农杆菌介导的转化所用基本培养基配方
农杆菌的活化培养及介导的遗传转化
农杆菌的活化培养及介导的遗传转化一、目的要求通过实验掌握农杆菌的活化与培养技术与农杆菌介导获得目的基因的转化植株。
二、基本原理农杆菌共培养法最早是由Marton 等（1979 年）以原生质体为受体建立起来的，经过一系列改进后，目前已经成为最常用的转化方法。
共培养法是利用Ti 质粒系统，将农杆菌与植物原生质体、悬浮培养细胞、叶盘、睫段等共同培养的一种转化方法。
三、材料及方法1.含目的基因共整合载体或双元载体的根癌农杆菌。
2.植物幼苗。
（一）细菌培养液直接浸染法操作︰（1）无菌受体材料的准备︰叶片、睫段、胚轴、子叶等均可做受体材料，有两种来源。
取自无菌试管苗。
取自田间或温室栽培植株︰叶片、睫尖、睫段用蒸馏水冲冼1 遍后，70％乙醇洗45 秒，0.1％升汞消毒6～8 分钟，无菌水冲洗三遍，无菌滤纸吸干水分。
（2）受体材料预培养︰将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm 的小块或用6mm 打孔器凿成圆盘，无菌胚轴、睫切成约0.8～1cm 长的切段，接种在愈伤组织诱导或分化培养基上进行预培养，注意叶片近轴面向下︰预培养2～3 天，材料切口处刚刚开始膨大时即可进行侵染。
（3）农杆菌培养︰从平板上挑取单菌落，接种到20mL 附加相应抗生素的细菌培养液体培养基（pH7.0）中，在恒温摇床上，于27℃, 180r/ min 培养至OD600 为0.6～0.8。
取OD600 为0.6～0.8 的菌液，按1％～2％的比例，转入新配制的无抗生素的细菌培养液体培养基中，可在与上相同的条件下培养6 小时左右，OD600 为0.2～0.5 时即可用于转化；或同时加入100～500μmol/的AS；（4）侵染︰于超净工作台上，将菌液倒入无菌小培养皿中（可根据材料对菌液的敏感情况进行不同倍数的稀释）。
从培养瓶中取出预培养过的外植体，放入菌液中，浸泡适当时间（一般1～5 分钟，不同材料处理时间不同）。
取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。
(整理)9311农杆菌介导转化体系
9311农杆菌介导转化体系（注：培养基“+”的为灭菌冷却到60℃后加）（一）诱导愈伤幼胚：取生长一致的植株，剥去主茎外层、叶鞘，将穗子剪成小段，在超净工作台上先用75％酒精浸5 min，用无菌水冲洗1次，再用次氯酸钠原液抽真空约10min至不冒气泡，再放于摇床振荡40min，无菌水冲洗4～5次，然后在灭菌滤纸上小心挤出幼胚，放于诱导培养基（NB）上。
每皿30粒，置于25~26℃下暗培养，以诱导愈伤组织。
除不能萌发的幼胚外，愈伤诱导率到达98%。
幼胚的萌发和污染受幼胚灭菌效果和接种操作的影响，所以请小心操作。
（大概一周左右能见愈伤从盾片中长出，视愈伤和芽生长情况选择掐芽、继代时间，如图1）图1 适合掐芽作继代的9311幼胚愈伤成熟种子：分别挑选健康籽粒剥去颖壳，置于37℃培养箱过夜。
种子取出后放入灭菌的三角瓶中，先用体积分数为75％的乙醇表面灭菌5min，用无菌水冲洗1次，0.1％HgCl2消毒12 min，用无菌水冲洗5次，再放入次氯酸钠原液消毒40 min，无菌水冲洗5次，于灭菌的滤纸上晾干，然后接种到诱导培养基上（9311为NB+ ABA 1mg/L），让胚的一半接触培养基。
每皿20粒，置于25~26℃下暗培养，以诱导愈伤组织。
（通过对四种基本培养基NBKNB、NB、MSTC、J0和NB+ ABA 0.5mg/L、NB+ ABA 1mg/L、NB+ NAA0.5mg/L、NB+ NAA1mg/L的研究表明，9311在NB+ ABA 1mg/L培养基中的诱导率是85%）大概在两周左右愈伤长出、芽也比较长的时候掐去芽或者直接继代，具体时间视愈伤和芽的生长情况定，如图2、3是比较好的时期。
图2 适合掐芽的9311成熟种子图3 掐了芽的9311成熟种子，继续放于诱导培养基中，这样状态的愈伤也可以去除谷粒和愈伤中的芽头直接转到继代J3中，但注意在去除谷粒和愈伤中的芽头时不要伤到愈伤也要去除干净（二）继代培养20天后，挑选表面干爽、结构致密的愈伤组织，去除谷粒和愈伤中的芽头转到继代培养基上J3，这时候谷粒中营养已经被吸收而变软，继代培养1~2次，每次20天。
根癌农杆菌介导的真菌转化
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根癌农杆菌介导的真菌转化(一)农杆菌电击感受态制备及电击转化A感受态的制备1)将农杆菌菌液划线于Yeb平板（50μg/mlkana），28℃，36-48h。
2)挑单菌落至3mlYeb试管（50μg/mlkana）中，28℃，200rpm培养过夜。
3)转1ml至50mlYeb中，28℃，200rpm培养至oD600=0.8。
4)于4℃，5000rpm，10min收集菌体。
5)用50mL10%的甘油（去离子水配置，湿热灭菌）洗沉淀3次（4℃，5000rpm，10min），洗涤时一定要把菌体悬浮均匀。
6)重悬于1ml10%甘油中（约1011个细胞/ml），可立即使用，或分装为每管50μl，液氮速冻后，-80℃保存备用。
b电击转化1)将1μl质粒加入到农杆菌感受态细胞中，混匀，转至无菌预冷的电击杯中。
2)将电击杯放入电转化仪的电极之间，16kv/cm，5ms。
3)取出电击杯，迅速加入200-300μlYeb（不加抗生素），并将混合液转入ep管中。
4)于28℃，220rpm，2-3h。
5)将50-100μl菌液涂布于Yeb平板（50μg/mlcar和50μg/mlkana）上，于28℃培养2-3天后，挑斑鉴定。
(二)农杆菌化学感受态制备及化学法转化petentcells1)Inoculateasinglecolonyto5mlLb2)growat28℃tologphage,shakingat250rp m3)Inoculate2mlofthecultureto50mlLbmediumandgrowtooD600=0.5ca.8h ours4)chillonicefor10minutes5)spindownthecellsbycentrifugationat3000g(8000rpm)for10minutesat4℃6)Resuspendcellsin1mlof20mmcacl27)Aliquotsinto0.1ml,thenfreezeinliquidnitrogen,andstoreat-80℃bplasmid Transformation1)Thawcompetentcellsonice.2)Add1μgplasmid(5μl)tothecompetentcellsandmixwell.3)Freezeinliquidni trogenfor5min.4)heatshockat37℃for5min.5)Add1mlLbandgrowat28℃for3hrwithshakingat150rpm.6)spreadcellsontoLbplatescontaininganappropriateantibioticandincubate atroomtemperaturefor2-3days.(三）农杆菌介导的真菌转化1将已转入目的质粒的农杆菌接种于4mlYeb液体培养基（50μg/mlcar和50μg/mlkana）中，于28℃摇床中220rpm过夜培养（16-20h）。
农杆菌介导的烟草转化
准备菌液LB 300ml(加抗生素Kan,Rif)
1L MS, 分装300ml (SIM,无抗生素20个平板)，500ml(SIM,有抗生素，倒培养瓶)，200ml（液体，做悬浮液）
Kan,Rif / Basta,Rif
1.根癌农杆菌的活化
挑取单菌落，接种于含抗生素的LB 液体培养基（Rif 50μ g/ml和Kan 50-100μg/ml）中，28℃-30℃200rpm 振荡培养过夜。
2.农杆菌介导叶盘法转化植物
①农杆菌菌体处理
挑取农杆菌菌株接种于LB培养基中（含rif 50μg/ml和kan50μg/ml），200rpm，28℃培养24h，菌液OD600至1.0 左右，离心10min（3000rpm），沉淀菌体。
再用10ml左右的MS液体培养基悬浮，稀释菌体的OD600值为0.3-0.5。
②叶盘法转化转化植物程序
选取理想状态的外植体，在超净台上剪成小方块或者打成叶圆片（大小不限），在制备好的农杆菌菌液中浸染3-5min，置于无菌吸水纸吸干，平铺于SIM （MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA）培养基（无抗生素）上黑暗共培养2 天，2天后将外植体转移至含筛选因子的芽诱导培养基如SIM（MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+Basta 5mg/L+500μg/ml的carb素或500Cef）上进行筛选。
待有芽生成（3~4周）后，继续培养到苗高2~3厘米时，转入生根培养基RIM（MS+ kan50μg/ml+500μg/ml的羧卞青霉素或500Cef）上，进行根诱导生长。
Cb: 羧卞青霉素; Cef:头孢霉素。
发根农杆菌培养基 配方
发根农杆菌培养基配方
发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）是一种植物病原体，具有诱导植物发生根状结构的能力。
培养发根农杆菌需要使用特定的培养基，以下是一种常用的发根农杆菌培养基的配方，通常称为RMB （Rhizobium Meliloti Broth）培养基：
Rhizobium Meliloti Broth (RMB) 培养基配方：
成分：
1.卡拉胶（Carob bean gum）: 0.2g
2.酵母提取物（Yeast extract）: 0.5g
3.酵母膏（Yeast autolysate）: 0.5g
4.硫酸镁（Magnesium sulfate）: 0.2g
5.硫酸钙（Calcium sulfate）: 0.02g
6.葡萄糖（Glucose）: 1.0g
7.麦芽提取物（Malt extract）: 0.5g
8.氯化钠（Sodium chloride）: 0.1g
9.硫酸钠（Sodium sulfate）: 0.02g
10.磷酸二氢钾（Potassium dihydrogen phosphate）: 0.3g
pH值调整：
•使用氢氧化钠（NaOH）或盐酸（HCl）将培养基调整至pH 7.0。
注意：
•所有成分都需溶解在蒸馏水中，并在121°C高压蒸汽灭菌20分钟。
•在培养基中加入适当的抗生素，以选择性地培养Agrobacterium rhizogenes。
这个配方是用于培养发根农杆菌的基础培养基，具体的实验需求和菌株的特性可能需要根据实际情况进行一些微调。
在实验中使用培养基时，请根据具体实验目的和研究要求进行适当的修改。
农杆菌瞬时转化法
农杆菌瞬时转化法:一、本氏烟草的种植⑴配制基质中各成分比例如下,花卉营养土:蛭石:沙土=2:1:1，22℃16h/8h （光/暗）70%湿度（扣透明白盒2周保湿）⑵将基质浇透水后,烟草种子采用移液器点播在基质中,每盆播1，2粒种子,2-3天浇一次水。
二、农杆菌注射烟草叶片1、3周烟草(4 leaves stage)，选取生长状态良好，健壮的烟草叶片植株（年轻的、完全展开的4周大小）进行农杆菌侵染。
转化前将浇透水，转化后要控制浇水2、农杆菌准备:预培养：接种克隆至5ml LB+Antibiotics培养：用1mL预培养液接种至50ml LB+abtibiotics +Acetosyringon(final 20 µM)含Rif (100 mg/mL)、Str (100 mg/mL)和Kan (50mg/mL)三种抗生素的YEB液体培养基活化农杆菌（(GV3130)）。
检测菌液生长到指数后期 OD600=0.6，4000rpm，室温离心10min收获菌液3、配悬浊液:混匀后于4°C保存;4、重悬液（经常15ml）（10 mM MES-KOH，pH 5.6, 10 mM MgCl2, 100 μM acetosyringone乙酰丁香酮）重悬至OD600=1，（可以洗涤2次）5、同时也将同样培养的含有P19的农杆菌同样悬浮并调整悬浮液的浓度为OD600=16、根据实验设计,将以上三类农杆菌0.7:0.7:1.0体积混合,室温下静置3-4h，7、注射前烟草放在白色日光灯下1h，让气孔充分张开8、Agroinfiltration 注射：重悬菌体，用1 mL注射器（去针头）吸取菌液；避开叶脉，用注射器针在叶片上开小孔后，左手抵住叶片正面，右手轻轻将注射管口垂直压在叶片反面，右手拇指缓慢均匀用力推压，观察菌液在叶片表皮下缓慢移动，直至侵染整个叶片。
（一个植株可以注射2个叶片，不要用子叶）塑料薄膜覆盖，22℃、3天后撕取叶片下表皮于激光共聚焦显微镜下观察。
转基因的步骤
1.5 农杆菌介导的水稻快速转化1.5.1 各种培养基成分水稻快速转化的培养基成分如表2-1，N6D培养基用于愈伤组织诱导和筛选，2N6-AS 为共培养培养基，AAM 用于配制农杆菌浸染液，RE-III 为分化培养基，HF 为生根培养基，AB 培养基用于农杆菌的活化。
其中，配制固体培养基时，固定剂使用0.4%的Gerite。
1.5.2 种子的消毒（1）水稻成熟种子去壳；（2）置70%乙醇1min，弃乙醇，用无菌水清洗5 次；（3）在每50ml 的 2.5%次氯酸钠溶液中滴 1 滴吐温20 混匀，然后放入乙醇处理过的水稻种子，浸泡15min，无菌水清洗 5 次；（4）在 2.5%次氯酸钠溶液中再灭菌15min，无菌水清洗 5 次。
1.5.3 种子的接种和愈伤组织诱导将灭菌后的成熟种子平摆于诱导培养基上，在常光照、32℃条件下培养5-8d。
1.5.4 浸染液的制备（1）取出 1.4 中所保存的含有目标质粒的单克隆，吸取50μl 保菌液均匀涂布于固体AB培养基上，AB培养基中含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平，28℃条件下培养2-3d；（2）刮取AB 培养基上的农杆菌，用AAM 重悬农杆菌，用AAM 稀释至OD600为0.1。
1.5.5 愈伤组织侵染和共培养（1）取出诱导5-8d 的水稻愈伤组织，切去胚乳和芽鞘；（2）将生长状态良好的愈伤组织置于浸染液中，浸泡5-8min；（3）取出愈伤组织，置灭菌滤纸上，吸取愈伤组织表面的侵染液；（4）在2N6-AS 培养基上铺一层无菌滤纸，并用AAM 浸湿；（5）将浸染后的愈伤组织均匀平放于2N6-AS 培养基；（6）在25℃、黑暗条件下共培养3d。
1.5.6 抗性愈伤的筛选（1）共培养愈伤组织的洗涤：取出共培养的愈伤组织，放入含400mg/L 羧苄青霉素的抑菌液中清洗，共洗 5 次，每次浸泡6min左右；（2）倒去洗涤液，将愈伤组织移到无菌滤纸上，尽量蘸干愈伤组织表面的液体；（3）将愈伤组织均匀平放于N6D+培养基上，32℃、常光照条件下培养，直到新的愈伤组织长出，需两周左右。
水稻转基因方法及培养基配放个
根癌农杆菌介导的转化方法将水稻成熟种子去壳。
仔细剔除有霉菌点籽粒，取饱满清亮籽粒先用７０％乙醇浸泡（表面消毒）1min ，再用含2%活性氯含量的NaClO溶液（加1-3滴Tween20）浸泡30min以上（最长可至1小时左右），并不断摇动，然后用无菌水冲洗4-5次；将灭菌后的成熟种子置于无菌滤纸上吸干多余水分，直接接种于N2D6培养基上，于24-26ｏC暗培养7-10 天，诱导出初生愈伤组织；将上述从成熟胚诱导的初生愈伤组织直接用于与农杆菌的共培养转化；农杆菌的准备是在含有50mg/mL km的LB 平板上划线，培养含有重组质粒的农杆菌，28ｏC培养36h。
挑取活化的单个农杆菌菌落，在28ｏC于3mL 含km 的LB培养基中振荡培养过夜，第2天按1.5/50（V/V）接种量在AB液体培养基中培养，培养程度以稍早于生长对数期为宜（OD600约为0.6-0.8 ）。
离心回收新鲜培养的农杆菌，并重悬于约1/2-1/3体积的AAM（含100-400mol·L-1乙酰丁香酮）液体培养基中，至OD600约为0.8-1.0左右为宜；将愈伤组织切下，立即投入含农杆菌的AAM重悬液中，浸泡15-20分钟，并不断摇动。
将感染后的愈伤组织置于无菌滤纸上吸干多余的菌液，转入共培养基N6D2C上培养3天（26ｏC，暗培养）。
转入筛选培养基N6D2S1上与24-26ｏC 暗培养条件下筛选2周。
新鲜长出的抗性愈伤组织或不褐化的愈伤组织转入筛选培养基N6D2S2上，继续筛选培养2次，每次2周。
将抗性愈伤组织转入MSPR培养基上进行预分化处理14天，其中先在暗条件下培养7天，然后转入光条件下培养7天；经预分化处理的愈伤组织转入MSR培养基分化再生，在光下培养；再生的小苗在1/2MS0培养基上生根壮苗。
农杆菌介导转化水稻所用培养基-1-1 626蔗糖，2mg·L-1 2,4-D, 2.5g·L-1Phytagel( sigma) ,pH5.8N6D2S1N6D2，25mg·L-1潮霉素B（Roche），500mg·L-1头孢霉素（cefotaxime）N6D2S2N6D2，50mg·L-1潮霉素B，300mg/mL头孢霉素2424442 150mg·L-1KCl, 10mg·L-1CaCl2, 2.5mg·L-1FeSO4·7H2O, 5g·L-1葡萄糖，pH7.0AAM AA（Toriyama和Hinata，1985）盐分和氨基酸，MS（Murashige和Skoog 1962）维生素，0.5g·L-1酪蛋白水解物，36g·L-1葡萄糖，68.5g·L-1蔗糖，100-400µmol·L-1乙酰丁香酮，pH5.2N6D2C N6D2, 10g·L-1葡萄糖，100-400µmol·L-1乙酰丁香酮（用时现加），pH5.2预分化与分化再生MSPR MS（Murashige和Shog，1962）盐分和维生素，0.5g·L-1酪蛋白水解物，50g·L-1蔗糖，2mg·L-16-BA，1mg·L-1NAA, 5mg·L-1ABA ，3.0g·L-1Phytagel, pH 5.8，50mg·L-1潮霉素B，200mg·L-1头孢霉素。
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农杆菌介导的转化所用基本培养基配方
一、NB培养基配方（基本培养基）
N6大量：（mg/l）母液：10X，1L（mg）
硝酸钾KNO3
硫酸氨（NH4）2SO4 磷酸二氢钾KH2PO4 硫酸镁MgSO4·7H2O 氯化钙CaCl2·2H2O 2830
463
400
185
166
28300
4630
4000
1850
1660
B5微量：（mg/l）母液：100X，1L（mg）
硼酸H3BO4
硫酸锰MnSO4·H2O
硫酸锌ZnSO4·7H2O 碘化钾KI
钼酸钠Na2MoO4·2H2O 硫酸铜CuSO4·5H2O 氯化钴CoCl2·6H2O 3
7.58
2
0.75
0.25
0.025
0.025
300
758
200
75
25
2.5
2.5
铁盐：（mg/l）母液：100X，1L（mg）
硫酸亚铁FeSO4·7H2O
乙二胺四乙酸二钠Na2EDTA 27.8
37.3
2780
3730
肌醇：（mg/l）母液：100X，1L（mg）肌醇Myo-inositol 100 10000
有机成分：（mg/l）母液：50X，1L（mg）
盐酸硫胺素ThiamineHCl
盐酸吡哆醇PyridoxineHCl 尼克酸Niacin
水解酪蛋白Casamino acids 谷氨酰胺Glutam
脯氨酸Proline ine
甘氨酸Glycine 10
1
1
300
250
500
2
500
50
50
15000
12500
25000
100
蔗糖Sucrose 30000mg/l
琼脂Phytagel 2400mg/l
pH 5.8-5.9
注意：有机成分不能高压灭菌，须用滤器抽滤，分装后-20℃保存
二、AAM培养基配方
大量：（mg/l）母液：10X，1L（mg）
磷酸二氢钾KH2PO4 硫酸镁MgSO4·7H2O 氯化钾KCl
氯化钙CaCl2·2H2O 170
370
2940
440
1700
3700
29400
4400
微量：（mg/l）母液：100X，100ml（mg）
硫酸锰MnSO4·H2O
钼酸钠Na2MoO4·2H2O 硼酸H3BO4
硫酸锌ZnSO4·7H2O 碘化钾KI
硫酸铜CuSO4·5H2O 氯化钴CoCl2·6H2O 7.58
0.25
3
2
0.75
0.0387
0.025
758
25
300
200
75
3.87
2.5
铁盐：（mg/l）母液：100X，1L（mg）
硫酸亚铁FeSO4·7H2O
乙二胺四乙酸二钠Na2EDTA 27.8
37.3
2780
3730
肌醇：（mg/l）母液：100X，1L（mg）肌醇Myo-inositol 100 10000
维生素：（mg/l）母液：100X，1L（mg）
盐酸硫胺素ThiamineHCl 盐酸吡哆醇PyridoxineHCl 尼克酸Niacin 0.5
0.5
0.5
50
50
50
氨基酸：（mg/l）
甘氨酸Glycine
精氨酸Arginine
谷氨酰胺Glutamine 7.5 174 876
水解酪蛋白Casamino acids 500mg/l
乙酰丁香酮Acetosgringone 100μΜ
葡萄糖Glucose 68500mg/l
蔗糖Sucrose 30000mg/l
pH 5.2
注意：AAM培养基不能高压灭菌，须用滤器抽滤，分装后-20℃保存
三、YEB固体培养基
(pH 7.0)
酵母提取物
蛋白胨
牛肉膏
蔗糖
硫酸镁
添加： Kan 50 mg/L Rif 50 mg/L 1.0g／Ｌ5.0g／Ｌ5.0g／Ｌ5.0g／Ｌ0.5g／Ｌ
四、LB固体培养基(pH 7.0-7.2)
酵母提取物
蛋白胨
NaCl
添加： Kan 50 mg/L Rif 50 mg/L 5g／Ｌ10g／Ｌ10g／Ｌ
五、MS培养基配方
大量：（mg/l）母液：20X，1L（mg）
硝酸铵NH4NO3
硝酸钾KNO3
磷酸二氢钾KH2PO4硫酸镁MgSO4·7H2O 氯化钙CaCl2·2H2O 1650
1900
170
370
440
33000
38000
3400
7400
8800
微量：（mg/l）母液：100X，1L（mg）
硫酸锰MnSO4·4H2O 硫酸锌ZnSO4·7H2O 硼酸H3BO4
碘化钾KI
钼酸钠Na2MoO4·2H2O 硫酸铜CuSO4·5H2O 氯化钴CoCl2·6H2O 22.3
8.6
6.2
0.83
0.25
0.025
0.025
2230
860
620
83
25
2.5
2.5
铁盐：（mg/l）母液：100X，1L（mg）
硫酸亚铁FeSO4·7H2O
乙二胺四乙酸二钠Na2EDTA 27.85
37.25
2785
3725
肌醇：（mg/l）母液：100X，1L（mg）肌醇Myo-inositol 100 10000
维生素：（mg/l）母液：100X，1L（mg）
盐酸硫胺素ThiamineHCl 盐酸吡哆醇PyridoxineHCl 尼克酸Niacin 0.4
0.5
0.5
40
50
50
甘氨酸Glycine 琼脂Phytagel 蔗糖Sucrose pH 5.8-5.9 2 mg/l 8000 mg/l 30000mg/l。