农杆菌介导的植物转基因技术
根瘤农杆菌介导植物转基因流程
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农杆菌介导遗传转化原理
!
冠瘿碱代谢基因
农杆菌转化植物的过程 •植物受伤部位酚类化合物的分泌 •附着（chvA、chvB） •VirA/G的双组分系统感受受伤信号 （signal to A Pi to G） •其他Vir基因的表达 •T-DNA链的切出（VirD1+VirD2；Border to Border） •T-complex的形成 •运输（从细菌中输出、进入入植物细胞、入入核） •整合
A
B
C
PCR（A）、RT-PCR（B）和 Southern（C）鉴定结果
影响植物农杆菌转化效率的因素 •植物品种（基因型效应）； •农杆菌菌株及载体； •起始材料； •侵染所用用菌浓度（OD值）； •共培养条件(温度、时间、光照、培养基成分)； •共培养之后的筛选方方式； 等等；
农杆菌介导的 植物遗传转化
农杆菌的分类 革革兰氏氏阴性菌、杆状； 按侵染植物的后果分为： •根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens） 形成冠瘿（crown gall） •发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes） 形成发根（hairy root）
按合成/代谢冠瘿碱（Opine）的种类，根癌农杆菌分为 ： •章⻥鱼碱（Octopine）型 •胭脂碱（Nopaline）型 •农杆碱（Agropine）型
The Plant Cell, Vol. 18, 3350–3352
冠瘿病的害处： 苗木木感病后发育受阻；生生⻓长缓慢；植株矮小小；严重 时叶片片萎蔫、早衰，甚至至死亡； 大大树受害后树势衰弱，生生⻓长不良，提前落叶，果实 变小小，树龄缩短。主干受害降低材质及工工艺价值。
农杆菌能够导致植物产生生冠瘿病的原因： Ti（Ri）质粒
•T-complex的转运 通过细菌细胞壁上由11个VirB蛋白白和VirD4组成的通 道从农杆菌向外输出
一种发根农杆菌介导的转基因杨树的构建方法和其应用
一种发根农杆菌介导的转基因杨树的构建方法和其应用一种常用的发根农杆菌介导的转基因杨树的构建方法是利用农杆菌介导的遗传转化技术。
该方法主要包括以下步骤：1. 构建转基因载体：首先，选择合适的载体，如农杆菌受体质粒(pCAMBIA系列)。
然后，将目标基因的编码序列插入到载体的适当位点上，并添加合适的启动子、终止子等调控元件。
2. 农杆菌培养：接下来，将构建好的转基因载体转化到农杆菌中，将该菌株在适宜的培养基中培养至菌液浓度达到一定程度。
3. 植物杨树的样本处理：从要转化的杨树中取一些新生芽或叶片作为样本，进行消毒处理，以去除杂菌。
4. 农杆菌介导的遗传转化：将农杆菌菌液和杨树样本共同处理，可以通过浸泡法、伤口注射法或利用农杆菌耐冻性侵染方法等手段。
5. 培养和筛选转基因杨树：将处理后的样本在适宜的培养基上进行培养，待转基因杨树生长出来后，利用适当的筛选方法去除未转化的杨树细胞。
6. 鉴定转基因杨树：对转基因杨树进行PCR扩增、Southern杂交等方法进行鉴定，确定其是否成功转化。
7. 进一步培养和繁殖：将鉴定通过的转基因杨树进行进一步培养和繁殖，以得到足够数量的转基因杨树。
转基因杨树的应用主要包括以下几个方面：1. 抗逆性提高：通过引入耐盐、耐干旱、耐寒等抗逆基因，增强杨树对环境逆境的适应能力，提高生存率和产量。
2. 木质纤维改良：通过引入纤维素合成相关基因，增强杨树木质纤维的产量和质量，提高杨树的木材利用价值。
3. 生物能源生产：通过引入生物质降解酶的基因，增强杨树木质纤维的降解能力，提高生物能源的产量。
4. 农药抗性改良：通过引入抗虫、抗病等相关基因，提高杨树对害虫和病原体的抵抗能力，减少农药的使用。
5. 环境修复：通过引入重金属吸收、分解等相关基因，增强杨树对重金属的吸附和分解能力，用于环境修复和污染治理。
总之，农杆菌介导的转基因杨树的构建方法可以为杨树的遗传改良提供途径，具有重要的应用价值。
农杆菌介导的植物转基因技术
农杆菌介导的植物转基因技术
农杆菌介导的植物转基因技术（Agrobacterium-mediated plant transformation）是一种常用的植物遗传转化技术。
该技术利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）作为载体，将外源基因
导入目标植物细胞，使其产生转基因植物。
农杆菌天然具有植物细胞转化的能力。
当农杆菌感染植物时，其携带的质粒（T质粒）能够在植物细胞中插入外源基因，并
将其转化为转座子形式，随后将其整合入宿主植物基因组中。
转座子通常包含目标基因、转座酶和调控序列，它们共同确保外源基因正确表达。
T质粒还携带有自身所需的发育激素和植
物生长调节物质，以维持转化后细胞的生存和分裂。
农杆菌介导的植物转基因技术具有许多优点。
首先，它可以用于许多不同植物物种的基因转化。
其次，该技术可以实现整株或局部的基因转化，包括细胞、组织、器官或整个植株。
此外，农杆菌介导的转基因技术可实现稳定遗传转化，外源基因可以遗传到植物后代中。
最后，该技术对植物基因组中的特定位点插入外源基因，使得外源基因可以与内源基因进行正常结合。
随着转基因技术的不断发展，农杆菌介导的植物转基因技术仍然广泛应用于研究和农业生产领域。
它为植物功能研究、抗病虫害、提高产量和改善品质等方面提供了有效手段。
然而，农杆菌介导的转基因技术也面临着一些挑战，如转化效率低、插入位点随机性以及响应植物抗性等问题。
因此，研究人员不断探索新的转基因技术和改进农杆菌介导的植物转基因技术的方法，以改善转基因植物的性状和应用。
转基因技术——动植物转基因方法
转基因 技术
【DAWN_ZX】
转基因技术的步骤
转基因 技术
STEP4：目的基因的检测和表达
1.检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目 的基因。 方法：采用DNA分子杂交技术。 2.检测目的基因是否转录出了mRNA。 方法：采用用标记的目的基因作探针与 mRNA 杂交。 3.最后检测目的基因是否翻译成蛋白质。 方法：从转基因生物中提取蛋白质，用相应的 抗体进行抗原－抗体杂交。 4. 进行个体生物学水平的鉴定。
转基因 技术
【DAWN_ZX】
动物转基因方法
原核显微注射法
胚胎干细胞介导法 逆转录病毒载体法 精子介导的基因转移 核移植转基因法 体细胞核移植法 线粒体介导法
转基因 技术
【DAWN_ZX】
动物转基因方法
原核显微注射法（最常用） •方法：将外源基因注射到受精卵细胞的原核内，
外源基因与胚胎基因组融合后体外培养， 移植到 受体母畜子宫内发育，这样分娩的动物体内的每一 个细胞都含有新的DNA片段。 •缺点：效率低、位置效应(外源基因插入位点随 机性)造成表达结果有不确定性、动物利用率低。 反刍动物繁殖周期长，有较强的时间限制、需要大 量的供体和受体动物。
转基因 技术
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植物转基因方法 基因枪介导转换法
•方法：利用火药爆炸或高压气体加速将包裹
了带目的基因的DNA溶液的高速微弹直接送入 完整的植物组织和细胞中，然后通过细胞和组 织培养技术，再生出植株，选出其中转基因阳 性植株即为转基因植株。 •优点:不受受体植物范围的限制，而且其载 体质粒的构建也相对简单，是目前转基因研究 中应用较为广泛的一种方法。
转基因技术的步骤 STEP2：基因表达载体的构建
目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且 可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥 作用。 组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因 标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含 有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出 来。常用抗生素基因。
农杆菌介导转基因植物t-dna的整合方式
农杆菌介导转基因植物t-dna的整合方式
农杆菌介导转基因植物T-DNA的整合方式
农杆菌介导转基因植物T-DNA的整合方式是指利用农杆菌介导技术将外源基因导入植物基因组中的过程。
农杆菌介导转基因技术是一种常用的植物遗传转化技术，通过该技术可以将外源基因导入到植物细胞中，并将其整合到植物基因组中，从而实现对植物性状的改良和优化。
农杆菌介导转基因植物T-DNA的整合方式主要包括以下几个步骤：
1. 农杆菌感染：首先需要将含有目标外源基因的质粒导入到农杆菌中，然后利用农杆菌的特殊途径将质粒中的T-DNA片段转移到植物细胞中。
2. T-DNA整合：一旦T-DNA片段进入到植物细胞中，它会与植物基因组中的某个位置发生重组，从而将外源基因整合到植物基因组中。
这个过程是随机的，T-DNA片段可以整合到植物基因组的不同位置。
3. 外源基因表达：一旦T-DNA片段整合到植物基因组中，外
源基因就可以在植物细胞中得到表达，从而产生目标蛋白质或RNA。
4. 遗传稳定性：经过一系列的培养和筛选，可以获得稳定遗传的转基因植物株系，这些植物株系可以传递给下一代，从而实现外源基因在植物种群中的稳定传递和表达。
农杆菌介导转基因植物T-DNA的整合方式是一种高效、可靠
的转基因技术，它已经被广泛应用于多种重要农作物的遗传改良和品种选育中。
通过这种技术，可以实现对植物抗病、抗虫、耐逆性等重要性状的改良，为农业生产提供了强有力的技术支持。
同时，随着分子生物学和生物技术的不断发展，农杆菌介导转基因植物T-DNA的整合方式也在不断完善和优化，为农
作物遗传改良和新品种选育提供了更加强大的技术平台。
农杆菌转化法及转基因植物检测方法
农杆菌转化法及转基因植物检测方法摘要：近年来，植物基因工程技术飞速发展，转基因植物在很多领域的研究推广取得了令人瞩目的成绩。
植物基因工程中常用的转化方法一般是通过土壤农杆菌系统、植物病毒系统和DNA直接导入法这三种方法进行。
另外，转基因技术快速发展的同时转基因植物检测技术也在不断地进歩和完善，目前被广泛应用的转基因植物检测方法有三类：整合水平上的检测、转录水平上的检测和表达水平上的检测。
本文着重对农杆菌介导的植物转化方法和转基因植物的检测两方面进行综述。
关键词：农杆菌，转化，转基因植物，检测方法伴随着生命科学的飞速发展，植物组织培养技术以及植物组织分化、植物基因重组等技术发展迅速并得到广泛应用。
1984年转基因烟草的诞生[1]，使外源基因导入植物细胞从而获得转基因新品种的设想成为现实。
随后，转基因技术被广泛应用于各个方面如：植物新品种的改良、植物性状改良、植物抗性的提高以及植物基因功能的研究等[2-4]。
新型转基因大豆、转基因番茄及转基因玉米等转基因新品种陆续面世[5]。
植物转基因技术不但能够打破植物的物种界限，还能够使物种基因彼此进行交流。
使植物育种年限缩短，植物育种进程加快，植物抗性也在一定程度上得到很大提高，使来自于不同生物种类的优良目的基因导入植物并得到优良植物新品种。
同时，运用转基因技术研究植物自身基因结构组成及其基因功能调控等方面也取得了一定成果；运用转基因技术还研制出生物反应器和雄性不育系[6]。
目前，利用转基因技术将目的基因导入植物基因组中的常用方法主要有：土壤农杆菌介导的基因转化、DNA直接导入和植物病毒系统介导法。
本文着重介绍土壤农杆菌介导的目的基因转化法，同时也对目前转基因植物的检测进行适当总结。
1 土壤农杆菌介导系统的种类土壤农杆菌中的发根农杆菌和根癌农杆菌能够侵染植物伤口并形成与土壤农杆菌中大质粒有关的植物肿瘤和冠瘿。
能够诱发此类肿瘤的根瘤农杆菌中常常带有分子量为200-250kb的Ti质粒。
转基因技术动植物转基因方法
转基因技术动植物转基因方法转基因技术是一种现代生物技术，通过对生物体的基因进行修饰和重组，从而实现特定的性状改良或新性状的引入。
在动植物领域，有多种转基因方法被广泛应用，以下将为您详细介绍。
一、动物转基因方法1、显微注射法这是动物转基因技术中最常用的方法之一。
其基本原理是在显微镜下，将经过处理的外源基因直接注射到受精卵的雄原核中。
因为雄原核较大，更容易容纳和整合外源基因。
注射后的受精卵经过培养和筛选，然后移植到代孕母体的子宫内，最终发育成转基因动物。
这种方法的优点是操作相对直接，成功率较高；但缺点是技术难度大，对设备和操作人员的要求较高，且可能会对受精卵造成一定的损伤。
2、病毒载体法利用病毒作为载体将外源基因导入动物细胞。
经过改造的病毒失去了致病性，但仍能携带外源基因并将其整合到宿主细胞的基因组中。
常用的病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒等。
此方法的优势在于转染效率较高，能够感染多种类型的细胞；然而，病毒载体的容量有限，可能引起免疫反应，且存在潜在的生物安全风险。
3、胚胎干细胞介导法首先从早期胚胎中分离出胚胎干细胞，然后通过基因工程技术将外源基因导入胚胎干细胞。
经过筛选和鉴定，含有外源基因的胚胎干细胞被重新注入到囊胚腔中，与囊胚细胞融合，形成嵌合体胚胎。
最后将嵌合体胚胎移植到代孕母体子宫内发育。
这种方法可以实现精确的基因修饰，但胚胎干细胞的培养和操作难度较大。
4、体细胞核移植法先将供体细胞进行基因修饰，使其携带外源基因，然后将供体细胞的细胞核移植到去核的卵母细胞中，构建重组胚胎，再将重组胚胎移植到代孕母体中发育。
这种方法的优点是可以获得大量遗传背景相同的转基因动物，但技术流程复杂，成功率相对较低。
二、植物转基因方法1、农杆菌介导转化法农杆菌是一种天然的植物基因转化载体。
当植物受伤时，农杆菌会感染植物，并将其携带的一段 DNA（称为 TDNA）转移并整合到植物基因组中。
在转基因操作中，将含有目的基因的 TDNA 载体导入农杆菌，然后用农杆菌感染植物细胞，从而实现目的基因的转化。
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（五）侵染转化
将预培养的红花子叶放入 菌液中浸染8-25min，在侵染过 程中轻轻摇晃，确保菌液充分进 入到红花子叶中。
（六）除菌
取出外植体，将其放在无菌 滤纸上，充分吸干菌液，避免菌
液残留在红花子叶上，使其在培
养过程中，菌液过量生长。
（七）侵染后的培养
首先将红花子叶置于共培养上，使其生长。培养一周后，将其转入
八、思考题
1、农杆菌转化的基本步骤有哪些？ 2、农杆菌遗传转化的优缺点？ 3、哪些措施可以提高农杆菌介导的转化率？
培养基中，进行液体振荡培 养，28℃,180rpm，制备用 于侵染转化的工程菌。
（三）离心，收集菌体
将农杆菌离心，2000
rpm，10min，收集菌体,
目的是去除细菌培养基 的高浓度盐。
（四）重悬菌体
用液体MS培养基将菌 体用移液枪吹打起来， 使菌体重新悬浮，其目
的是减少细菌培养基对
植物体的伤害。
分化培养基上，进行培养，待其诱导分化出不定芽后，继续培养，不定
芽分化成苗后，将其移入生根培养基中，培养获得转基因植株。
六、实验结果
农杆菌侵染时间 8min 10min 12min 15min 20min 25min
外植体数量
10
10
10
10
10
10
染菌情况
分化情况
转化率
七、注意事项
1、在操作过程中，一定要保证无菌，整个操作过程均需要再无菌 的条件下完成。 2、进入超净工作台前，要检查紫外灯是否关闭，避免对皮肤造成 损害。 3、进入超净工做台进行实验时，要进行表面消毒，用酒精喷洒并 擦净台面和双手。
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五、实验方法
（一）农杆菌菌液的制备
用牙签蘸取农杆菌，在
YEB培养基上划线，达到纯
化农杆ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ的目的。
（二）制备工程菌（摇菌）
用牙签挑取划线得到的
单菌落，将其置于YEB液体
整
合
。
四、实验仪器与试剂
1、仪器：超净工作台，离心机，恒温摇床，组织培养室；
2、试剂：农杆菌EHA105，YEB培养基，MS液体培养基，共培
养基（MS+6-BA+NAA），分化培养基（MS+6-BA）
生根培养基（MS+IBA+NAA）；
3、材料：红花无菌苗。
改造后的农杆菌的T-DNA区，含有目的地基因和Bar筛选基因 L B
分子生物学操作技术之实验五
农杆菌介导的植物转基因技术
讲课人：杨晶
一、转基因植物概述
转基因玉米
转基因辣椒
转基因玫瑰
日闭幕的东京国际花卉博览会上，全球首批真正的蓝玫瑰首次在公众面前亮相。
二、实验目的
1、学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理； 2、掌握农杆菌介导转化植物的实验方法，了解转基因技术 的操作流程。
三、实验原理
根癌农杆菌，属根瘤菌科，为革兰
农杆菌 感染柳树 产生 冠瘿瘤
氏阴性。根癌农杆菌感染双子叶植物时，
可在被感染的伤口形成冠瘿瘤 , 诱导有 关的质粒为Ti质粒 。Ti质粒上有一段TDNA区，人们将外源基因插入到TDNA 区，借助农杆菌的感染使携带外 源基因的 T-DNA 区转入植物基因组中， 从而实现外源基因向植物细胞的转移和