4第四章 柠檬酸、谷氨酸发酵机制

（四）乙醛酸循环和醋酸发酵柠檬酸

丙酮酸脱羧反应是不可逆的，存在异柠檬酸裂解酶，草酰乙 酸的供给只能由乙醛酸循环来完成

3醋酸 1柠檬酸 生成的柠檬酸一 半转化为异柠檬 酸
苹果酸
乙酰CoA 草酰乙酸
乙酸
柠檬酸

顺乌头酸水合酶 乙酰CoA 催化反应平衡为： 柠檬酸：异柠檬 酸：顺乌头酸 = 延胡索酸 乙酸 90：7：3。细胞 质中积累大量异 柠檬酸。
2、通过 CO2固定反应提供C4二羧酸
四、柠檬酸发酵过程的控制要点
（1）控制Mn2+、NH4+浓度，解除柠檬酸对PFK的 抑制，使EMP畅通无阻。 （2） 控制溶氧，防止侧系呼吸链失活。 （3）筛选丙酮酸羧化酶高活性菌株，培养基生物 素含量充足，提高CO2固定合成草酰乙酸能力 （4）控制培养基中的Fe2+ 的浓度及产酸发酵的pH， 使顺乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶失活。
五、柠檬酸产生菌育种的传统方法：
1. 透明圈大的菌株 平板：10%甘薯 + 2 %的琼脂 + 0.5% CaCO3 诱变后，涂布，透明圈大的则好 2. 显色圈大小 平板：麦汁培养基 + pH值指示剂 诱变后，33℃培养3天，变色圈大的则好。
3. 不分解柠檬酸的菌株 不利用柠檬酸为碳源的菌株，说明其TCA循环中柠檬 酸后续酶的活性较低，或者丧失，这有利于积累柠檬酸。 方法：以柠檬酸为唯一碳源的培养基上生长不好的突变株。 4. 选育不长孢子、少长孢子、迟长孢子的菌株 在培养基中如果菌株能够大量合成积累柠檬酸，自然会使 TCA循环中的中间产物浓度降低，这样不利于孢子的形成。 （中间产物少，C架少，不利于合成代谢，不利于孢子的 形成）
柠檬酸发酵中，三个控制点
C6H12O6 （1）点：EMP畅通无阻 控制溶氧，防止侧系 呼吸链失活 丙酮酸 + 丙酮酸 （2）点：通过CO2固定反应生成C4二羧酸 控制Mn+ NH4+浓度，解 除柠檬酸对PFK的抑制
乙酰辅酶A + C4二羧酸
柠檬酸发酵中，三个控制点
柠檬酸
（3）点：柠檬酸后述的酶活性丧失或很低， 控制培养基中的Fe2+ 的浓度
三、柠檬酸生物合成的代谢调节机制
（一）糖酵解及丙酮酸代谢的调节
1、磷酸果糖激酶（PFK）：
Mn2+浓度对磷酸果糖激酶的影响
Mn2+ 缺乏为何会使NH4+浓度升高呢？ 当培养基中Mn2+ 缺乏时，微生物体内积累几种氨基酸 （GA、GLu、Arg、Gln等），这些氨基酸的积累，意味着 体内蛋白质的合成受阻，而外源蛋白质的分解速度则不受 到影响，这样NH4+的消耗下降，NH4+浓度就会升高。

二、氨基酸的发酵生产
氨基酸本身的合成在不同生物体中，有较大的差异，然而 许多氨基酸的合成途径在不同生物体中也有共同之处。
按照起始物可将氨基酸的合成分成几个家族：
㈠谷氨酸族（α -酮戊二酸族） 包括：谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸和脯氨酸； ㈡丙酮酸族 包括：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸； ㈢天冬氨酸族（草酰乙酸族） 包括：天冬氨酸、天冬酰胺、苏氨酸和异亮氨酸； ㈣磷酸甘油酸族 ㈤芳香族 ㈥组氨酸 包括：甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸； 包括：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸； 合成为单独的一条途径。
食品工业：主要作为饮品的酸味剂，用于各种清凉饮料，还有
汽水、糖果、饼干、罐头、果酱、果汁等食品的制造。 也可用作油脂
的抗氧剂；
医药工业：是许多医药品的原材料，如柠檬酸哌吡嗪（驱蛔虫
药）、柠檬酸铁铵（补血剂）、柠檬酸钠（输血剂）等。此外，柠檬 酸还用在许多医药中做酸化剂；
化学工业：柠檬酸的酯类可以作为无毒增塑剂，来制造食品包

草酰乙酸的积累利于加速柠檬酸合成
（二）三羧酸循环的调节
1、柠檬酸合成酶的调节：柠檬酸合成酶是TCA循环第一个 酶。但黑曲霉中柠檬酸合成酶没有调节作用。 2、顺乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶的调节： 顺乌头酸水合酶是催化柠檬酸——顺乌头酸——异柠檬 酸可逆反应。研究表明，黑曲霉中有一种单纯的位于线粒 体上的顺乌头酸水合酶，它在催化时能建立下面的平衡： 柠檬酸:顺乌头酸:异柠檬酸＝90:3:7。铁为顺乌头酸酶的激 活剂， 顺乌头酸水合酶、NAD和NADP-异柠檬酸脱氢酶在柠檬 酸产生与不产生时，这3种酶均存在（组成酶）；而控制铜离 子0.3mg/L，铁离子2mg/L和pH2.0情况下，这3种酶均不出现 活力。
存在问题：出口量增长过快，技术创新相对滞后，加 上国际市场竞争激烈，已出现严重的供大于求的局面，设 备利用率不到60%，行业经济效益呈滑坡态势。
第二节 柠檬酸合成途径与代谢调控
一、柠檬酸合成途径的发现
1940年，Krebs: TCA；
1953年，Jagnnathan证实黑曲霉中存在EMP途 径所有酶；
1954年，Shu提出葡萄糖80%经EMP途径代谢； 1954-1955年，Ramakrishman等发现黑曲霉中 存在TCA循环。
二、黑曲霉柠檬酸生物合成途径
黑曲霉利用糖类发酵生成柠檬酸其生物合成途径是，葡 萄糖经EMP、HMP途径降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化 脱羧生成乙酰CoA，另一方面经CO2固定化反应生成草酰乙 酸，草酰乙酸与乙酰CoA缩合生成柠檬酸。
乙醛酸
异柠檬酸 琥珀酸
小结：
①Mn2+缺乏→抑制蛋白合成→NH4+↑，有一条呼吸活动强的不产 生ATP的侧呼吸链：解除磷酸果糖激酶的代谢调节，促进EMP途径 畅通。 ②丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制。丙酮酸氧化脱羧 生成乙酰CoA和CO2的固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不 被调节，增强了合成柠檬酸的能力。 ③顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡： 柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7
(1)生长期与产酸期都存在EMP与HMP途径，前者 EMP:HMP=2:1，后者EMP:HMP=4：1 (2)黑曲霉柠檬酸产生菌中存在TCA循环与乙醛酸循环，在 以糖质原料发酵，当柠檬酸积累时，TCA和乙醛酸循环被 阻断或减弱。
(3)由于TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱，草酰乙酸是由 丙酮酸（PYR）或磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化生成的。 即由两个CO2固定化反应体系，其中以丙酮酸羧化酶作用 下固定化CO2生成草酰乙酸为主。
减少柠檬酸对 该酶的抑制
2、CO2固定反应
通过 CO2固定反应提供C4二羧酸 （1）磷酸烯醇式丙酮酸 + CO2 == 草酰乙酸（C4 二羧酸） 酶：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 （2）丙酮酸 + CO2 === 草酰乙酸（C4二羧酸） 酶：丙酮酸羧化酶 以上两种CO2固定反应所需要的辅酶都是生物 素。



一种假设：该菌体内存在一条侧系呼吸链，NAD(P)H经过该 呼吸链，可以正常的传递H+，将其氧化为H2O，但是并没有 氧化磷酸化生成ATP；能够正常产生ATP的呼吸链称之为标准
呼吸链。

实验证明，在某些微生物体内确实存在侧系呼吸链，该侧系 呼吸链中的酶系强烈需氧，如在柠檬酸的发酵中，发酵液的 溶氧浓度在很低水平维持一段时间，或中断供氧一段时间 （20分钟），则这一侧系呼吸链不可逆的失活，其结果是菌 体不再产酸，而是产生了大量的菌体。
（三）能荷调节对柠檬酸发酵的影响

பைடு நூலகம்
菌体要大量合成柠檬酸，从葡萄糖经过EMP到柠檬酸整个代 谢途径需要畅通，在这个过程中：丙酮酸氧化脱羧，每分子 丙酮酸可产生一分子的NADH，在有氧的条件下，每分子的 NADH经过呼吸链彻底氧化成H2O，并氧化磷酸化产生3分子的 ATP，造成了微生物体内能荷的增加，能荷增加则抑制PFK等 关键酶的酶活性，使得从葡萄糖到柠檬酸的代谢停止。
装的塑料薄膜；
其它方面，如用于工业、民用的洗涤剂中作为助剂，制造无公
害洗涤剂；用在混凝土中作缓凝剂；在电镀中、皮革业、油墨、晒图 等工业中也被得到广泛应用。
三、我国柠檬酸生产现状 生产状况： 60年代开始，生产柠檬酸年总产量居世界
第一，出口量一直占国内总产量的50%以上。目前，生产 厂家近百家，万吨级以上的有6家。主要有安徽丰原生物 化学集团公司（生产能力为12.0万吨/年）、江苏无锡罗氏 中亚柠檬酸有限公司（生产能力为4.0万吨/年）、安徽华 源生物药业有限公司（生产能力为3.5万吨/年）等。
第五章 氨基酸发酵机制 （谷氨酸发酵）
一、概 述




在食品工业上的应用。甘氨酸、丙氨酸具有甜味，天冬氨酸、谷氨 酸具有酸味，谷氨酸钠、天冬氨酸钠具有鲜味，可用作食品添加剂。 蛋氨酸、赖氨酸、谷氨酸钠、甘氨酸、丙氨酸和苏氨酸目前作为饲料 添加剂。 在医药工业上的应用。氨基酸的混合液可供病人注射用，氨基酸的 混合粉剂可作宇航员、飞行员的补品。精氨酸药物用于治疗由氨中毒 造成的肝昏迷；丝氨酸药物用作疲劳回复剂；蛋氨酸、胱氨酸用于治 疗脂肪肝；L－谷氨酸与L－谷氨酰胺用于治疗脑出血后的记忆力障 碍等。 在化妆品生产中的应用。氨基酸及其衍生物与皮肤的成分相似，具 有调节皮肤pH和保护皮肤的功能。胱氨酸用于护发素中，丝氨酸用 于面霜中。谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸与脂肪酸形成的表面活性剂，具 有清洗、抗菌等功能，用于护肤品、洗发剂。 在农业上的应用。一些氨基酸在体外并无杀菌功能，但能干扰植物 与病原菌之间的生化关系，使植物的代谢及抗病能力发生变化，从而 达到抑菌的目的。苯丙氨酸和丙氨酸可用于治疗苹果疮痂病。用甘氨 酸制成了除草剂，易被微生物分解，不会造成环境污染。
同时控制Fe2+含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。
④随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠 檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累。
（五）柠檬酸发酵的产率
1、无CO2固定反应的产率
合成1分子柠檬酸需要3分 子乙酰辅酶A，也就是需要 1.5分子的葡萄糖。