记抗体的荧光素
激发光波长 （nm）
490
发射光波长 （nm）
520
488
575
490
675
650
660
496/546
670
496/546
767
495
519
650
665
中文名
异硫氰酸荧光素 藻红蛋白 多甲藻叶绿素蛋白 别藻青蛋白 藻红蛋白-花青素5 藻红蛋白-花青素7
核酸荧光染料
PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用 于DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI不 能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
500-549nm：绿色荧光（Green）；
550-584nm：黄色荧光（Yellow）； 585-615nm：橙色荧光（Orange）；
616-700nm：红色荧光（Red）；
≥700nm：远红外荧光（Far-Red）。
荧光素分子
FITC PE PerCP APC PE-Cy5 PE-Cy7 Alexa Flour 488 Alexa Flour 647
Counts
Event #
FL1 FITC
1
10
2 700
3 720
4
15
……
0…………10…………100…………1000 FITC荧光强度
直方图 Histogram
横坐标既可以是线性的，也可以是对数的。
DNA倍体分析
抗原表达分析
Overlay图
散点图 Dot Plot
散点图中每个点代表一个细胞，X轴与Y轴分别代表一种参 数，优点是比直方图直观。
散点图(Dot Plot) 伪彩图(Pseudo-color Plot) 等高线图(Contour Plot) 密度图(Density Plot) 假三维图(Pseudo 3D Plot)
• 三维图(3D Plot)
直方图 Histogram
细胞的某一单参数数据的统计分布图，横坐标表示荧光信号 或散射光信号相对强度的值，单位是道数，纵坐标一般是细 胞数。4、 流式图和流式结果
流式数据的存储：列表模式（list mode），记录了每个细 胞的所有参数的信息。
Event # FSC
SSC
FL1 FITC
FL2 PE
FL3 APC
1 100 500 10 650 4 2 110 505 700 700 6
3
90 480 720 670 10
4
95 490 15 720 15
死细胞 或碎片
粘连 细胞
死细胞
肿瘤细胞株FSC/SSC散点图
加药处理后FSC/SSC散点图
阈值：Threshold/Trigger
阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信号，所以必 须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的死细胞。
FSC反映细胞体积的大小，FCM应用时常选取FSC设定阈值。
Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方 式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞DNA定量分 析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。
AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光，RNA呈 橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
……
每个细胞检测5个参数，那么获取10000个细胞，容量为 5×10000（字或双字）。
流式数据的显示方式
• 常用分析软件
– MACSQuantify – CellQuest – Diva – FlowJo – WinMDI – FCS Express
• 单参数直方图(Histogram) • 双参数数据显示：
荧光信号
自发荧光：微弱（核黄素、色素分子等）； 特异荧光：荧光素分子发出的的荧
光比自发荧光强很多倍。
前向散射光FSC
激光器正前方1 -6度方向上有比较强的衍射光，即前向散射 光，FSC强度是d/λ的函数( λ表示波长，d指细胞大小)， 所以FSC反映被测细胞的体积大小和活力。
侧向散射光SSC