农杆菌的活化培养及介导的遗传转化
生物学中的植物遗传转化与基因编辑技术
生物学中的植物遗传转化与基因编辑技术植物遗传转化与基因编辑技术在生物学中的应用植物遗传转化与基因编辑技术是生物学领域中的重要研究方向，它们可以用于改良植物品种、提高农作物产量和抵抗力、开发新型植物药物等。
一、植物遗传转化技术的原理和方法植物遗传转化是指将外源基因或DNA片段导入植物细胞，并使其稳定地遗传给后代。
常见的植物遗传转化方法包括农杆菌介导的遗传转化、基因枪法和凯南法等。
1. 农杆菌介导的遗传转化农杆菌介导的遗传转化是最常用的植物遗传转化方法之一。
该方法利用土壤中广泛存在的植物病原性农杆菌将外源基因导入目标植物细胞。
首先，将外源基因插入农杆菌质粒的T-DNA区域，然后将农杆菌通过注射或浸泡等方式导入植物细胞。
在遗传转化后，利用选择标记基因或报告基因进行筛选和检测。
2. 基因枪法基因枪法是将DNA载体以高速射击的方式直接导入植物细胞。
将外源基因负载在金粒等微粒表面，然后使用高压氦气或火药等加速器将其射入植物细胞。
在转化后，通过培养基中的选择性筛选剂来筛选转化的细胞。
3. 凯南法凯南法是一种基于物理和化学手段的遗传转化方法。
通过利用聚乙烯醇（PEG）或电击等方法，使DNA能够与植物细胞质融合，然后通过培养和筛选等步骤来获得转化的植物细胞。
二、基因编辑技术在植物遗传改良中的应用基因编辑技术是指通过精确地修改植物基因组中的特定位置，实现遗传改良的方法。
常见的基因编辑技术包括CRISPR-Cas9系统、TALENs和ZFNs等。
1. CRISPR-Cas9系统CRISPR-Cas9系统是一种高效、快速和精确的基因编辑技术。
它利用CRISPR RNA（crRNA）和转录单元RNA（tracrRNA）组成的复合物与Cas9蛋白结合，以形成靶向特定基因序列的复合物。
在植物中，CRISPR-Cas9系统被广泛应用于基因敲除、基因敲入和基因修饰等方面。
通过将CRISPR-Cas9系统导入植物细胞，可以实现对植物基因组的精确编辑。
农杆菌介导遗传转化原理
!
冠瘿碱代谢基因
农杆菌转化植物的过程 •植物受伤部位酚类化合物的分泌 •附着（chvA、chvB） •VirA/G的双组分系统感受受伤信号 （signal to A Pi to G） •其他Vir基因的表达 •T-DNA链的切出（VirD1+VirD2；Border to Border） •T-complex的形成 •运输（从细菌中输出、进入入植物细胞、入入核） •整合
A
B
C
PCR（A）、RT-PCR（B）和 Southern（C）鉴定结果
影响植物农杆菌转化效率的因素 •植物品种（基因型效应）； •农杆菌菌株及载体； •起始材料； •侵染所用用菌浓度（OD值）； •共培养条件(温度、时间、光照、培养基成分)； •共培养之后的筛选方方式； 等等；
农杆菌介导的 植物遗传转化
农杆菌的分类 革革兰氏氏阴性菌、杆状； 按侵染植物的后果分为： •根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens） 形成冠瘿（crown gall） •发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes） 形成发根（hairy root）
按合成/代谢冠瘿碱（Opine）的种类，根癌农杆菌分为 ： •章⻥鱼碱（Octopine）型 •胭脂碱（Nopaline）型 •农杆碱（Agropine）型
The Plant Cell, Vol. 18, 3350–3352
冠瘿病的害处： 苗木木感病后发育受阻；生生⻓长缓慢；植株矮小小；严重 时叶片片萎蔫、早衰，甚至至死亡； 大大树受害后树势衰弱，生生⻓长不良，提前落叶，果实 变小小，树龄缩短。主干受害降低材质及工工艺价值。
农杆菌能够导致植物产生生冠瘿病的原因： Ti（Ri）质粒
•T-complex的转运 通过细菌细胞壁上由11个VirB蛋白白和VirD4组成的通 道从农杆菌向外输出
农杆菌介导的基因转移技术研究
农杆菌介导的基因转移技术研究基因转移技术是生命科学中重要的研究领域之一。
它通过改变生物的基因组来达到特定的遗传目的，是基因工程学和分子生物学的基础。
在这个领域中，农杆菌介导的基因转移技术是一种被广泛应用的方法。
农杆菌是一种存在于土壤中的细菌，它能够将自身的DNA转移到植物细胞中。
这种天然的基因传递现象成为“农杆菌介导的基因转移”，并引起了科学家们的广泛关注。
1983年，美国科学家玛丽-迪勒·钱普曼（Mary-Dell Chilton）等人对农杆菌基因转移技术进行了开发和改进，并取得了一定的成果。
农杆菌介导的基因转移技术原理农杆菌介导的基因转移技术基于细菌和植物细胞的特性，通过把外源DNA序列转移到植物细胞中，从而改变植物的遗传特性。
其主要包括以下步骤：1. 选择合适的农杆菌：选用能够产生阿加洛生长因子（Acetosyringone）的农杆菌株，使其感染植物时能够产生足够的诱导剂。
2. 制备可重组质粒：将外源DNA序列与质粒DNA进行连接，并在其中添加选择标记基因和表达基因等元素，形成可重组的质粒。
3. 转化幼苗：切取幼苗的叶片，将其在含有抗生素和选择标记基因的转化培养基上进行培养，使农杆菌侵入植物细胞并将可重组质粒传递给植物。
4. 筛选转化植物：通过筛选转化培养基中生长出的植株，筛选出含有目标基因的植株并遗传稳定，最终得到转基因植物。
优势和应用农杆菌介导的基因转移技术可以实现外源基因在植物细胞中的稳定转移，并且转化数量大、成功率高，同时具有转化效率高、适用性广、对植物的损伤小等优势。
因此，农杆菌介导的基因转移技术被广泛应用于农业、药物、生物燃料等领域中，为人类生产和经济发展做出了重要贡献。
在农业领域，农杆菌介导的基因转移技术可以应用于粮食、蔬菜、水果等作物的改良和栽培，增加产量、改善品质、提高抗病性等；在药物领域，它可以用于药用植物的生产和基因组编辑，进而形成新的制药或疗法；在生物燃料领域，计划利用农杆菌介导的基因转移技术改良木质素的生产，提高油脂等生物质的产量。
农杆菌介导的作物遗传转化研究进展
展对 改善作 物 的逆境 胁迫耐 受性 和增加 作物 产量 具 有非 常重要 的 意义 。农杆 菌介 导 的遗传 转化 在植 物
转基 因研究 中具 有重 要 的应 用 价值 ， 为此 ， 对其相 关
研究 进展进 行综 述 。
忍 受 的范 围 ， 就构 成 了作 物 生 长 的“ 境 ” 逆 。逆境 包
Ａｇ ｏ ａ ｔ ｒ ｕ ｍｅ ｉｔ ｄ ｍｏ ｅ ｕ ａ ｅ ｈ ｎ ｓ ，ｈ ｐ ｌ ａ ｉ ｎ ｏ ｒ ｎ ｇ ｎ ｃｍａ ｋ ｒｇ ｎ ｓ ｔ ｅ ｄ — ｒ ｂ ｃ ｅ ｉ ｍ— ｄ ａ ｅ ｌ ｃ ｌ ｒｍ ｃ ａ ｉ ｍ ｔ ｅａ ｐ ｉ ｔｏ ｆｔａ ｓ ｅ ｉ ｃ ｒ ｅ ｅ ｅ ，ｈ ｅ
括 病虫 害等 生物 胁迫 和低温 、 干旱 、 高盐 等非 生物胁
迫 ， 使植 物受 到伤害甚 至 死亡 ， 致 严重影 响 了作物 的 产 量和 品质 。随 着人 们 生 活 水平 的提 高 ， 靠 传 统 仅 育种 已难 以 在 作 物 产 量 和 品 质 方 面 满 足 人 们 的 需 求 ， 提高作 物 的产量 和 品质 ， 物 和非生 物胁迫 信 为 生 号传导 中相 关基 因 的研 究 以及 品质基 因和转 基 因研
的 分 子 机 制 、 记 基 因的 应 用 、 物 转 化 研 究 进 展 和 转 基 因 应 用 前 景 。 标 作
关键 词 ：作物 ；农杆 菌 ； 传 转化 ；标记 基 因 ；转基 因 遗 中图分类 号 ： ８ Ｑ７ 文 献标 识码 ： Ａ 文章 编 号 ：１ ０ ３ ６ （０ １ １ —０ ０ 一Ｏ ０ ４— ２ ８ ２ １ ） ０ ０ ６ ４
农杆菌介导单子叶植物遗传转化研究
种业导刊，2022年第6期Journal of Seed Industry Guidedoi:10.3969/j.issn.1003-4749.2022.06.003农杆菌介导单子叶植物遗传转化研究进展刘文欣（山东农业大学生命科学学院，山东泰安271018）摘要：随着分子生物学的迅猛发展，农杆菌介导技术在转化机制、影响因素、转化率等方面的优势日益为世人所知，其应用也由原来的双子叶植物逐步过渡到以禾本科作物为主的单子叶植物。
基于农杆菌转化的机制，回顾了农杆菌转化技术在小麦、玉米和水稻这3种主要作物上的应用现状，总结了影响转化率的因素并提出了提高转化率的对策，以期为农杆菌转化单子叶植物技术的进一步改进与优化提供有效的借鉴。
关键词：农杆菌介导；单子叶植物；遗传转化；小麦；玉米；水稻中图分类号：S503.53文献标志码：A文章编号：1003-4749（2022）06-0011-06Advances in Agrobacterium ‑mediated Genetic Transformation of MonocotyledonsLIU Wenxin（College of Life Sciences ，Shandong Agricultural University ，Taian 271018，China ）Abstract ：With the rapid develpoment of molecular biology ，Agrobacterium ‑mediated technology has become increasingly known to the world in the transformation mechanism ，influencing factors ，conversion rate and other aspects ，and its application has gradually transferred from the original dicotyledons to monocotyledons dominated by gramineous crops.Based on the mechanism of Agrobacterium transformation ，this paper reviewed the application status of Agrobacterium transformation technology in wheat ，maize ，and rice ，briefly summarized the factors affecting the conversion rate and put forward the countermeasures to improve the conversion rate ，in order to provide effective reference for the further improvement and optimization of Agrobacterium transformation of monocotyledons.Key words ：Agrobacterium mediation ；Monocotyledons ；Genetic transformation ；Wheat ；Corn ；Rice收稿日期：2022-06-09作者简介：刘文欣（2002-），女，山东高密人，在读本科生，研究方向：生物科学。
植物基因转化常用方法(植物遗传,农杆菌、病毒介导和基因枪转化法)
一. 植物遗传转化的方法植物遗传转化技术可分为两大类：一类是直接基因转移技术，包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等，其中基因枪转化法是代表。
另一类是生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。
二.农杆菌介导的基因转化方法（一）农杆菌的Ti质粒与T-DNA的整合机制几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染，而产生根瘤。
它是一种革兰氏阴性土壤杆菌（A. tumefaciens）。
其致瘤特性是由Ti（tumor－inducing）质粒介导的。
农杆根瘤菌之所以会感染植物根部是因为植物根部损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质可以诱导Vir（Virulence region)基因的启动表达，Vir基因的产物将Ti 质粒上的一段T－DNA单链切下，而位于根瘤染色体上的操纵子基因产物则与单链T－DNA 结合，形成复合物，转化植物根部细胞。
T－DNA 上有三套基因，其中两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤。
第三套基因合成冠瘿碱，冠瘿碱有四种类型：章鱼碱（octopine）、胭脂碱（nopaline）、农杆碱（agropine）、琥珀碱（succinamopine），使农杆菌生长必需的物质。
1. Ti质粒的结构在发现根瘤农杆菌诱发冠瘿瘤的本质是Ti 质粒后，Ti质粒便成为冠瘿瘤形成基因鉴定与分析的主要研究对象。
Ti质粒大约在160～240kB之间。
其中T-DNA大约在15kb-30kb。
Vir基因区在36kb 左右。
除此之外，Ti质粒上还存在Con区（region encoding conjugation)和Ori区（origin of replication)。
T-DNA上共有三套基因和左右两个边界，LB和RB是长为25bp的末端反复重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。
遗传转化的方法和技术
遗传转化的方法和技术常见的遗传转化方法和技术包括农杆菌介导法、基因枪转化法和聚乙二醇-介导法等。
其中，农杆菌介导法是植物基因转化中使用最普遍的一种方法。
其Ti质粒具有将DNA整合到植物染色体上，并使之与植物内源基因同步表达的能力。
农杆菌介导法的具体步骤如下：1. Ti质粒的构建：利用农杆菌进行遗传转化前，必须对Ti质粒进行改造。
改造的目的有以下几点：去除T-DNA区的激素基因，因为激素基因的产物会导致转化细胞激素水平的不平衡而引起细胞的无限分裂，阻碍正常植株的再生。
保留T-DNA区的左右边界，尤其是左边界，以保证T-DNA的正常转化。
在去除的T-DNA区，增加至少一个可以在植物体内表达的选择基因，以使转化细胞易于被检测出来。
在T-DNA区外加一个可以克隆外源目的基因的多聚接口。
在T-DNA区外加一个抗菌素基因标记质粒，该基因只能在细菌中表达，而不能在植物中表达。
2. 外源基因的转化：除Ti质粒外，发根农杆菌的Ri质粒也已成为植物基因工程载体家庭中的新成员。
发根农杆菌感染植物伤口，向目的植物转入Ri质粒中的T-DNA，经一段时间后被感染的植物会在不定的部位生出发状根。
发状根没有向地性，可在无激素的培养基上培养生长，生长迅速并产生许多分枝，其增长速度一个月可增殖数倍到数百倍。
发根农杆菌对植物的这种作用主要依赖于其菌体中的Ri质粒。
例如通过发状根培养来生产只有在高度的根趋向分化细胞中才能产生的有用次生代谢物质等。
3. 外源基因的转化：一般而言，农杆菌只感染双子叶植物；但利用Ti质粒作载体已将外源基因导入了水稻、玉米、吊兰、石刁柏、香蕉等某些单子叶植物中。
农杆菌介导的遗传转化技术简单，易于掌握，对植物受体要求不严，绝大多数双子叶植物和少数单子叶植物的组织或器官均可，且转化频率较高，转化周期较短，是目前应用最广的一种植物遗传转化方法。
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农杆菌介导植物的遗传转化实验报告
农杆菌介导植物的遗传转化实验报告
本实验使用农杆菌介导植物的遗传转化技术，将外来基因导入到拟南芥植物中。
通过将拟南芥的幼苗浸泡在农杆菌中，再经过一定的培养条件，使外来基因被顺利地导入到拟南芥植物的细胞中，并观察到了转化成功的基因表达现象。
实验过程：
1. 构建外源基因载体——将目的基因把它克隆进载体中，构建出我们所需要的质粒；
2. 建立农杆菌表达载体——通过将农杆菌表达载体连接到质粒上，形成我们的转化载体；
3. 准备转化基质——通过将农杆菌营养培养在一定条件下，形成我们所需要的转化基质；
4. 转化拟南芥中——通过将拟南芥幼苗浸泡到农杆菌基质中，利用细胞壁酶和孔道蛋白结合作用，导入外源基因，最终实现基因转化；
5. 鉴定转化水平——通过将转化后的拟南芥植株置于含有抗生素的培养基中，筛选出转化成功的植株。
实验结果：
通过观察实验结果，我们发现拟南芥细胞成功地接受了外源基因，使其表达了目
的蛋白。
同时，通过筛选，我们也成功得到转化成功的植株。
结论：
农杆菌介导植物的遗传转化技术是一种有效的基因转化方法，可以将外源基因导入到植物细胞中，从而实现第二代遗传分析、基因功能研究、新品种选育等方面的应用。
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农杆菌的活化培养及介导的遗传转化一、目的要求通过实验掌握农杆菌的活化与培养技术与农杆菌介导获得目的基因的转化植株。
二、基本原理农杆菌共培养法最早是由Marton 等（1979 年）以原生质体为受体建立起来的，经过一系列改进后，目前已经成为最常用的转化方法。
共培养法是利用Ti 质粒系统，将农杆菌与植物原生质体、悬浮培养细胞、叶盘、睫段等共同培养的一种转化方法。
三、材料及方法1.含目的基因共整合载体或双元载体的根癌农杆菌。
2.植物幼苗。
（一）细菌培养液直接浸染法操作︰（1）无菌受体材料的准备︰叶片、睫段、胚轴、子叶等均可做受体材料，有两种来源。
取自无菌试管苗。
取自田间或温室栽培植株︰叶片、睫尖、睫段用蒸馏水冲冼1 遍后，70％乙醇洗45 秒，0.1％升汞消毒6～8 分钟，无菌水冲洗三遍，无菌滤纸吸干水分。
（2）受体材料预培养︰将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm 的小块或用6mm 打孔器凿成圆盘，无菌胚轴、睫切成约0.8～1cm 长的切段，接种在愈伤组织诱导或分化培养基上进行预培养，注意叶片近轴面向下︰预培养2～3 天，材料切口处刚刚开始膨大时即可进行侵染。
（3）农杆菌培养︰从平板上挑取单菌落，接种到20mL 附加相应抗生素的细菌培养液体培养基（pH7.0）中，在恒温摇床上，于27℃, 180r/ min 培养至OD600 为0.6～0.8。
取OD600 为0.6～0.8 的菌液，按1％～2％的比例，转入新配制的无抗生素的细菌培养液体培养基中，可在与上相同的条件下培养6 小时左右，OD600 为0.2～0.5 时即可用于转化；或同时加入100～500μmol/的AS；（4）侵染︰于超净工作台上，将菌液倒入无菌小培养皿中（可根据材料对菌液的敏感情况进行不同倍数的稀释）。
从培养瓶中取出预培养过的外植体，放入菌液中，浸泡适当时间（一般1～5 分钟，不同材料处理时间不同）。
取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。
（5）共培养︰将侵染过的外植体接种在愈伤组织诱导或分化培养基上（烟草为MS 十IAA0.5mg/L + BA2.0mg/L) ，在28℃暗培养条件下共培养2～4 天（光对某些植物的转化有抑制作用，故需暗培养，共培养时间因不同植物而异）。
（6）选择培养︰将经过共培养的外植体转移到加有选择压（以NPT－Ⅱ为标记基因时一般使用卡那霉素，烟草以100mg/L 的选择浓度为宜，其它植物需通过敏感实验确定）的脱菌（附加250～500mg/L 的羧芐青霉素或头孢霉素，抑制农杆菌生长）分化或愈伤组织诱导培养基上，在光照为2000～10000lx、25℃条件下进行选择培养。
（7）继代选择培养︰选择培养2～3 周后，外植体的转化细胞将分化出抗性不定芽或产生抗性愈伤组织，将这些抗性材料转入相应的选择培养基中进行继代扩繁培养，或转入附加选择压的生长或分化培养基中令其生长或诱导分化。
（8）生根培养︰待不定芽长到1cm 以上时，切下并插入含有选择压的生根培养基上进行生根培养，两周左右长出不定根。
（二）细菌的植物组织培养基悬浮液浸染法此方法与上述的细菌培养液直接侵染法不同之处是用于侵染的农杆菌被悬浮在植物组织培养液（如1 / 2MS 、MS 或其它培养液中），而不是细菌培养液（如YEB 或LB 等）中。
具体做法有两种︰（1）在超净工作台上，将按上述方法培养的OD600 为0.6～0.8 的菌液，转入无菌离心管中，于室温条件下，4000r/min 离心5 分钟，去掉上清液．菌体用MS 液体培养基（pH5.4～5.8）重悬，稀释至OD600为0.2 左右，用于转化。
（2）另一方法是取适量的OD600 为0.6～0.8 的菌液加入到30～50 倍体积无激素的组织培养液体培养基中（pH5.8)，（同时可加入100μmol/L 的AS ) ，在上述条件下继续振荡培养2 ～ 4 小时，至OD600为0.2 左右时用于侵染。
说明︰（1）上述的各种做法．包括加入AS 及不加AS ，都能获得一定的转化率。
侵染时采用哪种做法，除要根据受位材料及菌株情况选定外，也有个人的习惯。
（2）如果共培养后，外植体周围菌体很多，转入选择培养时，可先用液体MS 培养基冲洗材料．吸干液体后再转入选择培养基。
但这种作法常常引起材料损伤，应尽量避免。
（3）为提高转化细胞成活率，可采用哺育细胞看护培养及延迟筛选的方法。
哺育细胞看护培羌是以迅速生长的植物细胞悬浮系（常用胡萝卜悬浮细胞系）为哺育细胞。
共培养对在共培养的培养基表面铺上一层哺育细胞层，然后覆诱@张无菌滤纸，将侵染后的材料成在滤纸上面进行共培养，哺育细胞的滋养有利于转化细胞成活。
所谓延迟筛选是指共培养后的材料不马上转入筛选培养基中，而是先转入只含有抑制农杆菌生长的抗生素（如羧芐青霉素或头孢霉素），不含选择压（如卡那霉素）的分化或愈伤组织诱导培养基中培养5 ～10 天（称脱菌培养），然后再转入具有选择压的筛选培养基中进行抗性筛选。
延迟筛选的好处是转化细胞受非转化细胞滋养有利于成活，缺点是常造成“逃逸”（假转化）现象及嵌合体出现。
（三）CpTI 基因叶盘法转化甘蓝材料︰（1）农杆菌LBA4404 ( pRCL27 ）。
（2）甘蓝种子。
操作︰1．受体材料准备︰甘蓝种子用水漂洗，70 ％乙醇消毒1 分钟，0.1 ％的升汞消毒20～30 分钟，无菌水冲洗5 遍。
播种于无菌0.7％固体琼脂培养基上，阳光下培养6～7 天。
2.配制培养基预培养培养基︰MS + IAA0.2 + BA2.0共培养培养基︰同上脱菌培养基︰MS + IAA0.2+ BA2.0＋Cef 500mg / L筛选培养基︰MS+ IAA0.2+ BA2.0+ Cef 500mg / L 十Km 25mg / L生根培养基︰1 / 2 MS + IBA 0.5 十Km 25mg / L抗生素用无菌滤膜过滤，添加在高压灭菌后冷至50 ℃左右的培养基中，用力摇匀（可将磁棒与培养基一起灭菌，加入抗生素后，置磁力搅拌器上搅匀）后分装于无菌培养皿中，生根培养基分装于三角瓶中。
3.农杆菌培养（1）挑取单菌落，接种于20mL YEB + Km 25mg / L + Rif 50mg / L 液体培养基中，27℃、180r/min培养过夜。
（2）取400μl 菌液转接入20mL 无抗生素的YEB 液体培养中，继续培养4～6 小时。
（3）在超净工作台上，将菌液倒入无菌带鄞髐葴牏满A诱W管说A用石蜡膜封口，4000r/min 离心5 分钟。
（4）取出离心管，在超净工作台上弃去上清。
向离心管内加入适量无菌MS 液体培养基，悬浮起菌体，转入无菌容器中，用MS 液体培养基稀释至OD600 0.2 。
4.叶盘法转化（1）取培养6～7 天的甘蓝无菌幼苗，将胚轴剪成5～8mm 长的小段，子叶带子叶柄剪下，转入预培养培养基中，于25℃，光照条件下预培养2 天。
（2）将预培养的材料取出，放在无菌的小培养皿中，保留培养基。
（3）向皿中倒入稀释好的菌液，轻轻摇晃2～3 下，立即取出胚轴切段及子叶，置无菌滤纸上吸去多余菌液。
（4）将子叶及胚轴切段放回到原预培养的培养基中，诱W培养皿说A用石蜡膜封口，于27℃，黑暗中共培养2 天。
（5）将材料转入到脱菌培养基中，于26℃ ，光照条件下培养6～7 天。
（6）将脱菌培养基中的材料转入筛选培养基中，同样条件下培养。
2～3 周有绿芽分化。
（7）将绿芽转入筛选培养基，2 周更换一次新鲜的筛选培养基，筛选培养3～4 代，淘汰白化的及畸型苗（8）选择形态正常，生长旺盛的抗性绿苗，转入生根培养基中，15 天后可见幼根生成。
待根系形成后取出小苗，自来水洗净根上的琼脂，移入珍珠岩与草炭土1 ︰1 混合的基质中，于温室中培养。
（9）取生长良好的植株叶片提取DNA，进行PCR 扩增及Southern杂交鉴定。
说明︰LBA4404 (pRCL27）为双元载体，所含pRCL27质粒的T-DNA中有NPT-l基因和以CaMV35S 启动子调控的CpTI 基因。
由中科院遗传所朱祯实验室构建。
（四）悬浮细胞与农杆菌共培养转化目的︰以悬浮培养的单细胞或细胞团为受体，与农杆菌共培养实现目的基因转化，并通过再生获得转基因植株。
材料︰（1）烟草愈伤组织。
（2）含NPT-Ⅱ基因质粒载体的农杆菌菌株。
（3）悬浮培养液︰愈伤组织培养基成分中增加2,4－D 浓度，可至2mg/L；VB1、VB6 浓度可增至10mg/L；烟酸浓度可增至5mg/L，并加入水解酪蛋白1g/L。
操作︰1.悬浮细胞系的建立(1) 在150mL 的三角瓶中加入约50mL 的悬浮培养液。
(2) 取生长快，松散的愈伤组织转入悬浮培养液中，24℃、100r/min 振荡培养。
(3) 每隔3 天转入新培养液中继代一次。
2.农杆菌培养（1）将农杆菌接种在YEB液体培养基中，于28℃、200 r/min 振荡培养至OD600 为0.6～0.8。
（2）取20mL 菌液置无菌离心管中，4000r/min 离心5 分钟，收集菌体。
（3）用细胞悬浮培养液重悬菌体，并稀释至OD6000.25 左右，置冰上待用。
（4）另一种做法是取lmL 菌液加入到50～100mL 新鲜的YEB ( pH7.0）或细胞悬浮培养液中（pH5.8) ，同时加入l000mol/LAS 继续培养至OD6000.25 左右，约4～6 小时，放置冰上待用。
3.共培养转化（1）将农杆菌液置20℃平衡几分钟。
（2）取4mL 处于对数生长期的植物细胞悬浮液放入直径为10cm 的培养皿中。
（3）再加入4mL 平衡好的农杆菌液混匀，于28℃静止培养2 天。
4.转化体筛选（1）将共培养物低速离心（700r/min )，弃上清。
（2）加入细胞悬浮培养液洗涤细胞沉淀3次。
（3）最后用含500ug/mL 羧芐青霉素或头孢霉素及100 ug/mL 卡那霉素的选择细胞悬浮培养液重悬细胞沉淀，于24℃100r/min 条件下进行选择培养。
（4）当出现微小愈伤组织后转入固体选择培养基上进行愈伤组织继代选择培养。
5.愈伤组织分化及生根培养︰愈伤组织转入附加卡那霉素的固体分化培养基中诱导分化，将分化出的幼苗转入附加卡那霉素的生根培养基中培养。
说明︰共培养时不要振荡，培养条件必须有利于细胞旺盛分裂，才能得到较好效果。
（五）原生质体与农杆菌共培养转化目的︰以原生质体为受体细胞，进行农杆菌介导的目的基因转化。
材料︰烟草，带目的基因的根癌农杆菌。
试剂︰（1）原生质体分离缓冲液︰0.07%MES [2,( N－吗琳)－乙基磺酸]，0.07%CaC12 ,0.11%NaH2PO4, 0.5mol/L甘露醇（pH5.8）。
（2）原生质体分离霉液︰l%～2%Cellμlase onozuka R－10（纤维素霉R－10),0.1% MacerozymeR10（果胶霉R10)，溶于原生质体分离缓冲液（pH5.8）。