植物基因工程实验技术

植物基因工程实验技术

编者: 赵燕

主审: 张学文

湖南农业大学植物科学实验教学中心

2007年4月

前言

基因工程是现代生物技术的核心，也是现代分子生物学研究的重要手段。掌握基因工程技术对于生物技术专业及其它生物学相关专业学生都很重要。

基因工程本身是由一系列分子生物学操作技术组成的系统性技术体系，本实验指导侧重于DNA重组操作，将基因工程操作的常用和核心技术组织起来，以为我校生物技术本科生及有关专业研究生基因工程实验提供简单而明确的指导。

为适应基因工程的飞速发展，一些生物技术公司匠心独运，开发出专门的试剂盒，使一些复杂的实验操作简单化了。这对于实验者来说自然是好事，但也使实验者动手胜于用脑。对于实验人员来说，一定应知其然并知其所以然，才会在实验中运用自己的知识予以创新性的发展。期望本实验指导不成为实验中的教条。

编者

2007年4月

目录

实验一大肠杆菌的对照培养、单菌落的分离及菌种保存 (3)

实验二强碱法小量制备质粒DNA (5)

实验三琼脂糖凝胶电泳 (7)

实验四植物总DNA的提取、纯化和检测 (9)

实验五DNA的PCR扩增 (11)

实验六植物总RNA的分离 (15)

实验七RT-PCR (17)

实验八体外重组分子的构建、筛选及检测 (21)

实验九植物表达载体的构建、筛选及检测 (22)

实验十植物遗传转化技术 (23)

附录: 实验中常用的仪器与器皿 (24)

实验一大肠杆菌的对照培养、单菌落的分离及菌种保存

大肠杆菌(Escherichia coli)是分子遗传学实验、基因工程操作中广泛采用的一种受体菌，它的遗传背景研究的比较详细，常用做寄主进行基因扩增及外源基因的表达。

一.实验目的:掌握大肠杆菌的对照培养、单菌落的分离及菌种保存方法。

二.实验原理:大肠杆菌除本身的核染色体外，往往还含有质粒(Plasmid)DNA，

这是一种双链闭合环状的DNA分子，大小在1Kb-200Kb左右，通常质粒DNA 带有利于细菌在某一特定环境下生存的酶的基因，而使寄主菌表现以下一些表现型:

1．对抗生素的抗性2．产生抗生素3．降解有机复合物4．产生大肠杆菌素5．产生内毒素6．产生限制修饰酶pUC19质粒上带有一个与大肠杆菌抗氨苄青霉素(Ampecillin)有关的基因，它能编码一种β-内酰胺酶，这种酶降解氨苄青霉素，从而消除了抗生素对细胞壁形成的抑制作用，不含这种质粒的细菌则不能在含抗生素的培养基上存活。

三．实验材料:E．coli InvaF'E．coli InvaF'(pUC19)

四．实验仪器、器皿及试剂:

仪器:超净工作台恒温培养箱高压灭菌锅恒温水浴锅微波炉等

器皿:(见附录)

试剂:琼脂酵母抽提物胰蛋白胨 Nacl 氨苄青霉素NaOH 等

五．实验步骤:

1. 配制培养基：

ａ．LB(Lurib-Bertani) media

酵母抽提物(Yeast extract) 5g/L

胰蛋白胨(trytone) 10g/L

Nacl 10g/L

加蒸馏水定容至1000ml调节pH值至7.0。

配制750ml固体培养基: 在上述液体培养基中，按15 g/L加入琼脂加热至充分熔化，即成固体培养基。

ｂ：50%的丙三醇: 取50ml丙三醇加入50mlddH2O至100ml。

将上述培养基和丙三醇溶液高温蒸汽消毒15磅20min

2. 倒平板:将固体培养基加热至充分熔化，待温度降至50℃以下凝固前，加入

Amp至100ug/ml摇动混匀，每平皿倒入25ml左右，此过程应进行无菌操作，另倒一不含Amp的LB平板。

3. 待培养基凝固以后，用接种环(灼烧消毒后)分别接种各一环贮存菌种:E.coli

InvaF'和 E.coli InvaF'(pUC19)于不含Amp的LB平板上和含Amp的LB 平板上,划线接种要防止划破培养基，划线方法如图所示:

第一次划线后接种环灼烧第二次划线起点与第一次如此在平板上

再进行第二次划线划线交叉，接种环灼烧后再划线5-6次

进行第三次划线

4. 接种完成后将培养皿倒置入培养箱37℃培养过夜，运用这种划线方法接种，

可以较好地保证单菌落的形成。

5. 比较两菌系在培养基上的不同反应。挑取:E.coli InvaF'E.coli InvaF'(pUC19)的

单菌落分别接种至含Amp和不含Amp的5ml LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。

6. 分别吸取0．5 ml菌液在无菌条件下，加入0．5 ml 50%丙三醇，置一灭菌的

冻干管中，混匀至-20℃保存。

思考题:

1. 平板培养细菌为什么要倒置培养?

2. 细菌的继代繁殖为何要强调单菌落分离?

3. 在固体培养基中怎样加入抗生素?

4. 简述单菌落分离的接种过程。

实验二强碱法小量制备质粒DNA

一．实验目的:了解基因工程操作中运载基因的载体，掌握最常用的提取质粒DNA的方法。

二．实验原理:碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。利用溶菌酶、强碱(NaOH)及表面活性剂(SDS)使细胞破壁、膜，释放出胞内染色体DNA，质粒DNA及其它物质，通过一系列的纯化过程:高盐除核DNA，苯酚-氯仿抽提变性蛋白和脂类，最后用异丙醇(或乙醇)沉淀出质粒DNA和RNA等，RNA再经RNase消化，得到质粒DNA，这种质粒DNA 可用作基因工程的载体，更广泛地用于重组子的鉴定。

三.实验材料: Ecoli InvaF'(pUC19)

四.实验仪器、器皿及试剂:

仪器、器皿(见附录)

试剂:1．溶液1(GTE) 50 mmol/l 葡萄糖

10 mmol/l EDTA-Na

2

25 mmol/l Tris-Cl (pH 8.0)

4mg/ml 溶菌酶

2．溶液2 200 mmol/l NaOH

1% SDS

3．溶液3 5 mol/l KAC 60 ml

冰乙酸 11．5ml

ddH2O 28．5ml

4．苯酚-氯仿

5. 异丙醇(或95%乙醇，100%乙醇)

6. 70%乙醇

7. TE (pH 8.0): 10 mmol/l Tris-Cl (pH 8.0)

1 mmol/l EDTA-Na2

8．RNase 1mg/ml Amp 100ug/ml