DNA合成仪的使用方法
引物纯化方式HAPAGEDHLPC的区别修订稿
引物纯化方式H A P A G E D H L P C的区别Document number【SA80SAB-SAA9SYT-SAATC-SA6UT-SA18】引物纯化方式HAP、PAGE、DHLPC等的区别纯化方式：一 OPC纯化OPC纯化是使用一种叫Cartridge的反向层析柱（美国 Waters 公司生产 ),根据DNA保护基(DMTr基)和层析柱中树脂间的亲和力作用的原理进行纯化目的DNA片段。
OPC法纯化的DNA纯度大于90%，适用于PCR用引物，DNA测序用引物，各种探针等。
此级别对短链较为有效。
具体操作方法如下。
1. DNA 合成是用全自动 DNA 合成仪从3‘ → 5‘ 进行人工合成的。
在刚合成完的 DNA 的5‘ 端的碱基上带有一个大型的疏水性保护基团 DMTr 基，而中间产物的短链杂质 DNA 中不具有 DMTr 基。
利用这一性质进行目的 DNA 的纯化。
2. 把粗样 DNA 加入 Sep-Pak Cartridge 柱上（简易反相柱 ) 。
此时，所有的合成产物全吸附于反相柱上。
3. 用甲醇清洗反相柱。
此时，吸附能力强的带有 DMTr 保护基的目的 DNA 仍吸附于反相柱上，而短链杂质 DNA 片段全部被冲走。
4. 向反相柱上加入强酸 TFA (Trifluoroacetic acid) , 切断 DMTr 保护基和目的 DNA 之间的连接。
5. 再用乙腈洗脱目的 DNA 。
此时回收出来的目的 DNA 的纯度能达到 95% 以上。
可用于 DNA 测序等。
二PAGE纯化PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。
PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化后的纯度大于9 5%，对长链Oligo DNA的纯化特别有效。
适用于PCR用引物，DNA测需用引物，各种探针等。
三HPLC纯化采用高效液相色谱纯化，产物纯度极高，可达99%。
PCR仪器的使用及注意事项
PCR仪器的使用及注意事项PCR仪器（聚合酶链式反应仪）是用于在体外合成DNA的关键仪器，其具有高灵敏度、高特异性和高效率的特点。
在科研领域，PCR仪器被广泛应用于基因克隆、基因表达分析、基因突变分析等实验中。
本文将介绍PCR仪器的使用方法及注意事项。
1.使用方法（1）准备样品：将需要进行PCR的DNA模板、引物、dNTPs和聚合酶按照配比加入PCR反应管中，并确保样品完全溶解。
（2）设置PCR程序：根据实验需要设置PCR程序，包括温度梯度、循环次数等参数。
（3）装载PCR反应管：将混合好的PCR反应管放入PCR仪器的样品槽中，注意不要产生气泡。
（4）运行PCR程序：启动PCR程序，跟踪反应过程中的温度变化，确保程序正常运行。
（5）分析PCR产物：将PCR产物进行电泳分析或其他实验操作，检查PCR反应的效果。
2.注意事项（1）严格遵守无菌操作规范：在进行PCR实验前，必须保证实验操作环境和操作工具的无菌干净，以防止外源DNA的污染影响PCR反应结果。
（2）避免反应管交叉污染：在操作PCR反应管时，要避免反应液的溅出和反应管之间的交叉接触，保持每个反应管的PCR反应独立进行。
（3）严格控制温度：PCR反应的温度是影响反应结果的重要因素，必须严格控制PCR仪器的温度梯度和循环次数，避免因温度波动导致PCR 反应不稳定。
（4）避免电泳误判：在对PCR产物进行电泳分析时，要注意区分PCR产物和非特异产物，避免因PCR产物的数量或大小而误判实验结果。
（5）及时清理PCR仪器：使用完PCR仪器后，要及时清理反应槽和反应管槽，避免因污染影响下次实验的结果。
总之，PCR仪器的正确使用方法和注意事项对实验结果的准确性和可靠性至关重要。
科研人员在使用PCR仪器时，务必严格遵守操作规范，保证实验操作的准确性和可重复性，从而获得稳定可靠的实验数据。
PCR技术的应用将为生物学、医学和其他领域的研究提供重要支持和帮助。
DNA合成原理及操作
3. 氨解脱保护 合成完毕后取出载体进行切割并且脱保护。
一般40bp以内至少需要2小时，链越长需要 时间越长。
4. 纯化: 目前惯用的纯化方式主要有4种： OPC纯
化、 PAGE 纯化、脱盐纯化、 HPLC纯化
4.1 OPC纯化
利用OPC柱芯对DMT寡核苷酸特殊的亲和 力，将不带DMT的短片段用低浓度的有机溶剂洗 脱，吸附在柱芯里的DNA用酸除去DMT后用1ml 的20%乙腈洗脱。
缺点：不能批次生产，比较费时，有时样品接 收不好也不能有效分离。
5. 样品定量分装 样品纯化后洗脱在1ml的20%乙腈溶液
里，260紫外波长下测值，根据客户要求分 装，一般所有合成公司基本都会按1.2-1.5 倍放大给量。分装的样品干燥，经PAGE抽 样检测合格后交给市场。
合成时效：批次引物（按24条计算）在24小时之内可 以出货
DNA合成作业流程
1. 接收订单安排合成
合成部根据合成实际情况合理安排订单， 依次安排加急-测序-内部-外部，同一客户尽 量同批次安排合成，部分长链、G含量高、 合成量大的引物比较难合成，时间上可能会 有所延缓
2. 上机合成
不同型号的合成仪合成通量和合成时间均 不同，公司预定的仪器批次合成96条引物， 20bp长度合成需要2-3小时。
④氧自由基伤害 细胞代谢副产物O2-、H2O2等会造成碱基损伤，产生胸腺嘧啶乙二醇、羟甲基尿 嘧啶等碱基修饰物，引起碱基配对错误。
三、 碱基插入或缺失 吖啶类分子带正电呈扁平状，易于嵌入DNA碱 基平面间，导致在复制或重组过程中缺失或插 入一个碱基。 DNA聚合酶在复个碱基的缺 失或插入。聚合酶在模板链上滑动易于造成缺 失，在生长链上滑动易于造成插入。 插入或缺失会导致读码框改变。
DNA合成仪
N1 HO
O
乙酸酐和N-甲基咪唑
CPG
O C H 3C O N1
O
CPG
5.氧化：连接反应后新加上的核苷酸通过亚磷酯键（磷为三 价）与CPG上相连的寡核苷酸链连接，此亚磷酯键不稳定， 易被酸、碱水解，因此需将此处三价磷氧化为五价的磷。常 用的氧化剂为碘的四氢呋喃溶液。此步反应速度亦很快。应 注意最后一个循环时，氧化步骤不可省略。此外亦可用其他 氧化剂来完成氧化，从而得到各种符合实验需要的寡核苷酸。 Oxidiser (0.1M) (ABI) 0.1M Iodine in THF/pyridine/water
3.连接：亚磷酰胺四唑与CPG所连的核苷酸碰撞时，与其5’羟基发生亲 核反应，发生缩合并脱掉四唑，合成的寡核苷酸链延长一个。此步单体 相对于CPG所连核苷酸上5’-羟基过量保证了连接的高效率。 形成3’，5’－磷酸二酯键。其中，磷为3价。
N2 DMTrO
O P
CH(CH3)2 N1
N
CH(CH3)2
N2 DMTrO
O
O
P
N1 O
O
CPG
OCH2CH2CN
• 上述循环完成之后进行第二个合成循环。每经历 一轮循环，接长1个核苷酸。接长的链始终被固 定在不溶的固相载体上，过量的未反应物或分解 物则通过过滤或洗涤除去。
• 6.切离，脱保护：当整个链达到预定的长
度后，从固相载体上切下，脱去保护基(氨解)。 一般用新鲜的浓氨水处理较长时间以脱掉腈乙基、 苯甲酰基、异丙基，用三氟乙酸脱5’-DMT。
1
D M T rO
O
T C A
CPG
N1 HO
O
CPG
2.活化：在缩合之前，单体与四唑混合并进 入合成柱，此时四唑提供一个质子给3’磷 酸上二异丙胺基的N原子，质子化的二异丙 胺是一个良好的游离基团，与四唑形成亚磷 酰胺四唑这种活性中间体。此步四唑过量保 证了单体活化充分。
DNA合成仪
不同型号DNA/RNA合成仪的特点与性能简介
PE公司391型DNA／RNA合成仪
美国贝克曼公司01ig01000系列DNA合成仪
DNA合成仪的使用方法操作步骤
1)仔细检查合成仪上所有试剂瓶中的试剂量，必要时换掉试剂瓶，特别注 意乙腈的量，因为该溶剂用量较大。 2)将标记好的清洁的收集瓶装在合成仪上。 3)将要合成的DNA序列输入合成仪。 4)检查选择的合成步骤是否正确。 5)选择结束方法：TritylOffAuto是仪器的原始状态，若打算以5，—DMT基 团连接纯化寡核苷酸，将其转变为TritylOnAuto结束状态。 6)选择结束方法，一般为系统的原始状态。 7)在每个柱监视器的Username下，输入你所希望的保存名字。 8)以代码代替相应的DNA序列标记每一个收集瓶。 9)打印出每一个柱设置的详细资料。 10)检查打印出来的资料是否正确。 11)运行StartColumn步骤检查每一个柱的位置，确保合成仪上合成柱处于 正确的位置。 12)检查连接在合成仪上的溶剂残留(废液瓶)是否充满。 13)如果分部收集器用来收集每个DMT脱保护步骤的流出物，确保试管充分 清洁干净，并打开分部收集器，确保DMT废液管路通向分部收集器。 14)启动循环，运行开始程序清洗试剂管路，除去原来的试剂。
DNA 合 成 仪
长达200个 核苷酸 每次循环12 ~15分钟
用于寡核苷酸化学合成的单体
寡核苷酸片段合成步骤
一、脱保护基(Deblocking) 用三氯乙酸(Trichloroacetic Acid，TCA)脱去连结在 CP苷酸的保护基团DMT(二甲氧基三苯甲基)，获得 游离的5'-羟基端，以供下一步缩合反应。 二、活化(Activation) 将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合 成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体(其3'-端已被活化，但5'-端仍受DMT保护)，此 中间体将与GPG上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。 三、连接(Coupling) 亚磷酰胺四唑活性中间体遇到CPG上已脱保护基的核苷酸时， 将与其5'-羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一 个碱基。 四、封闭(Capping) 缩合反应后为了防止连在CPG上的未参与反应的5'-羟基在随后 的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基，一般乙酰化试剂是用乙酸酐 和N-甲基咪唑等混合形成的。 五、氧化(Oxidation) 缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CPG上的寡核苷 酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷 酰转化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。
dna合成仪原理
dna合成仪原理DNA是构成生物基本遗传遗传物质的核酸，其序列的精确复制和修复对于生命的长期存在和演化的至关重要。
DNA合成仪是一种在短时间内合成高质量的DNA片段和基因组的设备，被广泛应用于基因工程、基因组学、药物研究和诊断等领域。
1. DNA合成基本原理DNA的合成是一种与模板依赖性的生化过程，需要引物（prmer）作为起始点，核苷酸单元（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）作为合成材料，以及酶（DNA聚合酶）作为催化剂。
合成过程中，引物与模板DNA相互配对，酶沿着模板链“读取”模板上的信息，依次加入适配的核苷酸单元，使合成链适配模板链。
反复循环直至合成结束，形成一条新的DNA链。
2. DNA合成仪的构成（1）固相合成化学载体固相合成技术是DNA合成过程中的关键技术，它可以在化学载体表面上合成DNA，同时可以利用高效液相色谱技术对DNA进行纯化和分离。
合成化学载体主要包括：- 硅胶：用于合成磷酸二酯键（phosphodiester bond）；- DNA修饰因子：用于定向控制合成反应；- 引物修饰因子：用于提高合成效率及反应稳定性。
- 化学发光系统：用于监测反应的进行情况；- 氨基酸保护缓冲剂：用于保护酶的氨基酸残基，同时也可以增加合成效率；- 光学系统：用于记录反应的光信号以及反应的质量；- 清洗和纯化装置：用于去除反应体系中的杂质和副产物，以及纯化DNA产物。
（1）引物的设计和配对DNA合成必须要有起始点，通常我们需要在所要合成的DNA片段的两端加上可互补的引物（primer），引物为一串短链的DNA或RNA，通常为18-30个核苷酸。
- 引物的长度和组成；- 引物的互补性；- 引物的位点选择。
（2）DNA链延伸在DNA链延伸过程中，首先需要将反应体系加热至95°C，使沉淀的DNA片段变为单链DNA。
然后将反应体系冷却至50-60°C，将引物加入体系中，引物与模板DNA序列互补，同时可以通过最优反应条件，使引物与模板DNA序列恰好在位点上完全互补，保证整个反应体系的效果。
PCR基因扩增原理
PCR 基因扩增实验原理﹑仪器试剂和操作步骤实验原理：PCR(Polymerase Chain Reaction)-聚合酶链式反应，可以选择性扩增一段DNA序列。
其基本步骤是，首先将待扩增的模板DNA变性使之成为单链，DNA样品中，特异性的引物能够与其互补的序列杂交，在dNTPs和Taq酶存在时，就可以合成模板DNA的互补链，反应完成后，将反应混合物加热使DNA双链变性，温度下降后，过量的引物又可以开始第二轮的合成反应。
这种延伸—变性—退火—延伸的循环可以重复多次，使所需要的DNA片段得到特异性的扩增。
1.变性：加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链。
2.退火：使溶液温度降至50～60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合.3.延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA 聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTPs），按5ˊ→3ˊ方向复制出互补DNA上述3 步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。
从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。
典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶。
影响PCR的主要因素PCR技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品DNA，然后才进行自动热循环，最后进行产物鉴定与分析。
引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强的研究院、所进行，临床应用只需购买PCR检测试剂盒就可开展工作，PCR自动热循环中影响因素很多，对不同的DNA样品，PCR反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致。
现将几种主要影响因素介绍如下。
一、温度循环参数在PCR自动热循环中，最关键的因素是变性与退火的温度。
如操作范例所示，其变性、退火、延伸的条件是：94℃60s, 37℃60s, 72℃120s，共25～30个循环，扩增片段500bp。
分子生物学实验室常用仪器及使用方法
实验一分子生物学实验室常用仪器及使用事实证明，在科学飞速发展的今天，无论从事哪个领域的研究，要想突破，除了有良好的理论基础外，更重要的是依赖于先进的技术和优良的仪器设备以及良好的研究环境。
一个标准的分子生物学实验室除了具有一般生物学实验室的常规仪器设备外，还具有一些特殊用途的仪器，这些仪器一般较精密，价格昂贵。
下面介绍这些仪器的使用方法和注意事项。
一、冷冻离心机低温分离技术是分子生物学研究中必不可少的手段。
基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物样品的分离制备实验中都离不开低温离心技术，因此低温冷冻离心机成为分子生物学研究中必备的重要仪器。
在国内，有多个厂家生产冷冻离心机，本实验室的高速冷冻离心机为GL-20G-Ⅱ型（上海安亭），落地式。
配有角式转头：6×50ml、12×10ml和12×1.5ml。
极限转速20000rpm。
1. 安装与调试离心机应放置在水平坚固的地面上，应至少距离10cm以上且具有良好的通风环境中，周围空气应呈中性，且无导电性灰尘、易燃气体和腐蚀性气体，环境温度应在0～30℃之间，相对湿度小于80%。
试转前应先打开盖门，用手盘动转轴，轻巧灵活，无异常现象方可上所用的转头。
转子准确到位后打开电源开关，然后用手按住门开关，再按运转键，转动后立即停止，并观察转轴的转向，若逆时针旋转即为正确，机器可投入使用。
2. 操作程序（1）插上电源，待机指示灯亮；打开电源开关，调速与定时系统的数码管显示的闪烁数字为机器工作转速的出厂设定，温控系统的数码管显示此时离心腔的温度。
（2）设定机器的工作参数，如工作温度，运转时间，工作转速等。
（3）将预先平衡好的样品放置于转头样品架上，关闭机盖。
（4）按控制面板的运转键，离心机开始运转。
在预先设定的加速时间内，其运速升至预先设定的值。
（5）在预先设定的运转时间内（不包括减速时间），离心机开始减速，其转速在预先设定的减速时间内降至零。
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DNA合成仪的使用方法
亚磷酰胺寡核苷酸合成为例介绍该类仪器的一般操作步骤。
亚磷酰胺DNA合成的试剂有：保护碱基的5／—DMT，A、G、C、T亚磷酰胺单体，四唑偶联催化剂，乙酐，N—甲基咪唑封闭试剂，三氯乙酸（TCA）脱保护溶液，12氧化混合物，乙腈清洗溶剂，氨水切除溶液。
使用步骤如下：
1）仔细检查合成仪上所有试剂瓶中的试剂量，必要时换掉试剂瓶，特别注意乙腈的量，因为该溶剂用量较大。
2）将标记好的清洁的收集瓶装在合成仪上。
3）将要合成的DNA序列输入合成仪。
4）检查选择的合成步骤是否正确。
5）选择结束方法：TritylOffAuto是仪器的原始状态，若打算以5，—DMT基团连接纯化寡核苷酸，将其转变为TritylOnAuto结束状态。
6）选择结束方法，一般为系统的原始状态。
7）在每个柱监视器的Username下，输入你所希望的保存名字。
8）以代码代替相应的DNA序列标记每一个收集瓶。
9）打印出每一个柱设置的详细资料。
10）检查打印出来的资料是否正确。
11）运行StartColumn步骤检查每一个柱的位置，确保合成仪上合成柱处于正确的位置。
12）检查连接在合成仪上的溶剂残留（废液瓶）是否充满。
13）如果分部收集器用来收集每个DMT脱保护步骤的流出物，确保试管充分清洁干净，并打开分部收集器，确保DMT废液管路通向分部收集器。
14）启动循环，运行开始程序清洗试剂管路，除去原来的试剂。
注意：TritylOnAuto表示在合成寡核苷酸的5’端核苷酸带有一个DMT，并将其从固相载体上切下来，储存在收集瓶中；TritylOffAuto表示在合成寡核苷酸的5，端核苷酸没有保护基团，将其从固相载体上切下来，储存在收集瓶中；TritylOnManual表示合成寡核苷酸的5’端核苷酸带有一个DMT，寡核苷酸没有从固相载体上切下来，而是保留在合成柱中；TritylOffManual表示在合成寡核苷酸的5，端核苷酸没有保护基团，寡核苷酸没有从固相载体上切下来，而是保留在合成柱中。