(完整word版)农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素
农杆菌介导的植物基因转化研究进展
#综述进展#农杆菌介导的植物基因转化研究进展Progress of Plants Genetic Transformation by Agrobacteriu m王景雪孙毅Wang Jingxue Sun Yi山西省农业生物技术研究中心,太原030031T he Ggr o-Biotechnology Center of Shanxi P rovince,T aiyuan030031摘要:农杆菌介导的植物基因转化是当今植物基因转化的主要方法之一,因而深受关注。
本文从农杆菌介导的基因转化机理,植物对农杆菌侵染的反应,转基因植物的遗传表达,以及农杆菌对单子叶植物的转化等方面论述了该领域的最新研究进展,并提出了进一步研究的方向。
关键词:土壤农杆菌;基因转化;遗传表达Abstract:T he transformation mediated by A grobacter ium is an important approach in plant improvement,and the field is concerned by many scientists.T his paper discussed r ecent prog resses in A gr obacter ium transfo rmat ion mechanism,plant response to the infect ion of A grobacter ium,the ex pression of foreign genes in tr ansgenic plants and monocotyledonous species transformation by Ag robacter ium.T he problem which need further inv est igation w as also di scussed.Key words:Agrobacterium;gene transformation;gene expression植物基因转化是利用分子生物学和基因工程技术将外源基因插入到受体植物的基因组,并使其在后代植株中得以表达的过程。
农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素
二、农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素转化机制：与植物基因转化有关的农杆菌有两种类型：根癌农杆菌（ Agrobacterium tumefaciens ）和发根农杆菌（ Agrobacterium rhizogenes ）。
根癌农杆菌含有 Ti 质粒。
发根农杆菌含有 Ri 质粒。
根癌农杆菌的 Ti 质粒和发根农杆菌 Ri 质粒都具有一段转移 DNA （transfer DNA ，又称 T-DNA），在农杆菌侵染植物时， T-DNA 可以插入到植物基因组中，使其携带的基因在植物中得以表达。
由于 T-DNA 能够进行高频率的转移，而且Ti 质粒和 Ri 质粒上可插入大到甚至 150kb 的外源基因，因此， Ti 质粒和 Ri 质粒成为植物基因转化中的理想载体系统。
1 与农杆菌转化相关的基因与转化相关的基因主要包括农杆菌染色体上的基因和 Ti 质粒上 T-DNA 以外 Vir 区的基因。
染色体基因包括 chvA 、chvB 、att 、pscA 、chvD 以及 chvB 。
它们大多编码一些膜相关蛋白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。
ChvD 蛋白可能在低 pH 和磷酸饥饿情况下提高 VirG 蛋白的合成水平。
ChvE 与 VirA 蛋白共同对 virG 起激活作用。
原始的 Ti 质粒根据其功能的不同，可分为 4 个区：（ 1） T-DNA 区：是在农杆菌侵染细胞时，从 Ti 质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段 DNA ，其携带的基因与肿瘤的形成有关，但与 T-DNA 本身的转移与整合无关。
T-DNA 上最重要的是两端的2个边界（LB和RB），它们是T-DNA转移所必需的。
只要其存在， T-DNA 可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中， T-DNA 的右边界在 T-DNA 的整合中对于靶 DNA 位点的识别具有重要作用，因此，尤以右边界更为重要．（2）毒性区：位于 T-DNA 以外的 1 个 30~40 kb 的区域内，该区段编码的基因但对 T-DNA 的转移和整合非常重要．这些基因也称为 Ti 质粒编码毒性基因（vir）。
农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素
农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素1.农杆菌感染：农杆菌通过其特有的类纤毛附着剂蛋白(T4SS)结构与植物细胞进行初步接触和附着。
2. 感染信号传递：在与植物细胞接触后，农杆菌释放并传递一系列感染信号，包括有效异常淋巴细胞(QvrAB)的诱导、拟南芥(Ca2+)离子内涵物的释放、脑心肌炎物质(AHL)的转运和细胞壁酶的活化等。
3.感染信号诱导细胞凋亡：感染信号的诱导会引起植物细胞凋亡，从而产生切伤的部位或孔洞，在这些切伤或孔洞中形成转化DNA理论允许进入的环境。
4.DNA传递：农杆菌通过T4SS释放线性转化DNA，并借助激发剂打开DNA链，并且该辅助剂经常与T-DNA共同转移到植物细胞总群落中。
5. 植物细胞再生：经过切伤或孔洞进入植物细胞的转化DNA在细胞质中被转录，转录本通过RNA splicing进一步处理并通过核孔复合物进入细胞核。
在细胞核中，转录本通过与受体蛋白结合而在柏氏体中形成mRNA。
mRNA会进一步被转录为蛋白质，这些蛋白质会促进植物细胞再生。
1.植物物种：不同植物物种对于农杆菌的感染和转化效率具有差异。
有些植物对农杆菌的感染和转化具有天然的耐受性或敏感性。
2.植物组织类型：不同植物的不同组织对于农杆菌的感染和转化效率也有所差异。
例如，幼嫩的愈伤组织对于农杆菌的感染和转化效率通常较高。
3.农杆菌菌株：不同菌株具有不同的亲和力和感染能力。
有些农杆菌菌株能够高效地感染和转化植物细胞，而有些菌株效率较低。
4.结构改造：农杆菌通过改造表面酶结构以增加其细胞壁附着能力，从而提高农杆菌感染和转化效率。
5.切伤或孔洞大小：适当的切伤或孔洞大小能够促进农杆菌介导植物转化的效率。
切伤或孔洞过小会限制转化DNA进入细胞，而切伤或孔洞过大则会增加细菌感染的难度。
总之，农杆菌介导植物转化是一种复杂的生物学过程，其效率受到多个因素的影响。
进一步研究和优化这些因素可以提高农杆菌介导植物转化的效率，为植物遗传工程提供更多的可能性。
农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素
农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素农杆菌介导植物转化是一种常用的基因转化技术，利用农杆菌转化DNA进入植物细胞，使其表达目的基因。
在这个过程中，农杆菌的外源DNA会被单胞菌分泌物（Vir）基因编码的蛋白质工具分子T-DNA结合酶（VirD2）切割成目标T-DNA片段，然后T-DNA和Vir蛋白质工具分子挤进被切开的植物细胞，最终整合入植物细胞的染色体中。
1.农杆菌菌株：农杆菌菌株的选择对转化效率有重要影响。
通常选择具有较高转化效率的农杆菌菌株，如LBA4404、GV3101等。
不同的菌株对于不同的植物种类和品种可能有不同的适应性，因此需要根据具体情况进行选择。
2.感受性植物：不同植物对农杆菌介导植物转化的感受性各不相同，高度感受性的植物容易进行转化。
除了感受性外，植物的再生能力也是影响转化效率的因素之一、通常来说，拥有较高再生能力的植物对转化更加容易。
3.T-DNA载体：T-DNA载体是构建农杆菌介导植物转化载体的关键。
在农杆菌介导植物转化过程中，目标基因的载体必须经过农杆菌系统与植物细胞进行相应的介导，进而整合到植物细胞基因组中。
选择合适的T-DNA载体进行构建，可以提高转化效率。
此外，T-DNA载体中导入基因的拷贝数、插入位点的选择等也会对转化效率产生影响。
4.辅助物质：除了基础的转化体系以外，辅助物质也是影响转化效率的一个重要因素。
辅助物质主要包括感受性缓解物质、抗生素等。
感受性缓解物质主要用于保护不同类型的植物细胞免受农杆菌侵染造成的伤害，提高细胞存活率；抗生素主要用于抑制农杆菌菌落的生长，避免菌落过度生长对植物细胞的负面影响。
辅助物质的添加可以有效增加转化效率。
5.转化条件：转化温度、菌液浓度、转化时间等转化条件也会对转化效率产生影响。
具体条件需要根据植物种类和品种的特点进行优化。
总之，农杆菌介导植物转化主要是通过农杆菌菌株和植物的相互作用引发变化，其转化效率受多个因素的综合影响。
农杆菌介导法
农杆菌介导法实验九植物遗传转化——农杆菌介导法⼀、⽬的了解农杆菌转化的机理；掌握农杆菌介导转化⽔稻的技术⼆、原理根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)具有跨界转移DNA的能⼒。
下列因⼦与转化过程有关：1. Ti 质粒(tumor-inducing plasmid)上的T-DNA (transferred DNA)T-DNA是农杆菌Ti质粒上能够转移到植物基因组的⼀段DNA序列。
T-DNA含有RB和LB两个边界，它们是25bp的正向重复序列，是T-DNA 转移的顺式作⽤元件。
不同类型的农杆菌其边界序列有所不同，但划线部分为完全保守序列。
置于该边界内的任何外源基因均可被转化。
LB缺失突变后农杆菌仍能致瘤，但RB缺失会导致致瘤能⼒丧失，这时⼏乎完全没有T-DNA的转移。
LB（－链）5’GT TTACACCACAA TA TATCCTG CCA 3’RB（＋链）5’TGA CAGGA TA TA TTGGCGGGTAA AC 3’2. Ti质粒上的Vir区（virulence region）操纵⼦转化所必需的基因有vir A、B、C、D、E、G。
其中蛋⽩VirD1/D2识别T-DNA边界RB和LB；VirC识别T-DNA右边界的超驱增强⼦；VirD2在T-DNA底链起内切酶作⽤造成切刻，并与T－链5’ 共价结合，带有1个核定位信号NLS；VirB形成转移复合通道；VirE2为单链DNA 结合蛋⽩，有2个NLS。
该操纵⼦的表达顺序如下：vir A和vir G组成型表达形成VirA和VirG蛋⽩→VirA被植物创伤信号分⼦激活→激活的VirA使VirG激活→激活的VirG 诱导vir C、D、E、B、F、H表达。
3. 农杆菌染⾊体基因组相关基因：chv A、chv B（农杆菌运动、附着）、chv D、chv E（编码单糖结合蛋⽩、趋化性）、pscA、att、cel（合成纤维素丝，附着）。
农杆菌转化原理及技术
农杆菌介导遗传转化的原理
❖ 农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌，分为发根农杆菌 （导致毛状根的发生）和根癌农杆菌（导致冠瘿瘤， 冠瘿瘤细胞可产生正常细胞不能产生的冠瘿碱）。
❖ 根癌农杆菌含有可向植物转移并使植物致瘤的质粒 （Ti质粒）。
❖ 根癌农杆菌的Ti质粒包括毒性区（Vir区）、结合区 （Con区）、复制起始区（Ori区）和T-DNA区四个部 分，其中与冠瘿瘤生成有关系的是Vir区和T-DNA区。
Bacterial T-plasmid produces receptors for acetosyringone
Plant wound produces acetosyringone
Produce callus transform callus stimulate shooting by cytokinin addition
复杂
复杂
简单
无
嵌合体比例
有
无
无
无
多
无
操作复杂性 简单
简单
复杂
复杂
复杂
简单
设备要求
便宜
便宜
昂贵
昂贵
ห้องสมุดไป่ตู้
昂贵
便宜
工作效率
高
低
低
低
高
低
单子叶植物
少
应用
可行
可行
可行
广泛
广泛
农杆菌介导法的优点
❖ 操作简便 ❖ 外源基因插入一般为单拷贝或低拷贝 ❖ 转移DNA片段明确 ❖ 可转移大片段DNA ❖ 可直接用不同的植物组织进行基因转移
胚性愈伤
三、农杆菌介导转化水稻
❖ 1. 愈伤组织的预培养
❖ 选取自然分散、颜色鲜黄、直径约为2-3mm的颗粒 状愈伤，转接到预培养培养基中，置于27℃暗培养 4天。
农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素
二、农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素转化机制：与植物基因转化有关的农杆菌有两种类型:根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）。
根癌农杆菌含有Ti 质粒。
发根农杆菌含有Ri 质粒.根癌农杆菌的Ti 质粒和发根农杆菌Ri 质粒都具有一段转移DNA （transfer DNA，又称T-DNA)，在农杆菌侵染植物时，T-DNA 可以插入到植物基因组中，使其携带的基因在植物中得以表达。
由于T-DNA 能够进行高频率的转移，而且Ti 质粒和Ri 质粒上可插入大到甚至150kb 的外源基因，因此，Ti 质粒和Ri 质粒成为植物基因转化中的理想载体系统。
1 与农杆菌转化相关的基因与转化相关的基因主要包括农杆菌染色体上的基因和Ti 质粒上T—DNA 以外Vir 区的基因。
染色体基因包括chvA、chvB、att、pscA、chvD 以及chvB。
它们大多编码一些膜相关蛋白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。
ChvD 蛋白可能在低pH 和磷酸饥饿情况下提高VirG 蛋白的合成水平。
ChvE 与VirA 蛋白共同对virG 起激活作用。
原始的Ti质粒根据其功能的不同，可分为4个区：（1）T—DNA区:是在农杆菌侵染细胞时,从Ti质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA,其携带的基因与肿瘤的形成有关,但与T-DNA本身的转移与整合无关.T—DNA上最重要的是两端的2个边界(LB和RB)，它们是T-DNA转移所必需的。
只要其存在，T—DNA 可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中， T—DNA的右边界在T—DNA的整合中对于靶DNA位点的识别具有重要作用，因此,尤以右边界更为重要．（2）毒性区：位于T—DNA以外的1个30～40 kb的区域内，该区段编码的基因但对T-DNA 的转移和整合非常重要．这些基因也称为Ti质粒编码毒性基因(vir)。
农杆菌转化的实验报告
一、实验目的1. 掌握农杆菌转化法的基本原理和操作步骤。
2. 将抗虫基因导入植物细胞，观察转化效果。
二、实验原理农杆菌转化法是一种将目的基因导入植物细胞的方法。
该方法利用农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）将目的基因转移到植物细胞中，并整合到植物细胞染色体DNA上，从而实现目的基因的遗传表达。
三、实验材料1. 植物材料：拟南芥种子、生长培养基、诱导培养基、选择培养基。
2. 农杆菌：根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）。
3. 抗虫基因：Bt基因。
4. 工具酶：限制性内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶。
5. 试剂：LB液体培养基、LB固体培养基、IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）、抗生素、CaCl2、DNA标记染料等。
四、实验步骤1. 目的基因克隆（1）设计引物：根据Bt基因序列设计一对引物，用于扩增Bt基因。
（2）PCR扩增：以Bt基因的DNA为模板，进行PCR扩增。
（3）克隆：将PCR产物连接到载体上，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆。
2. 农杆菌工程（1）制备感受态农杆菌：将根癌农杆菌接种于LB液体培养基，37℃培养过夜，按1:100的比例接种于新鲜的LB液体培养基，37℃培养3小时，加入IPTG和CaCl2，使农杆菌进入感受态。
（2）目的基因转化：将克隆有Bt基因的载体与感受态农杆菌混合，在冰浴中孵育30分钟，然后将混合液涂布于含有抗生素的LB固体培养基上，37℃培养过夜。
3. 植物转化（1）种子处理：将拟南芥种子用70%酒精消毒后，用无菌水冲洗干净。
（2）农杆菌感染：将处理好的种子接种于含有农杆菌的培养基上，28℃恒温培养3天。
（3）筛选转化植株：将感染后的种子接种于选择培养基上，筛选出转化植株。
4. 抗虫鉴定（1）PCR检测：提取转化植株的DNA，进行Bt基因的PCR检测。
（2）生物测定：将转化植株与抗虫性差的拟南芥进行抗虫性比较，观察转化植株的抗虫效果。
不同因素对农杆菌介导的杉木转化效率的影响
第43卷第3期2007年3月林业科学SCIE NTIASILVAESINICAEVol .43,No .3Mar .,2007不同因素对农杆菌介导的杉木转化效率的影响＊席梦利 施季森(南京林业大学国家林业局林木遗传和基因工程重点实验室 南京210037)摘 要: 以杉木试管苗靠近茎尖的茎段为受体材料,研究6个影响杉木遗传转化效果的因素,初步确定杉木茎段较为合适的转化体系为:预培养1～3d ,OD 600nm 为0.1～0.4的菌液浸染10～15min ,共培养3～5d ,共培养基附加乙酰丁香酮(AS )80μmol ·L -1,共培养后延迟3d 筛选。
在初次筛选培养基上共得到186个卡那霉素(Km )抗性芽,在二次筛选培养基上获得39个Km 抗性芽。
PCR 检测有2个Km 抗性芽呈稳定阳性,初步证明外源天麻抗真菌蛋白(GAFP )基因已整合到这2个Km 抗性芽的基因组DNA 中。
关键词: 杉木;农杆菌介导;天麻抗真菌蛋白基因中图分类号:S718.46;Q943.2 文献标识码:A 文章编号:1001-7488(2007)03-0046-05收稿日期:2006-01-10。
基金项目:国家自然科学基金项目(30170745)和江苏省高校省级重点实验室开放课题(KJS03035)资助。
＊施季森为通讯作者。
A n Assessment of Factors Influencing the Efficiency of Transformation ofCunninghamia lanceolata Mediated by Agrobacteriu m tu mefaciensXi Mengli Shi Jisen(Key La bo r ato r y of Fo r es t Tr ee Gen etic s a nd G ene En gin eer ing ,S t ate Fo r est ry A dminis tr atio n Na nj ing For es tr y Uni ver sity Na nji ng 210037)Abstract : Using plantlet shoot sec tions near the shoot tip as explants ,after studying the six factor s to affect transfor mation ,we have preliminar ily deter mined an effective system for genetic transfor mation .The protocol was :1～3days for pre -cultur e ,OD 600nm =0.1～0.4,10～15minutes for infec tion ,3～5da ys for c o -cultur e ,and ac etosyringone (AS )80μmol ·L -1as co -culture medium ,and then lasting 3da ys before selecting .And then 186regenerated kanamycin (Km )-resistant buds wer e obtained fr om the first selection medium .39Km -r esistant buds were obtained fr om the second selection medium .PCR anal ysis on 39regenerated Km -resistant buds sho wed that 2buds wer e PCR positive .The result indic ated that gastrodia antifungal protein (GAFP )gene was integrated into the geno me of the two Km -r esistant buds .Key words : Cunninghamia lanc eolata ;Agrobac te rium tume faciens mediated transfor mation ;gastr odia antifungal protein gene针叶树种生长周期长、树体高大,而且由于长期异交,具有高度的杂合性和大量的遗传负荷(王明庥,2001),因此传统育种周期长,难以适应速生树木遗传改良的需要。
农杆菌转化机理
农杆菌转化机理
农杆菌转化机理
农杆菌转化是一种广泛应用于生物工程和植物基因转化领域的技术，它的原理是通过利用农杆菌的自然基因转移能力，将外源DNA序列导入到目标细胞中。
农杆菌具有天然的DNA转移系统，能够将外源DNA经由细胞壁孔道导入细胞质内，再由各种核酸酶剪切，将DNA 外源序列整合到宿主染色体上。
农杆菌转化是一种相对简单的基因转化技术，其操作过程主要包括以下几个步骤：
1.农杆菌的预处理。
通过诱导剂和渗透压等手段，使其细胞壁松弛，增加其与外界交换物质的通透性，从而达到提高转化效率的目的。
2.目标细胞的前处理。
使其表面上的细胞壁稳定并与农杆菌结合，以便农杆菌能够将外源DNA导入到目标细胞内。
3.农杆菌的感染。
将预处理过的农杆菌与目标细胞接触，使其通过感染方式向目标细胞内输送外源DNA序列。
4.外源DNA序列的整合。
在接触过程中，农杆菌通过其自身的转移机制将外源DNA序列整合到目标细胞染色体的特定区域，从而实现外源基因导入。
此外，农杆菌转化机理还受到一些因素的影响，如接触时间、温度、菌株和目标组织细胞类型、外源DNA序列大小和复杂性等。
因此，在实际的应用中需要针对具体的情况进行优化和调整，以达到最佳的转化效果。
总之，农杆菌转化是一种简单高效的基因转移技术，已经被广泛应用于生物工程和农业生产中，在许多方面都有着重要的应用价值。
随着生命科学技术的不断发展，人们对于农杆菌转化及其机理的研究也将越来越深入，相信这将为该技术的进一步应用和发展带来新的机遇和挑战。
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二、农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素转化机制：与植物基因转化有关的农杆菌有两种类型：根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）。
根癌农杆菌含有Ti 质粒。
发根农杆菌含有Ri 质粒。
根癌农杆菌的Ti 质粒和发根农杆菌Ri 质粒都具有一段转移DNA (transfer DNA，又称T-DNA)，在农杆菌侵染植物时，T-DNA 可以插入到植物基因组中，使其携带的基因在植物中得以表达。
由于T-DNA 能够进行高频率的转移，而且Ti 质粒和Ri 质粒上可插入大到甚至150kb 的外源基因，因此，Ti 质粒和Ri 质粒成为植物基因转化中的理想载体系统。
1 与农杆菌转化相关的基因与转化相关的基因主要包括农杆菌染色体上的基因和Ti 质粒上T-DNA 以外Vir 区的基因。
染色体基因包括chvA、chvB、att、pscA、chvD 以及chvB。
它们大多编码一些膜相关蛋白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。
ChvD 蛋白可能在低pH 和磷酸饥饿情况下提高VirG 蛋白的合成水平。
ChvE 与VirA 蛋白共同对virG 起激活作用。
原始的Ti质粒根据其功能的不同，可分为4个区：（1）T-DNA区：是在农杆菌侵染细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA，其携带的基因与肿瘤的形成有关，但与T-DNA本身的转移与整合无关。
T-DNA 上最重要的是两端的2个边界(LB和RB)，它们是T-DNA转移所必需的。
只要其存在，T-DNA可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中， T-DNA的右边界在T-DNA的整合中对于靶DNA位点的识别具有重要作用，因此，尤以右边界更为重要．（2）毒性区：位于T-DNA以外的1个30~40 kb的区域内，该区段编码的基因但对T-DNA 的转移和整合非常重要．这些基因也称为Ti质粒编码毒性基因(vir)。
（3）接合转移区：该区段存在有与细菌间接合转移有关的基因(tra)，调控Ti质粒在农杆菌间转移。
（4）复制起始区：该区段调控Ti质粒的自我复制。
在遗传转化过程中除了Ti质粒上的基因参与外，还有农杆菌染色体基因。
染色体基因包chvA、chvB、att、pscA、chvD 以及chvB。
它们大多编码一些膜相关蛋白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。
延伸因子P对于农杆菌的生长非常重要，但非必需．高水平的糖结合蛋白一ChvE可以扩大VirA蛋白对酚类物质的识别范围。
结合ATP盒式转运体类似物蛋白ChvD，参与Vir区基因的表达调控，chvD基因座中插入无启动子的lacZ，农杆菌侵染力以及Vir区基因表达量大大下降，ChvD突变体中virG组成型表达侵染力则得以恢复，这一现象说明ChvD通过影响virG表达控制毒性。
2 Vir 基因的诱导表达机制在植物受到创伤后，创伤组织的细胞释放出创伤信号——酚类化合物，如乙酰丁香酮。
当农杆菌接受到此类信号时，其vir 区基因可被诱导转录。
另一类诱导化合物是组成植物细胞壁的一些特异单糖，As 和单糖可协同诱导Ti 质粒上vir 区基因的表达。
Vir 区基因的活化首先是从virA 基因开始的。
VirA 蛋白是一种结合在膜上的化学受体蛋白，可直接对植物产生的酚类化合物感应，其感应部位可能位于胞质区域。
VirA 蛋白的胞质区域有自激酶的功能，自身被磷酸化激活后，使VirG 蛋白活化。
VirG 蛋白是DNA 结合活化蛋白，可以以二体或多体形式结合到vir 启动子的特定区域，从而成为其它vir 基因转录的激活因子，打开VirB、virC、virD、virE、virH 等几个基因。
ChvE 可大大增强vir 基因被As 诱导的效果，ChvE 可结合一些单糖，也可直接与VirA 周质区相互作用，以加强As 对Vir 基因的诱导。
3 T-DNA 复合物的形成T-DNA 的加工与转移是由Vir 基因被诱导后产生的蛋白完成。
VirD基因编码的两个产物VirD1和VirD2直接参与加工过程。
VirD1 蛋白是一种拓扑异构酶，可将超螺旋型DNA 变成松弛型DNA。
VirD2 蛋白具有特异剪切单链DNA 的内切酶活性，它可以识别T-DNA 底链边界重复序列上的特定位点，并在底链24 bp 重复序列和第四个碱基之间切割，将T-DNA 从Ti 质粒上剪切下来，称为T-strand 或T-链。
切开T-DNA后，VirD2 蛋白与T-链的5，端共价结合，避免核酸外切酶降解T-链。
新的T-DNA 底链以此链为模板，从右端产生的DNA 缺口处以5’-3’方向进行合成。
被取代的旧链游离出来，与许多VirE2 蛋白分子结合组成T-DNA 复合体。
此外，VirD2 作为一个导向蛋白，可以指导整个T-DNA 复合体（或叫T-复合体）从农杆菌进入到植物细胞核。
4 T-DNA 复合物的跨膜转运农杆菌的T-DNA 转移通道由多达12 种蛋白组成，包括两个主要部分：纤毛附属丝（或纤毛）和膜结合复合体。
该通道也可称为T-复合体运输器，由virB 编码的11 种蛋白和VirD4 蛋白组成。
VirB1可在细菌膜上为T-复合体运输器的装备提供位点；VirB2 和VirB5 可被移动到细胞表面形成纤毛；其余的VirB、VirD4 为T-复合体的运输提供能量。
合成的T-复合体经过T-复合体运输器，以类似于细菌转导过程的方式注射到植物细胞内，并在VirD2 和VirE2 的核定位信号（NLS）序列引导下，以VirD2为先导向植物细胞核运动。
在人工构建的质粒中，vir 基因和T-DNA 可以放在同一个质粒上，也可以放在不同的质粒上。
影响转化效率的因素1、菌株染色体背景不同农杆菌株的类型的chv基因决定了其对受体细胞的识别和附着能力的差异。
根癌农杆菌的胭脂碱型和琥珀碱型生长快、不结球，转化易于操作，但共培养时菌体附着能力较差：章鱼碱型则生长慢、易结球，转化难于操作，但共培养时菌体附着后不易洗去。
2、共培养方式农杆菌转化的共培养介质可以是细菌培养基或植物受体培养基。
烟草等对农杆菌侵染比较敏感的植物的共培养时间一般较短，液体细菌培养基介质应用较多。
许多单子叶植物等不敏感植物受体与农杆菌共培养时间一般较长，用细菌培养介质容易造成农杆菌过度繁殖，导致植物外植体呼吸作用抑制和细菌分泌物毒害，因此多采用液体植物培养基作为共培养介质。
3、侵染浓度和时间农杆菌适宜的侵染浓度和时间因外植体对侵染的敏感性不同而有很大差异。
浓度过高、时间过长会引起农杆菌细胞间的竞争性抑制，而且过度增殖会抑制受体细胞的呼吸作用；浓度过底、时间过短则造成受体细胞表面农杆菌附着不足。
禾谷类作物一般侵染浓度较高，Hiei用LBA4404(pTOK233)转化水稻的最佳接种浓度为OD600=0.8~1.0， Ishida 用LBA4404(pSB131)转化玉米幼胚采用的侵染浓度为OD600=2.0；但烟草、大白菜等对侵染敏感的双子叶植物要求菌体浓度要低的多,一般为OD600= 0.5。
4、共培养条件（1）共培养温度农杆菌在20~30℃的范围内都可以生长，不同研究结果中vir区基因表达的适宜温度有一定差异，但多数在20~25℃获得较高的表达水平[]。
外植体生长温度也一般在此范围内，所以通常选取外植体的最佳生长温度为共培养温度，通常在25℃左右。
（2）共培养PH值研究人员普遍认为酸性培养环境有利于农杆菌的侵染。
因为植物细胞释放的对农杆菌有趋化作用的化学物质（如酚类、糖类）虽然在不同酸碱度下比较稳定，但在pH=5.0~5.8时对vir基因的诱导能力最高。
（3）诱导物和抑制物酚类是vir区基因表达的主要信号物质。
酚类物质产量低一度被认为是影响农杆菌转化，特别是单子叶植物转化的主要原因之一。
在众多的酚类物质中，乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮诱导能力较强，AS的促进效果与菌株类型、植物材料种类和共培养培养基的pH值有关。
没食子酸、二羟基苯甲酸、香草酚、儿茶酚、对羟基苯酚等多酚混合处理农杆菌也有很高的作用，但不同酚类物质是否有累加效应在不同研究结果中不近相同。
不同农杆菌类型对酚类物质的敏感性不同，根癌农杆菌的章鱼碱株系比胭脂碱系需要更高的酚类物质诱导，发根农杆菌的农杆碱型比甘露碱型对酚类物质刺激的敏感性更低。
糖类等小分子,这些小分子一方面可作为化学源吸引农杆菌的趋化运动,另一方面可诱导或抑制农杆菌vir基因的表达。
而糖类的主要作用是与农杆菌染色体毒性蛋白ChvE结合,激活virA蛋白进而诱导vir基因高水平表达和扩大农杆菌的寄主范围。
特别在AS浓度很低的情况下,它们可强烈诱导vir基因的表达,并且与AS存在协同效应,可显著提高AS诱导效果。
糖类在不含酚类化合物的情况下效果较明显,但是糖类和酚类化合物同时存在时却没有明显的协同效应。
多胺也参与植物宿主和病原之间的相互作用。
Kumar等曾用多胺物质对农杆菌进行活化后侵染烟草做GUS瞬时表达研究,结果表明农杆菌的侵染活力显著提高。
（4）共培养时激素的添加、有无光照共培养培养基中添加生长素、细胞分裂素对转化更有利。
而光照的有无要是植物种类而异。
5、受体类型和生理状态不同基因型对农杆菌侵染敏感性有差异。
目前用过的受体材料有叶盘、叶柄、根尖根段、茎尖茎段、幼穗、花药、子叶（柄）、胚或其部分结构（胚轴）、芽等，可以看出分生组织是较通用的受体。
分生能力强的植物细胞对农杆菌敏感，活跃的细胞分裂促进了T-DNA的整合。
6、预培养培养基外植体进行共培养前,在含有外源激素的培养基上预培养一段时间,使植物组织代谢活跃,促进细胞分裂,分裂状态的细胞更易整合外源DNA,从而提高外源基因的瞬时表达和转化率。
有人认为,在预培养时降低钙的含量会促进农杆菌的侵染。
钙在对致病微生物抵抗方面起到重要作用,而钙的不足会引起细胞壁结构的改变,这种改变使农杆菌更容易附在愈伤上,增强农杆菌对愈伤的感染能力。
7、接种方式比较常用的接种方式是将外植体置于侵染液中浸泡,时间长短视菌种和外植体种类而异。
有的研究者在浸泡的基础上结合了振荡进行接种，振荡培养能打破细胞表面的气泡,使农杆菌与外植体的接触面增大,有利于农杆菌侵染。
近年来,在提高遗传转化效率方面发展了一些新技术,如超声波辅助农杆菌介导法、负压与农杆菌介导结合法以及基因枪与农杆菌介导结合法等,均可增强农杆菌浸染,提高转化效率8、感受态细胞保存条件有实验表明，农杆菌感受态细胞以新鲜制备时效果较好，农杆菌感受态细胞在4℃保存7 d以内时进行转化可以得到部分转化子，而用甘油保存置于-20℃和-58℃的感受态细胞转化效率较低。
不过应该根据自己的试验情况进行优化。