最新高尔基染色.pdf
神经元的高尔基染色法(protocol)
神经元的高尔基染色方法（protocol）针对神经元的Golgi-Cox染色方案和处理制作人：T racey Wheeler（George Mason Univesity）1.配置高尔基溶液（1L容量）A溶液：5%重铬酸钾溶液——重铬酸钾5g+蒸馏水200ml（最好在通风的情况下，用玻璃棒在烧杯中搅拌均匀）。
B溶液：5%升汞——升汞10g+蒸馏水200ml（最好在通风的条件下，用玻璃棒在烧杯中不断搅拌，适合加热直至溶解。
C溶液：5%铬酸钾溶液——铬酸钾8g+蒸馏水160ml（最好在通风情况下，用玻璃棒在烧杯中搅拌均匀）。
将A溶液和B溶液倒入500ml烧杯中搅拌均匀，C溶液倒入1000ml烧杯中，用400ml 蒸馏水稀释，在不断搅拌中缓慢将A、B混合溶液倒入C溶液中，保存在带有棉花塞子的玻璃瓶中熟化5天（黑暗中）。
备注：根据下面的比率以及需要配置溶液的量加以配置5体积的5%重铬酸钾5体积的5%升汞4体积的5%铬酸钾10体积的蒸馏水加入C溶液中2.将高尔基同业转入小玻璃瓶中用塑料吸管从大玻璃瓶中吸取高尔基溶液（尽量避免吸入红色沉淀物）放入小玻璃瓶中，大约为整瓶体积的3/4（剩下的容积足够容纳一只动物大脑）。
3.用盐水注射技术处死动物动物麻醉后，绑在空饲养盒子上（可以让血流入盒子中），打开胸腔暴露心脏，将0.9% 盐水60ml注入右侧心室底部（即动物的左心室），剪开左侧，心室底部（即动物的右心室），缓慢注入盐水，直至左侧的心室的血液全部消除（可能需要注射三次），断头取脑，放入配置好的高尔基溶液中，在黑暗中储存14天，2天后更换新鲜高尔基溶液。
4.将脑组织转入蔗糖溶液中蔗糖溶液：300g蔗糖+1000ml蒸馏水（用玻璃棒在烧杯中不断搅拌，适当加热直至溶解），然后放入冰箱中冷藏（一旦变冷即可使用）倒掉高尔基溶液，将脑组织在滤纸上轻轻吸干，用蒸馏水冲洗广口瓶，放入3/4蔗糖溶液（有足够空间容纳脑组织），然后将脑组织放入广口瓶中（脑组织会漂浮起来），放入冰箱储存。
高尔基体荧光染料
高尔基体荧光染料介绍高尔基体是细胞内一个重要的细胞器，它参与多种细胞重要的生物过程，如蛋白质合成、蛋白质修饰以及细胞质内信号传导。
高尔基体的功能与结构密切相关，而高尔基体荧光染料则是研究高尔基体的重要工具之一。
高尔基体荧光染料的作用高尔基体荧光染料可以用来标记高尔基体的位置和形态，帮助科学家观察和研究高尔基体在细胞内的分布和运动。
通过荧光显微镜观察，可以更清晰地了解高尔基体的结构和功能。
常见的高尔基体荧光染料1.BODIPY染料：BODIPY（boron-dipyrromethene）染料是一类荧光发色团，具有较高的荧光量子产率和光稳定性。
BODIPY染料可以被用来标记高尔基体，在荧光显微镜下呈现出明亮的荧光信号。
2.刚果红：刚果红是一种常用的生物染料，也可用来染色高尔基体。
刚果红染料可以与高尔基体内的特定蛋白结合，形成红色的荧光信号，从而标记高尔基体的位置。
3.Golgi-Tracker红：Golgi-Tracker红是一种专门用于标记高尔基体的荧光染料，其结构具有亲和力，能与高尔基体膜结合。
Golgi-Tracker红染料发出红色荧光，可被广泛应用于高尔基体的研究。
高尔基体荧光染料的使用方法在使用高尔基体荧光染料时，需要注意以下步骤：1.细胞培养：首先需要将细胞培养在适当的培养基中，使其在适宜的条件下生长。
2.染料处理：将适当浓度的高尔基体荧光染料加入培养基中，与细胞共同培养一段时间，一般为30分钟至1小时。
3.洗涤：将培养基中的荧光染料洗涤掉，以避免对后续观察产生干扰。
4.固定：使用适当的固定剂固定细胞，以保持其形态和结构。
5.倒置荧光显微镜观察：使用倒置荧光显微镜观察染色后的细胞，通过相应波长的荧光滤光片可以观察到高尔基体的亮度和位置。
高尔基体荧光染料在研究中的应用高尔基体荧光染料在细胞生物学和病理学研究中有广泛的应用，下面列举几个例子：1.研究高尔基体动态变化：通过观察高尔基体荧光信号的变化，可以研究高尔基体在细胞分裂、融合等过程中的动态变化，揭示其在细胞活动中的作用。
高尔基染色中文说明书
下面是FD 快速高尔基染色试剂盒（PK401）中文版的说明书，仅供参考：FD Rapid GolgiStain TM KitFD快速高尔基染色试剂盒神经元和胶质细胞形态学研究的完整Golgi-Cox染色体系使用手册中文版PK401/PK401A仅用于体外研究不能用于诊断或其它用途I. 介绍Golgi-Cox浸染法是研究神经元和胶质细胞正常和非正常形态最有效的方法之一。
使用Golgi 技术，在药物处理过的动物脑中和因神经疾病死亡的病人脑中发现了神经树突和树突微小的形态改变。
然而Golgi染色法的不可靠性且费时已成为这种方法广泛应用的障碍。
FD Rapid GolgiStainTM Kit(FD快速高尔基染色法)是根据Ramón-Moliner，Glaser和Van der Loos所阐述的方法原理设计的。
该试剂盒不仅极大地改进并简化了Golgi-Cox技术，而且被证实在显示神经元和胶质细胞，尤其是树突棘的形态细节极为灵敏可靠。
启维益成的FD Rapid GolgiStainTM Kit已被广泛测试并用于数种动物脑及去世病人的脑。
II. 试剂盒组分室温保存PK401A PK401溶液A 125 ml 250 ml溶液B 125 ml 250 ml溶液C 125 ml x 2 250 ml x 2溶液D 125 ml 250 ml溶液E 125 ml 250 ml琉璃样品回收器 2 2天然毛画笔 2 2滴瓶 1 1塑料镊子 1 1使用手册 1 1III. 需要但未包括在试剂盒里的物品1. 双蒸水或Milli-Q水2. 塑料/玻璃管或瓶3. 组织学耗材：明胶包被的显微镜载玻片（Cat.#PO101）盖玻片染色罐乙醇二甲苯树胶封片剂Permount®光学显微镜IV. 安全操作注意事项1. FD Rapid GolgiStainTM Kit仅用于体外研究，不能用于诊断或其它应用。
2. 试剂盒所包含有试剂是有毒的，吸入或接触皮肤是有害的，如果吞咽可能是致命的。
大鼠脑组织高尔基染色三种制备方法的比较
大鼠脑组织高尔基染色三种制备方法的比较王蕾;张芳;汤仁仙;张冠群;牛海晨【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》【年(卷),期】2017(033)001【总页数】3页(P113-115)【关键词】脑组织;高尔基染色法;冷冻切片;振动切片;石蜡切片【作者】王蕾;张芳;汤仁仙;张冠群;牛海晨【作者单位】徐州医科大学基础医学院形态学实验教学中心,徐州221004;徐州医科大学基础医学院形态学实验教学中心,徐州221004;徐州医科大学基础医学院形态学实验教学中心,徐州221004;东南大学医学院附属徐州中心医院神经内科,徐州221009;徐州医科大学基础医学院遗传学教研室,徐州221004【正文语种】中文【中图分类】R441873年意大利著名的神经解剖学家卡米洛·高尔基发明硝酸银染色法，从此可以定性定量地观察神经元的形态［1］。
随后 Cox等［2－4］对高尔基染色法的固定液和染色液进行改良，提高结果的可视性，但初学者选择合适的染色方法仍较为困难。
本实验采用相同的固定、染色和显色液，采用不同的制作方法（冷冻切片、石蜡切片、振动切片）进行大鼠脑组织高尔基染色，比较三种制作方法各自的优缺点，为科研实验和制作典型的教学示教切片提供可选方法。
1.1 动物SD大鼠 3只，体重220～240 g，实验操作经徐州医科大学动物伦理审查委员会批准。
1.2 取材首先SD大鼠经10%水合氯醛（国药30037516）腹腔注射进行常规麻醉；然后用生理盐水灌注，去除血液直至澄清；再立刻断头，小心取出3个脑组织，将脑组织根据所需部位，冠状切面修成0.5 cm厚的组织块。
1.3 固定本实验所采用的固定液、染色液和显色液均来自 Genmed的高尔基快速染色试剂盒。
将修好的组织块立刻放入装有10 m L固定液 A和10 m L固定液 B 的混合液离心管中，室温下避光浸泡、孵育2周。
1.4 制作方法（1）石蜡切片：将固定好的脑组织取出，用去离子水漂洗2次，放入装有 70%乙醇溶液的离心管中，依次梯度乙醇脱水，70%乙醇 24 h，80%乙醇溶液8 h，95%乙醇溶液Ⅰ6 h，95%乙醇溶液Ⅱ5 h，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各2 h，用二甲苯Ⅰ、Ⅱ各15 min透明［5］。
高尔基体的光镜观察(5.0版本)
• 5.3石蜡包埋：用石蜡浸渍组织并铸制成坚实的蜡 块。
四，实验步骤
• 6 切片6μm
四，实验步骤
• 7 复染 • 7．1 脱腊（依然使用二甲苯）并将切片投 至70％乙醇中。 • 7．2 用1％蕃红酒精液复染30min。 • 7．3彻底脱水（迅速用35%50% 60% 70% 80% 95% 100%乙醇脱水）。注：
• 本小组展示结束， • 谢谢大家捧场！！！
高尔基体的光镜观察
最后一组
梁惠琳 程立 胡洋洋 史千林 蔡杰 徐锋
一，认识高尔基体
• 高尔基体最早发现于1855年。 • 1889年，意大利医生Golgi用硝酸银染色法，在猫 头鹰和猫小脑的蒲金野氏细胞(一种神经细胞)中， 一种嗜银的网状结构，由于存在于细胞内质，高 尔基便将其命名为内网器。
• 20世纪50年代后，电镜的使用，才肯定了高尔基 体的真实存在及其结构。 • 后人为纪念他，改称为：高尔基体(Golgi body)。 • 形态结构和组成复杂，学者们现一般称：高尔基 复合体。
木质化、栓质化和角质化的细胞壁及细胞核中的染色质和 染色体染成红色。
三，实验试剂
• 固定液：硝酸铀 1g + 40％中性甲醛 15ml + 蒸 溜水85ml • 浸泡液：1.5％硝酸银水溶液（棕色磨口瓶中 保存） • 还原液：对苯二酚1．5g + 40 ％甲醛15ml 蒸 溜水100ml + 无水亚硫酸钠0.5g • 复染液： ：蕃红1g + 70％酒精100ml • 不同浓度梯度的酒精（用于脱水）；蒸馏水
一，认识高尔基体（主要功能）
• 最典型的标记酶——糖基转移酶
• 包括：甘露糖转移酶、N-乙酰半乳糖转移酶、N乙酰葡萄糖胺转移酶、岩藻糖转移酶、半乳糖转 移酶以及唾液酸转移酶； • 处于不同部位的糖基转移酶种类也不相同 • 糖基转移酶的作用：把寡糖转移到蛋白质上，形 成糖蛋白。 • 高尔基池含有催化脂类糖基化的磺基-糖基转移酶
全组织神经元高尔基法染色试剂盒产品说明书(中文版)
全组织神经元高尔基法染色试剂盒产品说明书（中文版）主要用途全组织神经元高尔基法染色试剂是一种旨在使用亲银还原技术，分析新鲜组织块里神经元（neuron）、锥体细胞（pyramidal cell）、胶质细胞（glia cell）、少突触胶质细胞（oligodendrocyte）和其它突起（process）尤其树突（dendrites）形态学的权威而经典的技术方法。
该技术经过精心改良传统方法、成功实验证明的。
主要适用于各种新鲜或冰冻脑组织的相关神经细胞检测。
广泛用于动物脑神经病理生理解剖学的研究。
产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，显色清晰。
技术背景意大利科学家高尔基（Camillo Golgi）于1873年发明了神经细胞黑色反应的浸银染色技术，从而开辟了神经系统形态结构、演变、单系发生、构建以及疾病等学科研究，并建立了神经学说。
脑神经组织经固定，亲银染色后，呈现部分神经细胞完全染色，而其它神经细胞没有任何着色的高度选择性染色。
产品内容固着液（Reagent A）200毫升氧化液（Reagent B）100毫升营养液（Reagent C）100毫升强化液（Reagent D）100毫升清理液（Reagent E）100毫升染色液（Reagent F）30毫升产品说明书1份保存方式保存在4℃冰箱里，避免光照；有效保证3月用户自备无菌手术刀和镊子：用于解剖动物脑组织小型玻璃染色缸或玻璃培养皿：用于组织处理的容器火棉胶（collodion）：用于保护固着处理后的组织样品切片机：用于组织切片明胶化载玻片和盖玻片：用于切片后铺片光学显微镜：用于切片染色后观察分析实验步骤一、样本固着处理1．常规麻醉动物和手术（建议：使用生理盐水由心脏处灌注三次，每次60毫升，去除血液直至澄清）2．使用适量的固着液（Reagent A）灌注处理3．即刻小心取出脑组织4．小心放进到20毫升固着液（Reagent A）里5．室温下浸泡孵育1小时6．用无菌手术刀将脑组织切成0.5厘米厚的组织块7．即刻用无菌镊子夹起组织块8．小心转移到20毫升氧化液（Reagent B）里（20毫升/2块组织块）9．室温下浸泡孵育2周，避免光照10．小心转移到20毫升营养液（Reagent C）里11．室温下浸泡孵育48小时，避免光照12．小心转移到20毫升强化液（Reagent D）里13．室温下浸泡孵育48小时，避免光照（注意：可以孵育1周）14．用绵纸吸干组织快二、样本染色处理1．准备1个6孔细胞培养皿2．放进上述预处理的动物组织样本3．小心加入3毫升清理液（Reagent E），清洗组织样本4．室温下孵育2分钟5．小心抽去清理液6．重复实验步骤3至5一次7．加入3毫升染色液（Reagent F）到培养孔里，浸没整个组织（注意：出现明显沉淀，换液一次）8．室温下孵育24小时，直至呈现黑色，即刻终止，避免光照（注意：期间可以在显微镜下观察）9．小心抽去染色液（Reagent F）10．小心加入3毫升清理液（Reagent E），清洗组织样本11．室温下孵育2分钟12．小心抽去清理液13．（选择步骤）进行复染操作（建议使用甲苯酚紫（CRESYL VIOLET）复染试剂盒－HL80052）14．用绵纸吸干组织快15．即刻使用用户自备的火棉胶（collodion）包埋16．取出组织块，进行缓慢切片，为20至100微米厚，并铺片在明胶化载玻片上17．在一般光学显微镜下观察：神经元、锥体细胞、胶质细胞、少突触胶质细胞（椭圆形如同串珠）和其它突起，呈现黑色（如果复染――细胞核呈现蓝色，胞浆尼氏（体）物质呈现粉红至紫色）注意事项1．本产品为10次操作2．操作时，须戴手套3．染色液（Reagent F）避免光照4．建议使用玻璃染色缸或玻璃培养皿5．整个操作，在避光状态下进行6．染色完成后，铺片须使用明胶化载玻片，否则会掉片：第一用毛笔涂刷；第二保持湿润；第三用PARAFIN 包裹后压片7．切片建议100至200微米，过厚和过薄不利于检测神经细胞8．全组织染色存在其染色不均匀、组织内部染色渗透困难等局限9．样品染色后保存，避免光照10．本公司提供系列组织细胞神经系统成分染色试剂产品质量标准1．本产品经鉴定性能稳定2．本产品经鉴定显色清晰。
高尔基染色切片厚度
高尔基染色切片厚度高尔基染色切片厚度，顾名思义，是指在高尔基染色过程中，切片所承受的厚度。
高尔基染色是一种常用的组织学染色方法，主要用于观察细胞和组织的结构。
在这个过程中，切片厚度是一个非常重要的参数，直接影响到观察结果的清晰度和准确性。
首先，我们来了解一下高尔基染色的基本原理。
高尔基染色是一种针对细胞内蛋白质的染色方法，通过染色剂与蛋白质的结合，使细胞内的蛋白质呈现出特定的颜色，从而暴露出细胞和组织的结构。
在这个过程中，切片厚度的大小直接影响到染色剂进入细胞的能力，以及染色效果的呈现。
接下来，我们讨论一下切片厚度对高尔基染色效果的影响。
如果切片厚度过大，染色剂进入细胞的速度和范围会受到限制，导致染色效果不均匀，甚至无法观察到细胞内部的结构。
反之，如果切片厚度过小，染色剂容易进入细胞，但过多的染色剂可能会导致染色过度，使细胞和组织的结构变得模糊不清。
因此，掌握适当的切片厚度是获得良好高尔基染色效果的关键。
那么，如何才能获得合适的高尔基染色切片厚度呢？首先，切片时要保持刀片的锋利，避免因刀片不锋利导致的切片厚度不均匀。
其次，切片速度要适中，过快或过慢都可能影响切片厚度。
此外，染色过程中的温度和湿度也会影响染色剂的渗透能力，进而影响到切片厚度。
因此，在染色过程中，要严格控制温度和湿度，确保染色剂的均匀渗透。
总之，高尔基染色切片厚度是影响染色效果的重要因素。
要想获得清晰、准确的染色结果，就需要掌握适当的切片厚度，并严格控制染色过程中的各种条件。
只有这样，才能充分发挥高尔基染色技术在组织学研究和临床诊断中的应用价值。
在我国，高尔基染色技术已经得到了广泛的应用，并在不断推动生物学、医学等领域的发展。
通过对高尔基染色切片厚度的深入研究，我们将为细胞和组织的观察提供更加精确、高效的方法，为相关领域的科学研究和临床应用贡献力量。
高尔基染色法
高尔基染色法
高尔基染色法（Golgi staining）是一种常用的生物染色技术，用于显示和研究细胞内的高尔基体（Golgi apparatus）。
高尔基体在细胞内扮演着非常重要的角色，负责对蛋白质进行加工、分类和运输。
高尔基染色法的原理是通过使用特殊的染料将高尔基体染成特定的颜色。
最常见的染料是硫酸氨基苯汞（ammonium mercuric thiocyanate），在染料处理后，高尔基体通常会呈现棕色或黑色。
步骤：
1. 样品制备：将需要染色的细胞样品固定在玻璃片上，通常使用甘氨酸或乙醇固定。
固定过程有助于保持细胞结构，以便进行染色。
2. 染色：将固定好的样品放入装有硫酸氨基苯汞的染色液中，染色时间通常为15-30
分钟。
3. 脱水：将染色好的样品放入不同浓度的乙醇溶液中进行脱水，逐渐增加乙醇浓度，直到样品中的水分完全被去除。
4. 封片：将脱水后的样品放入装有覆盖剂（如加拿大树胶）的载玻片上，并盖上盖玻片。
覆盖剂用于保护样品并防止染料扩散。
5. 显微镜观察：将封好的载玻片放在显微镜下观察，可以看到高尔基体呈棕色或黑色。
通过高尔基染色法，科学家们可以更好地了解高尔基体的形态、结构和功能，以及其在细胞内与其他细胞器之间的相互作用。
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8．流水漂洗后贴片于预先涂有 1 %明胶并烘干的载玻片上，沾干水分。
9. 快速经酒精梯度脱水： 70 % - 80 % - 90 % - 95 % - 95 %- 100 %-100 %，每次 5
min，用漏斗回收酒精。 10. 经二甲苯漂洗 10 min，树胶封片，晾干。
11、普通显微镜（ 1501），1000 倍。
高尔基染色
一 . 实验原理 重铬酸钾与硝酸银发生反应，生成黑色的铬酸银沉淀，由于组织的嗜银性而沉
积于神经元中。
二 . 药品、试剂、仪器 药品和试剂：水合氯醛、重铬酸钾、 40 %甲醛、硝酸银、火胶棉、二甲
苯、梯度酒精、树胶、明胶 仪器设备：输液器、染色缸、手术器械、 Leica 震荡切片机、毛笔
三 . 实验步骤
待 1—2 小时，至此已完成灌注过程。
媒染液配方；
水合氯醛 50 g
重铬酸钾 50 g
蒸馏水
400 mI
待以上成分溶解后加 40 %甲醛液 Nhomakorabea00m1 摇匀，最后加蒸馏水 1000m1。
5．开颅取出所需组织。用刀片将组织冠状切为厚约 浸泡，置暗处避光，室温 3 天。
5 mm 的小块，仍用媒染液
6．换瓶用 1.5％硝酸银水溶液浸泡镀银，置暗处 3(7)天。每日换新银液一次 (换 新的瓶子，用锡箔纸包好，不能用镊子，用长的棉签杆 )，并及时摇动瓶，使镀 银充分。
统计方法 : 在 100 倍油镜下对感兴趣区域的神经元的树突棘进行计数， 以单位 长度树突上的棘数量作为指标进行 t-test (两组 )或方差分析 （多组），以考察某 因素对神经元的形态可塑性的影响。
五 . 注意事项
1. 开胸时注意保持心脏的完整性。
2. 灌流时最好将输液器针头置于主动脉中（从心尖垂直进针） ，要注意区别主动
液换成 l0 ％甲醛生理盐水溶液继续灌注进行固定。 这一过程中前液使血管扩张，
后液使组织充分固定。 因此， 在灌注固定液时， 宁可多用固定液使之充分将前液
置换。
3．固定液灌注充分（约需 200-300 ml）后，用血管钳夹住右心耳，静候 1—
2 小时。
4. 打开血管钳，用下列媒染液灌注，至流出液显浓厚桔红色，再夹住右心耳静
7．用火棉胶包埋组织块 （1 min）后用 Leica 震荡切片机切为厚度为 50μ m （ 100-150um,50um 效果不太好）的切片。切片再浸于 2％（ 3.5%）重铬酸钾水
溶液漂洗 10 min。 如果不长期储存，可以直接将组织放在载玻片，盖一个盖玻片，直接观察，但是
必须当天做完，如果长期保存按下面操作进行。
防滑玻片制备： 明胶硫酸铬钾法是将 2.5g 明胶加热溶于 500mL 蒸馏水中 ,完全溶解冷却后加入 0.25g硫酸铬钾搅匀充分溶解后 ,将玻片浸泡溶液中 30min,取出载玻片控尽液体后 置入温箱烤干备用 ;
脉和上腔静脉。 用动脉夹将针头连同心脏一道夹牢后进行灌注。 下图为心的正面
观
。
3. 用 0.5 %亚硝酸钠的生理盐水灌注时先快后慢， 快时液体流动如线状。 约需 100 ml 。 4. 配制甲醛溶液和灌流都在通风橱中操作。 5. 固定液灌注充分的标志为动物肢体僵硬。 6. 配制媒染液时，重铬酸钾常温下较难溶，可于 37 OC 浴槽中搅拌配制。 7．硝酸银水溶液每次现配现用。用媒染液浸泡和镀银时用锡纸将瓶完全包住。 8．震荡切片时使用双蒸水。 9. 在涂有 1 %明胶的载玻片上贴片时经常出现脱片的现象， 可尝试在载玻片上涂 0.01 %多聚赖氨酸并烘干再用于贴片。
四 . 评价指标、统计方法 神经元及胶质细胞的胞体和突起均呈棕黑或黑色。 此法的成功率较高。 这类方法 之所以经久不衰主要是因为 1.所显示的细胞成分，色调浓重，易于分辨； 2.未被 染出的细胞无色，致背底清澈色调很淡，对比度极好； 3.操作过程比较简单。下 图是用 806 实验室的正置显微镜配备的照相机拍摄的照片。 可以黑白或彩色照片 输出。
1. 10 %水合氯醛以 0.1 ml/10 g 体重经腹腔麻醉小鼠。 一般 2-3 min 后出现麻醉效
应。若个别小鼠麻醉效果不好，可少量追加麻药。
2. 灌注与固定 用 0.5 ％亚硝酸钠的生理盐水溶液 （现配现用）从小鼠左心室
灌注，同时打开右心耳，至从右心耳流出的液体无血色（ 5-10 min），遂将灌注