实验八 质粒DNA的小量制备
实验八质粒DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测
当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复 pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两 条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准 确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此 已完全分开，复性就不会那么迅速而准确， 它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体 DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复 合物等一起沉淀下来而被除去。
2.简要叙述酚氯仿抽提ＤＮＡ体系后出现的现象及其成 因?
3.沉淀ＤＮＡ时为什么要用无水乙醇及在高盐、低温条 件下进行？
质粒3种构型
1.超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalelltly closed circular DNA，简称cccDNA); 2.开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA的一条链 断裂，(open circular DNA，简称ocDNA); 3.线形质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 两条链发 生断裂(linear DNA，简称LDNA)。
2. 琼脂糖凝胶电泳检测DNA
一、实验目的
通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测 DNA的方法和技术。
二、实验原理
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子 筛效应。DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负 电荷，在电场中向正极移动。由于糖—磷酸骨架在 结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有 等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方 向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速 度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构 型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度 不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对 分子质量的对数值成反比关系。
２．取1.4 ml培养液至Eppendorf管中，12000rpm离心30 秒，弃上清，取沉淀。
３．将细菌沉淀悬浮于100µl预冷溶液Ⅰ中，振荡混匀。 ４．加入200µl溶液Ⅱ，缓慢颠倒离心管，混匀（勿剧烈
质粒小量提取
质粒DNA的小量制备
方法
1.接种一个质粒菌落到5ml LB（含相关抗生素）培养液中,37℃摇床生长至饱和状态（过夜）。
2.取1.5m1菌液高速离心20秒 (或6000转/分)。
3.垂悬沉淀在1O0ul GTE溶液中，室温5分钟。
4.加2O0ul NaOH/SDS溶液，混匀置冰浴5分钟。
5.加3M KAC或3M NaAc l5Oul，旋涡混匀，置冰上5分钟。
6.高速离心3分钟，转移0.4m1上清到另一微型离心管中，加0.8m195%乙醇或无水乙醇或0.6倍体积异丙醇，置室温15~20分钟。
7.高速离心3分钟，弃上清，沉淀用70%乙醇洗一次高速离心弃上清，沉淀置37℃孵箱使乙醇挥发。
8.每管加30ul TE或SDW溶解沉淀后，封口，或加RNaseA消化RNA后再纯化，置-20℃备用。
9．用1%的琼脂糖凝胶电泳提取液，于凝胶成像系统观察结果。
小量提取质粒
Protocol小量提取质粒DNA：1. 准备：灭1.5 ml离心管、牙签、试管。
准备溶液STET（加溶菌酶）、异丙醇、1×TEwith RNase（pH8.0）。
灭过菌的试管每根分2 ml培养液2. 连接产物转化涂板，放于37 ℃中培养12－18 h，取出，挑取单克隆，放于试管中，于37 ℃摇床培养8-12 h。
3. 将摇好的菌到入灭好的1.5 ml离心管中，离心8000 rpm，30 s。
4. 弃上清，到扣于吸水纸上控干。
5. 加入250 μl STET(STET: Lysozyme 10:1)，震荡重悬。
6. 置于100 ℃中煮1.5－3 min（时间视菌量而定），离心13500 rpm，5 min。
7. 用灭好菌的牙签挑去管底粘稠状蛋白。
8. 加250 μl异丙醇，颠倒混匀后，离心13500 rpm，5 min。
9. 去上清，放于吸水纸上控干，约10 min左右。
10. 加TE （TE: RNase 1000:1）20-50μl（视沉淀量而定）。
中量提取质粒DNA：1. 准备：灭菌：1.5 ml EP管，烧瓶，50 ml离心管。
准备溶液：P1、P2、P3、异丙醇、5 M 盐酸胍、1×TE（pH 8.0）、new wash。
2. 从培养好的平板上挑取单克隆，烧瓶置于37 ℃摇床培养12-18 h。
3). 将培养好的菌液到入灭好50 ml离心管中，离心4500 rpm，5 min。
4). 弃上清，控干。
加1.5 ml P1（P1: RNase 100:1）震荡重悬，加1.5 ml P2颠倒混匀（操作轻缓。
混匀后可见溶液澄清粘稠），加1.5 ml P3颠倒混匀（P2和P3之间反应时间不要超过5 min。
混匀后可见絮状沉淀）。
5. 将溶液分装到1.5 ml管中，离心13500 rpm，5 min。
6. 将每管上清分到两管中，在新管中加入750 μl异丙醇，颠倒混匀多次，离心13500 rpm，5 min。
质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳实验报告
质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳一、前言质粒质粒是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子(即细胞附殖粒、又胞附殖粒)。
大部分的质粒虽然都是环状构型，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物（多为原核生物）中，乃至于植物的线粒体等胞器中。
然而，1984年，在Streptomyces coelicoler(天蓝色链霉菌)等放线菌以及在Borrelia hermsii(赫氏蜱疏螺旋体)等原核生物中，又相继发现线形质粒。
天然质粒的DNA长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。
质粒天然存在于这些生物里面，有时候一个细胞里面可以同时有一种乃至于数种的质粒同时存在。
质粒的套数在细胞里从单一到数千都有可能。
有时有些质粒含有某种抗药基因(如大肠杆菌中就有含有抗四环素基因的质粒)。
有一些质粒携带的基因则可以赋予细胞额外的生理代谢能力，乃至于在一些细菌中提高它的致病力。
一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。
它是基因工程最常见的运载体。
质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型和松弛控制型。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不能复制，通常每个细胞内只含有一个或几个质粒分子，如F因子。
后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，一般在20个以上，如Col E1质粒。
在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时，细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制，紧密型质粒复制停止，而松弛型质粒继续复制，质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个，此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。
把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体。
细菌质粒是重组DNA 技术中常用的载体。
质粒分子本身是含有复制功能的遗传结构。
质粒还带有某些遗传信息，所以会赋予宿主细胞一些遗传性状。
质粒DNA的小量制备
质粒DNA的小量制备准备工作：细菌培养：挑取单菌落，接种到3-5ml适宜的液体培养基(如氨苄青霉素抗性的标准LB培养基)中，37℃震荡培养过夜。
注：（1）最好在细菌的对数生长晚期时提取。
过早则质粒得率太低，过晚则会有杂菌污染，或得到的质粒杂质太多，影响其后的酶切、电泳等处理；（2）某些严紧型质粒(如pBR322)需要在进入对数生长中期后，在细菌培养物中加入氯霉素继续培养，以提高产量。
具体步骤：1、细菌的收获：将1.5ml菌液倒入微量离心管中，12000g离心30秒，吸去培养液。
上清要务必吸取干净，否则会影响质粒的质量。
必要时可以离心2次。
2、将细菌沉淀重悬于150μl用冰预冷的溶液Ｉ中，加入1/50体积RNaseA贮存液，剧烈振荡，使之完全分散。
溶液Ｉ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LT ris•Cl(pH8.0)，10mmol/LEDT A(pH8.0)不含DNA酶的RNaseA：10mg/ml，TE配制，煮沸15~30min，-20℃分装贮存注：（1）溶液Ｉ高压蒸气灭菌后，贮存于4℃；（2）葡萄糖可以由NaCl代替，以利于储存；但提取大于15kb的质粒，应将细菌悬于等渗蔗糖溶液中，并用溶菌酶处理；（3）务必使细菌沉淀完全分散，以利于碱液作用充分；（4）震荡时可以在离心管中加入牙签或枪头，提高效率；（5）配制RNaseA贮存液时，煮沸时间不宜过长或过短；（6）溶液Ｉ每2个月重新配制1次。
3、加200μl溶液Ⅱ，颠倒混匀。
溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH，1%SDS注：（1）若菌体裂解得充分，则溶液会变得很粘稠；（2）不要剧烈震荡，否则会混入基因组DNA；（3）每2个月重新配制1次。
4、加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ，轻微震荡混匀溶液Ⅲ：5mol/Ｌ乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml注：（1）所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L，pH4.8左右；（2）尽量不要有大的块状沉淀，以利于下步离心；（3）每1个月重新配制1次，并分装贮存于小口瓶中。
质粒DNA的制备
导论质粒DNA的小量制备质粒ＤＮＡ的大量制备质粒ＤＮＡ的纯化一、导论已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA，这些方法都含有以下3个步骤：细菌培养物的生长。
细菌的收获和裂解质粒DNA的纯化。
（一）细菌培养物的生长从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。
现在使用的许多质粒载体（如pUC 系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。
此时，不必造反性地扩增质粒DNA。
然而，较长一代的载体(如pBR322)由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。
氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。
这样，像pBR３２２－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。
多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml)已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。
（二）细菌的收获和裂解细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。
选择哪一种方法取决于３个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。
尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。
1)大质粒(大于15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。
将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SD S一类去污剂溶解球形体。
这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。
小提质粒
质粒DNA的小量提取溶液配制配置储液（两周用量，小提）1. 10N NaOH 20ml:8g NaOH溶于16ml单蒸水，定容到20ml,注意橡胶塞保存。
2. LB培养基500ml:450ml单蒸水+蛋白胨5g+酵母浸提物2.5g+NaCl5g,混匀，加入10N NaOH 调PH至7.0，定容至500ml,分装，用于养细菌3. 0.9%NaCl 30ml4. 3M NaAc 10ml，调节PH至5.25. 甘油：用于保种6. 2-5高压灭菌7. 5MLiCl 25ml(4°C保存)8. 0.5M葡萄糖20ml（4°保存，避免长菌）9．0.5M Tris-Cl PH 8.0 30ml ：1.815gTris碱溶于24ml单蒸水，震荡后加入10N NaOH调节PH至8.0，然后定容至30ml.10. 0.5M EDTA 用10N NaOH调PH至8.0 （约2.6ml,EDTA不易溶解，起初乳白色，加入NaOH可助溶逐渐呈透明，故溶液还是乳白色时所测PH一般不准）11. 10%SDS 40ml反应吸热，故先加水再加试剂，SDS为强去污剂，使用时戴口罩，注意避风。
12. 5M NaAc 30ml 反应吸热，注意试剂是否带有结晶水。
13.无水乙醇-20°C保存14. 50×TAE 50ml15.氨苄青霉素1000×，超净台内配置（一）LB培养基每1000 mL加分析纯NaCl 10 g，蛋白胨10 g，酵母粉5 g，用ddH2O配制，再用10 M NaOH调pH至7.4（100 mL一般加450 µL，亦可不调），高压灭菌冷却后使用。
固体培养基加入琼脂粉1.5%琼脂粉。
10 M（或N）NaOH配制方法是称200 g NaOH加300 mLddH2O，搅拌充分溶解后定容至500 mL。
（二）溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ溶液Ⅰ：葡萄糖50 mmol/L，EDTA 10 mmol/L，Tris-HCl 25 mmol/L，pH至8.0。
质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳实验报告#特选资料
质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳实验报告#特选资料DNA（Deoxyribonucleic Acid），中文名叫脱氧核糖核酸，是生命活动的基础物质。
它是各种生物体的特征物质，在细胞的核内存在，也是遗传信息的载体。
病毒DNA也用于各种研究和检测，尤其是在病毒的鉴定及转基因技术中发挥着重要作用。
因此，定性病毒DNA提取及少量DNA琼脂糖凝胶电泳实验都成为实验室检测中必不可少的一项实验内容。
本实验采用DNA提取试剂盒（TOYOBO）进行DNA的提取，特点是无色素、无皂、无蛋白、简便快捷，可以获得高质量的脱氧核糖核酸产物并提高检测效率。
该试剂中的抗腐蚀劑、抑制核糖核酸的酶和其他特殊的保护剂，能够有效防止DNA降解，为提取保护DNA。
本实验做法如下：用离心机将试管内管壁完全湿润，然后在试管中加入灭菌液中离心5min，在电烙铁上将试管放置至400℃时将管口朝内容物烤，使病毒落入管内，加入溶解液将病毒完全溶解，加入避免pH影响的预测液，再加入 DNA提取试剂盒内的DNA提取液，再加入离心液，速度2000rpm/min，离心15min，将DNA分离，收集上清液，即可完成DNA 的提取。
下一步，将提取的DNA溶液经过超滤处理，清洗去盐、去酵氨酸和其他病毒物质，然后将收集的DNA溶液加入加热消化液（20ul加强热金属离子消化液），任务反应器中加入DNA溶液，改变反应器温度逐渐提高，以到达95℃时，保留10min，完成加热消化，之后将消化液在室温空气中反应30min，待反应液体质清澈后，收取液体。
最后，加入检测凝胶（1.2%琼脂糖凝胶）及TBE解剖液，调节溶液酸碱度至7.4,凝胶细胞中加入示性荧光物质即蛋白质标记剂，加入磁控脱水，进行凝胶电泳实验，常用50V ——200V，应用1.0mh氯化钠池，当特征带迁移至仪器中央时，实验完毕。
经上述实验，本实验成功提取了少量 DNA，并通过DNA琼脂糖凝胶电泳实验证实，获得了琼脂糖凝胶电泳图像，数据获取良好印证实验结果满足实验要求。
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当以pH4.8的KAc高盐缓冲液去调节其pH至中性 时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在 溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网 状结构。 通过离心，染色体DNA、不稳定的大分子RNA、 蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
降解的小分子RNA可通过Rnase A处理去除
14. 37 ℃ ，保温30min，消化RNA，取出置-20℃保存。
五.实验结果
通过凝胶电泳和紫外分光法检测抽提的质粒 浓度及纯度。
六、思考题
溶液I、溶液II和溶液III在提取质粒的过程中 的作用分别是什么？
实验八
质粒DNA的小量制备
一般操作步骤：
培养细菌使质粒扩增
碱变性法
收集和裂解细菌
煮沸法 去污剂法
有机溶剂法
分离质粒DNA
一、实验目的
掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理 熟悉碱裂解法提取质粒DNA的方法
二、实验原理
分离质粒DNA需要去除的：
大肠杆菌染色体DNA 蛋白质 RNA
碱变性法抽提质粒的原理
溶液Ⅱ(细菌裂解液）： 0.4M NaOH 2% SDS 溶液Ⅲ: 1.32M KAc pH 4.8 (用醋酸调）
四、实验具体步骤
1. 挑取转化平板上的单菌落至2ml LB培养液中（含 Amp 100μg/ml）， 37℃，250rpm，培养过夜。 2. 取1.5ml培养物至指形管中，12,000rpm，30s。 3. 吸去上清，使沉淀尽可能干燥。
4. 将细菌沉淀悬浮于200μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡。 5. 加200μl溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管口，快速颠倒 5次以混匀内容物。冰上放置。 6. 加入200μl溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，温和振 荡，冰上放置3-5min。
7. 4℃，12,000rpm，5min，将上清转移至另一离心管 中。 8. 加入等体积酚/氯仿（1:1），振荡混匀，4℃， 12,000rpm ，2min，将上清转移到另一离心管中。 (此步也可不做) 9. 加入2倍体积的无水乙醇，室温静置2min。
碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒 DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
在EDTA、（溶菌酶）和表面活性剂的存在下，经 碱处理溶菌， 同时在pH高达12.0~12.6 的碱性条件下，染色体 DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒 DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状 的两条互补链不会完全分离。
未除净的蛋白质可通过苯酚/氯仿抽提除去。
三、实验材料
LB液体培养基、氨苄青霉素 溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、RNase A 、预冷无水乙醇 、 70%乙醇、 TE缓冲液 DH5-pCR2.1-Rv1791
提质粒用溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ源自溶液Ⅰ（细菌重悬液）： 50mM Tris-HCl 10mM EDTA pH 7.5
10. 4℃，12,000rpm ，5min。 11. 弃上清，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体 。 12. 用1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，弃上清，吸 干，在空气中干燥10min。 13. 加入30μl TE缓冲液（含20μg/ml RNase A ，不含 DNA酶），使DNA完全溶解。