耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌分子流行病学研究
重症监护室耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌相关耐药基因的研究
假 单 胞 菌进 行 药 敏 试验 ． 用 Ｐ Ｒ方 法 检 测碳 青 霉 烯 酶 金属 酶 （ Ｌ Ｉ ＶＩ Ｇ Ｍ、Ｐ 和 Ｉ 耐 药 基 因 和外 膜 采 Ｃ ＭＢ ）ＭＰ、 Ｍ、 Ｉ Ｓ Ｍ ＭＩ
通 道 蛋 白 ＯｐＤ ｒ ２基 因。 结 果 对 多 黏 菌 素未 出现 耐药 ， 阿米 卡 星 、 拉 西林 ／ 唑 巴坦 、 大霉 素 、 对 哌 他 庆 头孢 哌酮／ 舒巴
２２ ３ 第 ０ 第 期 ０ 年 月 ５ ７ １ 卷
・临床 研 究 ・
重症监护室耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌相关耐药 基 因的研究
石 庆 新 叶 黎 红 许 成 新
浙 江 省 台州 医 院检验 科 ， 江 台州 浙
３ ８５ １０ ０
【 要】目的 研 究 重症 监护 室 耐碳 青 霉烯 类铜 绿 假单 胞 菌 的耐药 机 制 。方法 采 用 Ｋ— 摘 Ｂ法 对 ４ ４株 耐碳 青 霉烯 类铜 绿
坦、 头孢 他 啶和 头 孢 吡肟 耐 药率 分 别 为 １ ．％ 、０Ｏ ３ ．％、５０ 、０９ ３６ ５ ．％、 １ ８ ２ ．％ ４ ．％和 ５ ．％， 左旋 氧 氟沙 星 和 头孢 噻肟 的 ００ 对 耐 药率 都 接近 ９ ％， 胺 培 南 、 洛培 南 、 苄 西林 、 Ｏ 亚 美 氨 头孢 唑啉 、 头孢 西 丁 的耐 药率 均为 １０ ０ ％。检 出 Ｏ ｒ ｐＤ２基 因 缺失 ２ １株 （ ７７ ，ＭＰ阳性 ６株 （３６ ， Ｉ 阳性 ３株 （ ．％） 未检 出 ＧＩ Ｓ Ｍ 和 Ｉ 耐药 基 因 。 论 耐 碳青 霉 烯类 ４ ．％）Ｉ １ ．％） Ｖ Ｍ ６８ ， Ｍ、Ｐ ＭＩ 结
铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药机制研究
ʌ综述ɔ铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药机制研究∗徐雁峰１ꎬ王慧敏２ꎬ张㊀冬２(１.内蒙古科技大学包头医学院ꎬ内蒙古包头０１４０００ꎻ２.内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院呼吸科)㊀㊀ＤＯＩ:１０.１６８３３/ｊ.ｃｎｋｉ.ｊｂｍｃ.２０１９.０９.０４８㊀㊀铜绿假单胞菌(ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａꎬＰＡ)是目前临床上常见的革兰阴性杆菌ꎬ是最常见的引起严重院内获得性感染的条件致病菌之一ꎮ在机体抵抗力下降或免疫功能受损或是侵入性操作时(如留置尿管㊁呼吸机辅助通气)易引起各种感染ꎬ如泌尿系感染㊁呼吸道感染㊁脑膜炎㊁烧伤感染等ꎬ其中以下呼吸道感染最为常见ꎬ包括支气管扩张合并感染㊁慢性阻塞性肺疾病合并感染㊁呼吸机相关性肺炎等ꎬ且主要分布于重症监护病房ꎮ铜绿假单胞菌具有易定值ꎬ易变异ꎬ易耐药特点[１]ꎮ该菌可随着医护人员的手接触㊁医疗用水㊁机械通气等直接或间接性传播ꎻ在国外ꎬ慢性铜绿假单胞菌的定植是囊性纤维化(ＣＦ)肺病过程中的核心因素ꎬ是导致ＣＦ患者发病率和死亡率上升的主要原因ꎮＺａｖａｓｃｋｉ等[２]进行的研究表明ꎬ抗生素的选择压力和长时间使用加快了细菌突变的速度ꎮ因此抗生素的滥用ꎬ使得铜绿假单胞菌基因发生突变ꎬ导致耐药性在细菌间进行水平转移ꎬ使得铜绿假单胞菌耐药现象逐渐突显ꎬ出现多重耐药铜绿假单胞菌(Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔ￣ａｎｔｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａꎬＭＤＲＰＡ)ꎬ给人们的安全带来巨大的威胁ꎬ引起了感染相关专家对公共卫生的关注ꎮ由其所引起的疾病具有难治愈㊁高致死率及迁延不愈性等特点ꎬ给临床治疗带来巨大困难ꎬ严重威胁人类的健康ꎮ㊀㊀碳青霉烯类抗生素(Ｃａｒｂａｐｅｎｅｍａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ)是抗菌谱最广㊁抗菌活性最强的一类β－内酰胺类抗生素ꎬ曾一度是治疗铜绿假单胞菌感染的首选药物ꎮ２０世纪７０年代末期ꎬ默克公司研究人员从牲畜链霉菌中发现一类新的β－内酰胺类抗生素－硫霉素ꎬ这是历史上第一个碳青霉烯类抗生素ꎮ１９８７年ꎬ该公司通过对硫霉素的半合成结构修饰ꎬ成功开发出第一个用于临床的碳青霉烯类抗生素－亚胺培南ꎬ之后碳青霉烯类药物开始被陆续开发并广泛应用于临床各科室ꎬ目前以亚胺培南和美罗培南为代表的碳青霉烯类抗生素被临床广泛用于治疗铜绿假单胞菌感染ꎬ尤其在重症感染患者治疗上发挥了重要作用ꎮ然而近年来ꎬ世界各地逐渐出现了耐碳青霉烯类抗生素铜绿假单胞菌(Ｃａｒ￣ｂａｐｅｎｅｍ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａꎬＣＲＰＡ)ꎬ２０１７年世界卫生组织(ＷＨＯ)制定了一份关于全球耐药菌的排列名单ꎬ耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌与耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌ꎬ耐碳青霉烯类㊁第三代头孢菌素的肠杆菌科细菌排在最前ꎮ耐碳青霉烯铜绿假单胞菌的出现使得临床上对感染性疾病的治疗变得愈加困难ꎮＨｏｎｇ等[３]通过对５０个国家临床ＣＲＰＡ分离株的耐药情况进行分析ꎬ发现在巴西㊁秘鲁㊁哥斯达黎加㊁俄罗斯㊁希腊㊁波兰㊁伊朗和沙特阿拉伯等地铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物的耐药率均高于５０％ꎮ美国ＩＮ￣ＦＯＲＭ(Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｎｅｔｗｏｒｋｆｏｒｏｐｔｉｍａｌｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｍｏｎｉ￣ｔｏｒｉｎｇ)监测了２０１２~２０１５年７９个美国医疗中心铜绿假单胞菌对美罗培南的耐药率ꎬ结果显示耐药率从１８.０％上升到１９.１％[４]ꎮ２０１５年㊁２０１６年㊁２０１７年中国细菌耐药性监测ＣＨＩＮＥＴ结果显示ꎬＰＡ对亚胺培南的耐药率为２７.６％㊁２８.７％㊁２３.６％ꎬ对美罗培南耐药率为２３.４％㊁２５.３％㊁２０.９％ꎮ一项对全球ＣＲ￣ＰＡ的流行病学报道显示ꎬ南美洲㊁欧州和西南亚地区是ＣＲＰＡ的主要地区ꎬ对碳青霉烯类抗生素的耐药率最高可达７５.３％ꎮ可见铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素具有很高的耐药性ꎮ㊀㊀ＣＲＰＡ的出现ꎬ给临床抗感染带来了严峻的考验ꎬ因此研究铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制具有重要意义ꎬ本文就其耐药机制做一综述ꎮ１ 产生碳青霉烯酶㊀㊀铜绿假单胞菌可产生β－内酰胺酶㊁氨基糖苷类钝化酶等多种酶ꎬ其中产β－内酰胺酶是ＰＡ耐药的主要机制ꎬ此酶可以通过水解或非水解方式破坏β－内酰胺酶的β－内酰胺环使抗菌药物失活而无法发挥抗菌作用ꎮ目前对于β－内酰胺酶的分类法主要有两类ꎬＡｍｂｌｅｒ分子结构法是１９８０年Ａｍｂｌｅｒ提出的ꎬ根据β－内酰胺酶氨基酸序列分为Ａ－Ｄ类ꎬ其中Ａ类㊁Ｃ类和Ｄ类β－内酰胺酶是依赖丝氨酸发挥作用ꎬ而Ｂ类β内酰胺酶是依赖金属离子发挥作用ꎬ是引起铜绿假单胞菌获得性耐药的主要酶ꎮ另一种分类方法是∗基金项目:内蒙古自治区自然科学基金项目[２０１７ＭＳ(ＬＨ)０８０３]通讯作者:张㊀冬Ｂｕｓｈ分类法ꎬ是Ｂｕｓｈ于１９９５年提出ꎬ他以酶作用的底物㊁抑制剂谱的不同将β－内酰胺酶分为四个大类(１－４)及六个亚类(ａ－ｆ)ꎬ主要包括超广谱β－内酰胺酶(ＥＳＢＬｓ)㊁金属酶(ＭＢＬｓ)㊁头孢菌素酶(ＡｍｐＣ)ꎬＯＸＡ型内酰胺酶等ꎮ碳青霉烯酶是一类能水解碳青霉烯类抗生素的β内酰胺酶ꎬ主要是指Ａｍｂｌｅｒ法的Ａ㊁Ｂ㊁Ｄ类ꎮ１.１㊀Ａ类碳青霉烯酶㊀Ａ类碳青霉烯酶包括ＫＰＣ型㊁ＧＥＳ型㊁ＳＭＥ型㊁ＩＭＩ型㊁ＳＦＣ型等ꎬ其中以ＫＰＣ型和ＧＥＳ型最为常见ꎬ以质粒形式存在ꎬ造成大范围耐药铜绿假单胞菌的传播ꎮ近年来对ＫＰＣ型碳青霉烯酶报道较多ꎬＫＰＣ多见于肺炎克雷伯杆菌ꎬ１９９６年首次在美国的一种肺炎克雷伯菌中检测到ꎮ２００６年ꎬ哥伦比亚国际医学研究和教育中心首次报道ＫＰＣ－２在假单胞菌中的存在情况ꎬ２０１１年浙江大学医学院附属第一医院报道了首例产ｂｌａＫＰＣ－２型碳青霉烯酶的铜绿假单胞菌ꎬ之后ＫＰＣ在铜绿假单胞菌的报道逐渐增多[５]ꎮＫＰＣ酶属于Ａｍｂｌｅｒ－Ａ类ꎬＢｕｓｈ－２ｆ类ꎬ位于质粒或染色体上ꎬ染色体编码的ＫＰＣ可能有利于产ＫＰＣ铜绿假单胞菌高风险克隆的扩散ꎮＧａｒｃｉａ等[６]通过比较产生ＫＰＣ酶的肺炎克雷伯菌感染爆发之前和之后铜绿假单胞菌分离株的耐药性ꎬ发现爆发后铜绿假单胞菌获得了ＫＰＣ基因ꎬ从而表明了ＫＰＣ基因可在细菌间传播导致铜绿假单胞菌获得对碳青霉烯类抗生素高水平的耐药性ꎮ目前已经鉴定出至少２３种ＫＰＣ蛋白变体ꎮ１.２㊀产金属β－内酰胺酶(ｍｅｔａｌ－β－ａｃｔａｍａｓｅｓꎬＭＢＬｓ)㊀金属β－内酰胺酶(ｍｅｔａｌ－β－ａｃｔａｍａｓｅｓꎬＭＢＬｓ)是以金属离子为活性中心的酶ꎬ可以水解大部分β－内酰胺类抗生素ꎬ且需要依赖金属离子Ｚｎ２＋发挥作用ꎮ首次发现是因蜡样芽胞杆菌产生能被ＥＤ￣ＴＡ抑制的β－内酰胺酶ꎬ之后世界各地相继报道了能产生ＭＢＬｓ的各种细菌ꎮ编码ＭＢＬｓ的基因位点存在于铜绿假单胞菌的质粒㊁转座子或染色体上ꎬ以基因盒存在于整合子之中ꎬ大部分位于Ⅰ类整合子ꎬ通过整合子传递作用ꎬ使耐药性在革兰阴性细菌间水平传播扩散ꎬ引起铜绿假单胞菌的多重耐药(ＭＤＲ)甚至泛耐药(ＸＤＲ)ꎬ进而导致感染的爆发ꎬ使得临床治疗变得复杂化ꎮＭＢＬｓ可分为天然和获得性金属酶ꎬ获得性ＭＢＬｓ主要为质粒介导的ꎬ随着质粒的移动将耐药基因播散在各个菌株ꎬ是临床上最多见的ꎮ天然ＭＢＬｓ为染色体编码的ꎬ存在于一些临床非重要致病菌中ꎬ不具有传导性ꎬ没有致病性ꎬ是细菌为适应生存环境而产生的酶ꎮ获得性ＭＢＬｓ是铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素产生获得性耐药的主要原因ꎮ脉冲场凝胶电泳实验(ＰＦＧＥ)发现ꎬ产ＭＢＬｓ铜绿假单胞菌在遗传学上紧密相关ꎬ表明ＭＢＬｓ基因的扩散是由耐药菌株的克隆传播或耐药基因在不同菌株间传递引起的[７]ꎮＭＢＬｓ属于Ａｍｂｌｅｒ－Ｂ类ꎬＢｕｓｈ－３类ꎬ目前发现的获得性金属酶包括ＩＭＰ㊁ＶＩＭ㊁ＧＩＭ㊁ＳＰＭ㊁ＳＩＭ㊁ＮＤＭ－１㊁ＦＩＭ－１ꎬ临床最常见的是ＩＭＰ和ＶＩＭꎮ近年来发现了ＭＢＬｓ的亚类ꎬ进一步说明了ＭＢＬｓ的持续多样化以及这些酶在革兰氏阴性菌种中的持续全球传播ꎮ㊀㊀ＩＭＰ－１是１９９１年日本研究者在粘质沙雷菌体内发现了第一个获得ＭＢＬｓꎬ之后不断发现新的获得ＭＢＬｓꎬ这些金属酶的宿主也从粘质沙雷菌扩大到了铜绿假单胞菌等肠杆菌科细菌ꎬ而铜绿假单胞菌是主要宿主ꎮ目前已发现了ＩＭＰ五十几种亚型ꎬ分别由相应编码基因的不同位点发生突变产生ꎮ１９９９年意大利在铜绿假单胞菌中发现首个ＶＩＭ－１型酶ꎬ随后在美国㊁法国㊁英国㊁意大利等国家相继发现铜绿假单胞菌产不同亚型ＶＩＭ基因ꎮ目前已发现了ＶＩＭ四十几种ꎬＶＩＭ－２是铜绿假单胞菌中分布最广的ＭＢＬꎬ并且是多次爆发的来源ꎮ㊀㊀ＮＤＭ－１是一种新型金属酶ꎬ最初在２００９年从一位感染肺炎克雷伯杆菌的瑞典患者分离发现ꎬ之后在铜绿假单胞菌㊁鲍曼不动杆菌和大肠杆菌中均有发现ꎮ２０１１年ꎬ首次在塞尔维亚患者中记录了铜绿假单胞菌中ＮＤＭ－１的存在ꎬ之后在世界各地耐药铜绿假单胞菌均有发现ꎬＮＤＭ－１可以水解大部分β内酰胺类抗生素包括碳青霉烯类抗生素ꎬ是最广谱耐药的金属酶ꎮＮＤＭ－１位于质粒上ꎬ不仅可以在细菌间转移ꎬ而且能使所在宿主菌成为超级细菌ꎬ严重威胁着人类健康ꎮＦＩＭ－１是２０１２年从佛罗伦萨血管移植物感染患者培养的多重耐药铜绿假单胞菌中分离出一种新型金属酶ꎬ位于染色体上ꎬ与ＮＤＭ表现出最高的相似性(约４０％氨基酸同一性)ꎬＦＩＭ－１具有广泛的底物特异性ꎬ优选青霉素和碳青霉烯类[８]ꎮ㊀㊀ＫＨＭ－１是１９９７年在日本的多重耐药柠檬酸杆菌分离物中鉴定出来的ꎬ之后再未报道过ꎮＰｆｅｎｎｉｇｗ￣ｅｒｔｈ等[９]在铜绿假单胞菌分离物发现了新的金属酶ＨＭＢ－１ꎬ与ＫＨＭ－１在核苷酸水平上的同一性为７３.６％ꎬ在氨基酸水平上的同一性为７４.３％ꎬ但在碳青霉烯酶水解方面表现出明显差异ꎬ通过测定最低抑菌浓度(ＭＩＣ)发现ＨＭＢ－１对亚胺培南的水解高于ＫＨＭ－１的２倍ꎬ而对美罗培南㊁厄他培南的水解效率非常相似ꎮ１.３㊀产ＯＸＡ型酶㊀ＯＸＡ型酶属于ＡｍｂｌｅｒＤ类ꎬＢｕｓｈ２ｄ类ꎬ因对苯唑西林或是氯唑西林等有很强的水解能力而得名ꎮＯＸＡ型超广谱β－内酰胺酶ꎬ是从２０世纪８０年代后期随着ＤＮＡ测序技术的发展才从丝氨酸β－内酰胺酶中分离出来ꎬ并单独成为一类ꎮ之后该酶在世界范围内陆续被检测到ꎬ如法国㊁西班牙㊁英国等许多国家均检出ꎬ近日秘鲁发现了同时表达ＯＸＡ－１的铜绿假单胞菌[１０]ꎮ国内在安徽㊁湖南㊁郑州㊁苏州㊁贵州等地也曾报道过ＯＸＡ型酶ꎮＯＸＡ型酶主要分布在鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌ꎮＢｅｒｔ等[１１]阐述了ＯＸＡ型酶分５组ꎬ其中ＯＸＡ－５㊁ＯＸＡ－１０㊁ＯＸＡ－１１㊁ＯＸＡ－１４㊁ＯＸＡ－１６㊁ＯＸＡ－１７㊁ＯＸＡ－３１等见于铜绿假单胞菌内[１２]ꎮＯＸＡ－１９８是２０１１年Ｅｌ等[１３]新发现的Ｄ类β内酰胺酶ꎬＯＸＡ－１９８基因位于ＩｎｃＰ－１１型质粒携带的Ⅰ类整合子上ꎬ易于在铜绿假单胞菌或大肠杆菌中转化ꎮ最近ꎬＢｏｎｎｉｎ等[１４]描述了产生ＯＸＡ－１９８的铜绿假单胞菌与医院相关的丛集事件ꎬ揭示ＯＸＡ－１９８的产生使碳青霉烯类药物敏感性降低ꎮ２㊀膜通透性下降㊀㊀细胞膜是药物进入细菌内发挥作用的第一道屏障ꎬ铜绿假单胞菌的细胞内膜由具有流动性的脂质双分子层组成ꎬ外膜包括脂蛋白㊁外膜蛋白和脂多糖等ꎬ脂多糖为６~７条链相互共价连接而成的脂肪酸链组成ꎬ这可降低外膜的流动性ꎬ阻碍脂溶性药物通过细菌外膜ꎮ碳青霉烯类抗生素进入体内发挥作用的靶位是位于内膜上的青霉素结合蛋白(ＰＢＰｓ)ꎬ需先通过外膜才能到达靶点ꎬ所以任何导致铜绿假单胞菌外膜通透性降低的因素都会导致抗菌药物无法到达作用位点ꎬ从而使细菌对该种抗生素耐药ꎮ２.１㊀膜孔蛋白的丢失㊀铜绿假单胞菌外膜上有许多微孔通道蛋白ꎬ如ＯｐｒＣ㊁ＯｐｒＤ２㊁ＯｐｒＥꎬ其中外膜孔通道ＯｐｒＤ２是以亚胺培南为代表的碳青霉烯类抗菌药物进入ＰＡ唯一通道ꎮＯｐｒＤ２的基因突变或者缺失致使ＯｐｒＤ２功能缺失或表达下调造成细胞外膜对抗菌药物通透性下降ꎬ是铜绿假单胞菌对亚胺培南等碳青霉烯类抗生素耐药的重要机制ꎮＯｐｒＤ２的缺失突变体现在编码区的一段片段缺失导致移码突变ꎬ形成新的密码子从而引起肽链异常ꎬ导致铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药ꎮＬｉｕ等[１５]通过对１７株耐亚胺培南㊁美罗培南的铜绿假单胞菌分析显示其中１４株ＯｐｒＤ２蛋白的基因由于移码ꎬ无义突变或大缺失㊁或是缺少终止密码子而导致密码子编码提前终止ꎬ进一步表明ＯｐｒＤ２的丢失使铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素产生耐药性ꎮ因此认为Ｏｐｒｄ２是造成ＰＡ对亚胺培南耐药的重要因素ꎮＯｐｒＤ２的基因突变体现在ＯｐｒＤ２结构基因㊁调控基因㊁调控因子等突变ꎬ进而影响ＯｐｒＤ２蛋白水平或空间构象的改变ꎮ此外插入ＯｐｒＤ２的序列(ＩＳ)元件也可导致ＯｐｒＤ２基因失活ꎬ世界范围内均有报告不同的插入元件ＩＳꎬ南非(ＩＳＰａ２６)㊁克罗地亚(ＩＳＲＰ１０)㊁伊朗(ＩＳＰａ１３２８)㊁西班牙(ＩＳＰａ１３３)㊁中国(ＩＳＰａ１３２８㊁ＩＳＰｒｅ２)等ꎮＳｈａｒｉａｔｉ等[１６]在ＯｐｒＤ２蛋白基因中发现了一个新的插入序列ＩＳＰｐｕ２１与铜绿假单胞菌的碳青霉烯耐药性密切相关ꎮ２.２㊀主动外排系统过度表达㊀铜绿假单胞菌细胞膜上存在着将抗菌药物排出体外的外排泵系统ꎮ根据染色体的不同同源性ꎬ可将外排泵系统分为易化子超家族(ＭＦＳ)㊁耐药结节化细胞分化家族(ＲＮＤ)㊁ＡＴＰ结合盒超家族(ＡＢＣ)㊁多重药物和毒性化合物外排家族(ＭＡＴＥ)和小多重性耐药家族(ＳＭＲ)五个超家族ꎬ其中ＲＮＤ外排家族与碳青霉烯抗菌药物的耐药有关也是最早发现的外排泵系统ꎬ主要分布在革兰阴性菌ꎬ参与多种抗菌药物的排出ꎮ１９９３年Ｐｏｏｌｅ等在铜绿假单胞菌中发现了第一个多药外排泵ＭｅｘＡＢ－ＯｐｒＭꎬ之后陆续发现多个外排泵系统如:ＭｅｘＡＢ－ｏｐｒＭ㊁ＭｅｘＸＹ－ｏｐｒＭ㊁ＭｅｘＣＤ－ｏｐｒＪ㊁ＭｅｘＥＦ－ＯｐｒＮ等ꎮ外排泵系统由膜融合蛋白如ＭｅｘＡ㊁ＭｅｘＣꎬ转运蛋白如ＭｅｘＢ㊁ＭｅｘＤ和外膜蛋白如ＯｐｒＤ㊁ＯｐｒＪ三部分组成ꎬ三种蛋白协同作用将进入菌体内的碳青霉烯类药物排除体外ꎬ任一环节出现问题即可导致多重耐药甚至泛耐药ꎮＢａｂａｋ等[１７]研究显示６２％的个体外排泵ＭｅｘＡＢ－ＯｐｒＭ基因过度表达ꎬ与先前报道的这些基因的过度表达超过５０％相符ꎮＭｅｘＸＹ－ＯｐｒＭ系统和ＭｅｘＡＢ－ＯｐｒＭ系统共用ＯｐｒＭ作为其外膜通道蛋白ꎬ因此ＭｅｘＡＢ－ＯｐｒＭ低表达也降低ＭｅｘＸＹ活性ꎬ此外ＭｅｘＣＤ－ＯｐｒＪ过表达可明显使ＭｅｘＡＢ－ＯｐｒＭ产生不足ꎮ外排泵系统具有可诱导性ꎬ抗生素的不规范使用可诱导其表达增加ꎬ曾章悦等[１８－１９]通过体外碳青霉素诱导实验对敏感铜绿假单胞菌进行诱导ꎬ发现铜绿假单胞菌经其诱导后对美罗培南的最低抑菌浓度升高ꎬ考虑铜绿假单胞菌对美罗培南的耐药与外排泵表达量增加有关ꎮ３㊀细菌生物被膜(ｂａｃｔｅｒｉａｌｂｉｏｆｉｌｍꎬＢＦ)形成㊀㊀１９７８年Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎ首先提出生物被膜这一概念ꎬ细菌生物被膜(ｂａｃｔｅｒｉａｌｂｉｏｆｉｌｍꎬＢＦ)是指细菌附着于惰性物体或生物物体表面如医疗设备ꎬ留置导管或坏死的组织上ꎬ繁殖并分泌一些多糖基质和纤维蛋白等细胞外聚合物ꎬ将细菌粘连包裹其中而形成的膜样物ꎮＢＦ结构坚韧稳固ꎬ长期存在可作为细菌的保护伞使其逃避宿主免疫应答㊁抵挡抗菌药物的杀菌作用而难以根除ꎬ对抗生素产生耐药ꎬ进而导致难治性感染和慢性㊁持续性感染ꎮ铜绿假单胞菌生物被膜细胞外聚合物(ＥＰＳ)可延缓包括抗生素的扩散ꎬ导致细菌对抗生素耐受ꎮＥＰＳ是由胞外多糖㊁蛋白质㊁核酸组成ꎬ其中主要成分胞外多糖包括ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｌｏｃｕｓ(Ｐｓｌ)ꎬｐｅｌｌｉｃｌｅＦｏｒｍａｔｉｏｎ(Ｐｅｌ)和藻酸盐(Ａｌｇｉｎａｔｅ)ꎬ尤其是Ｐｓ１对铜绿假单胞菌中ＢＦ形成具有重要作用ꎮＰｓｌ多糖的过量产生导致铜绿假单胞菌的细胞表面和细胞间粘附增强ꎬ形成微菌落ꎬ稳固生物被膜结构的同时对抗生素产生耐药ꎮ研究发现形成生物被膜的多糖物质Ｐｓｌ可作为一种信号分子通过调节鸟苷酸的产生形成一种正反馈ꎬ进一步促进细菌产生细胞外基质形成生物被膜ꎬ这对于研究铜绿假单胞菌的耐药具有重要作用[２０]ꎮｃ－ｄｉ－ＧＭＰ信号通路被发现是导致生物膜形成的主要机制ꎮ藻酸盐(Ａｌｇｉｎａｔｅ)是ＥＰＳ主要成分ꎬ可以形成稳固的保护屏障阻碍抗生素穿透生物被膜ꎬ难以对包裹其中的细菌产生抗菌作用ꎬ导致感染反复发作ꎮ小ＲＮＡ(ｓＲＮＡ)是铜绿假单胞菌生物被膜形成的重要机制ꎮＴａｙｌｏｒ等[２１]描述了一个新的非编码小ＲＮＡ(ｓＲＮＡ)转录物ｓｒｂＡ对生物膜的形成和毒力有重要影响ꎮ４㊀整合子(ｉｎｔｅｇｒｏｎ)的形成㊀㊀整合子是存在于细菌质粒㊁染色体或转座子上的一种具有识别和捕获各种耐药基因并通过移动ꎬ将耐药基因传播在同种和不同种细菌间ꎬ最终导致临床上耐药现象的泛滥ꎮ整合子是Ｓｔｏｋｅｓ和Ｈａｌｌ于１９８９年首次提出的ꎬ由两端的保守区和中间的可变区构成ꎬ可变区中含有多种基因盒ꎬ大部分为耐药基因盒ꎬ在５ᶄ端保守段包含有编码整合酶的ｉｎｔＩ基因和负责基因转录的启动子ꎬ当整合子捕获到耐药基因盒后ꎬ在启动子的作用下发生转录从而使细菌获得耐药性ꎮ整合子根据其整合酶编码基因序列的不同可分为６类ꎬ其中Ⅰ类整合子最为常见且与铜绿假单胞菌耐药密切相关ꎮ目前在Ⅰ类整合子可变区中发现多种耐药基因盒ꎬ如ＶＩＭ㊁ＩＭＰ㊁ＳＨＶ等ꎬ这些耐药基因使铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素产生高耐药水平ꎮＫｈｏｓｒａｖｉ等[２２]通过研究发现铜绿假单胞菌耐药性与整合子密切相关ꎬ发现大多数(９５.７％)分离株包含Ⅰ类整合子且对美罗培南耐药性可达到(９０.３２％)ꎬ对亚胺培南的耐药率达(８３.８７％)ꎮ㊀㊀总之ꎬ铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药现象是多种耐药机制协同作用的结果ꎬ并不单纯是由一种因素造成ꎮＣＲＰＡ的出现ꎬ给临床治疗造成了巨大的压力ꎬ这需要我们进一步深入研究其耐药及流行机制ꎬ为指导抗生素的合理使用及开发新的有效抗菌药物提供理论依据ꎮ近年来ꎬ多位点序列分型(Ｍｕｌｔｉ￣ｌｏｃｕｓｓｅｑｕｅｎｃｅｔｙｐｉｎｇꎬＭＬＳＴ)被广泛用于记录细菌基因的变异ꎬ进而实现耐药菌株的追踪ꎬ对研究铜绿假单胞菌的耐药机制具有重要意义ꎮ多位点序列分型是Ｍａｉｄｅｎ等人在１９９８年提出的用于分析基因的核苷酸序列ꎬ进而发现细菌基因的变异ꎮＭＬＳＴ通过使用管家基因中的序列变异来定义类型ꎬ以ＳＴ编号为基本分析单位ꎬ每一个ＳＴ标号代表一种核苷酸序列信息ꎬ目前应用于耐药菌株的追踪ꎮ通过对铜绿假单胞菌的７个管家基因(ａｃｓＡ㊁ａｒｏＥ㊁ｇｕａＡ㊁ｍｕｔＬ㊁ｎｕｏＤ㊁ｐｐｓＡ和ｔｒｐＥ)进行ＰＣＲ扩增纯化ꎬ产物测序后与ＢＬＡＳＴ对比得出七个管家基因等位基因谱编号ꎬ依据编号的组合即能够得到ＳＴ型ꎬ进而实现对全球铜绿假单胞菌的流行趋势及毒力进化变异的追踪调查ꎮ在铜绿假单胞菌中ꎬＭＢＬｓ的产生通常与序列类型(ＳＴｓ)１１１㊁１７５㊁３５７和２３５的多耐药高风险克隆相关ꎬ表明高风险克隆在成功传播临床重要抗药性决定因素中的重要作用ꎮＰａｐａｇｉａｎｎｉｔｓｉｓ等[２３]发现捷克医院中携带ＩＭＰ－７的铜绿假单胞菌中ＳＴ３５７克隆编码整合子Ｉｎ－ｐ１１０ꎬ证明大多数ＳＴ３５７分离株与ＩＭＰ型ＭＢＬｓ的产生相关ꎮＶａｎｅｇａｓ等[２４]研究表明高抗生素选择压力有利于多克隆的出现ꎬ这些克隆能够分别含有ＫＰＣ和ＶＩＭ碳青霉烯酶ꎬ主要是ＳＴ２３５和ＳＴ１１１ꎬ但同时出现其他克隆如ＳＴ１７５５㊁ＳＴ４６３ꎮ序列类型２３５(ＳＴ２３５)是重要的铜绿假单胞菌克隆ꎬ铜绿假单胞菌ＳＴ２３５可以通过突变和获得当地耐药基因ꎬ对碳青霉烯类抗生素产生耐药性[２５]ꎮ在ＳＴ２３５中已经描述了多种碳青霉烯酶ꎬ最常见的是ＶＩＭꎬ其次是ＩＭＰꎬＯＸＡꎬＧＥＳꎬＫＰＣ和ＮＤＭꎮ目前发现质粒编码的产ＮＤＭ－１的铜绿假单胞菌ＭＬＳＴ分型有ＳＴ２３５ꎬ染色体编码的ＫＰＣ基因可能有利于产生ＫＰＣ的铜绿假单胞菌ＳＴ２３５扩增时的传播ꎮＨｕ等[２６]首次报道了产生ＫＰＣ－２的ＳＴ４６３铜绿假单胞菌分离株的克隆ꎬ该克隆在浙江省快速出现和传播ꎮ参考文献[１]㊀中华医学会呼吸病学分会感染学组.铜绿假单胞菌下呼吸道感染诊治专家共识[Ｊ].中华结核和呼吸杂志ꎬ２０１４ꎬ３７(１):９－１６.[２]㊀ＺａｖａｓｃｋｉＡＰꎬＣａｒｖａｌｈａｅｓＣＧꎬＰｉｃãｏＲＣꎬｅｔａｌ.Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ－ｒｅ￣ｓｉｓｔａｎｔｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａａｎｄａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｂａｕｍａｎ￣ｎｉｉ:ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓａｎｄｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｔｈｅｒａｐｙ[Ｊ].ＥｘｐｅｒｔＲｅｖＡｎｔｉＩｎｆｅｃｔＴｈｅｒꎬ２０１０ꎬ８(１):７１－９３. [３]㊀ＨｏｎｇＤＪꎬＢａｅＩＫꎬＪａｎｇＩＨꎬｅｔａｌ.Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒ￣ｉｓｔｉｃｓｏｆｍｅｔａｌｌｏ－β－ｌａｃｔａｍａｓｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ[Ｊ].ｉｎｆｅｃｔｃｈｅｍｏｔｈｅｒꎬ２０１５ꎬ４７(２):８１－９７. [４]㊀ＳａｄｅｒＨＳꎬＨｕｂａｎｄＭＤꎬＣａｓｔａｎｈｅｉｒａＭꎬｅｔａｌ.Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｒｅｓｕｌｔｓｆｒｏｍｆｏｕｒｙｅａｒｓ(２０１２ｔｏ２０１５)ｏｆｔｈｅｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｎｅｔｗｏｒｋｆｏｒｏｐｔｉｍａｌｒｅ￣ｓｉｓｔａｎｃｅｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇｐｒｏｇｒａｍｉｎｔｈｅｕｎｉｔｅｄｓｔａｔｅｓ[Ｊ].Ａｎｔｉｍｉ￣ｃｒｏｂＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒꎬ２０１７ꎬ６１(３):ｅ０２２５２－０２２６７.[５]㊀ＧｅＣꎬＷｅｉＺꎬＪｉａｎｇＹꎬｅｔａｌ.ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＫＰＣ－２－ｐｒｏ￣ｄｕｃｉｎｇｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｉｓｏｌａｔｅｓｉｎＣｈｉｎａ[Ｊ].ＪＡｎｔｉ￣ｍｉｃｒｏｂＣｈｅｍｏｔｈｅｒꎬ２０１１ꎬ６６(５):１１８４－１１８６. [６]㊀ＧａｒｃíａＲＤꎬＮｉｃｏｌａＦꎬＺａｒａｔｅＳꎬｅｔａｌ.ＥｍｅｒｇｅｎｃｅｏｆＰｓｅｕｄｏ￣ｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｗｉｔｈＫＰＣ－ｔｙｐｅｃａｒｂａｐｅｎｅｍａｓｅｉｎａｔｅａｃｈｉｎｇｈｏｓｐｉｔａｌ:ａｎ８－ｙｅａｒｓｔｕｄｙ[Ｊ].ＪＭｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌꎬ２０１３ꎬ６２(Ｐｔ１０):１５６５－１５７０.[７]㊀万强ꎬ李娟ꎬ陈杨.辽宁省大连市耐亚胺培南铜绿假单胞菌产金属β－内酰胺酶基因检测及脉冲场凝胶电泳分型[Ｊ].疾病监测ꎬ２０１７ꎬ(１):３８－４２.[８]㊀ＰｏｌｌｉｎｉＳꎬＭａｒａｄｅｉＳꎬＰｅｃｉｌｅＰꎬｅｔａｌ.ＦＩＭ－１ａｎｅｗａｃｑｕｉｒｅｄｍｅｔａｌｌｏ－β－ｌａｃｔａｍａｓｅｆｒｏｍａＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｃｌｉｎ￣ｉｃａｌｉｓｏｌａｔｅｆｒｏｍＩｔａｌｙ[Ｊ].ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒꎬ２０１３ꎬ５７(１):４１０－４１６.[９]㊀ＰｆｅｎｎｉｇｗｅｒｔｈＮꎬＬａｎｇｅＦꎬＢｅｌｍａｒＣＣꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｅｔｉｃａｎｄｂｉｏ￣ｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＨＭＢ－１ꎬａｎｏｖｅｌｓｕｂｃｌａｓｓＢ１ｍｅｔａｌｌｏ－β－ｌａｃｔａｍａｓｅｆｏｕｎｄｉｎａＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｃｌｉｎｉｃａｌｉｓｏｌａｔｅ[Ｊ].ＪＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂＣｈｅｍｏｔｈｅｒꎬ２０１７ꎬ７２(４):１０６８－１０７３.[１０]㊀ＲíｏｓＰꎬＲｏｃｈａＣꎬＣａｓｔｒｏＷꎬｅｔａｌ.Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔ￣ａｎｔ(ＸＤＲ)ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｉｎＬｉｍａＰｅ￣ｒｕｃｏ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇａＶＩＭ－２ｍｅｔａｌｌｏ－β－ｌａｃｔａｍａｓｅꎬＯＸＡ－１β－ｌａｃｔａｍａｓｅａｎｄＧＥＳ－１ｅｘｔｅｎｄｅｄ－ｓｐｅｃｔｒｕｍβ－ｌａｃｔａｍａｓｅ[Ｊ].ＪＭＭＣａｓｅＲｅｐꎬ２０１８ꎬ５(７):ｅ００５１５４. [１１]㊀ＢｅｒｔＦꎬＢｒａｎｇｅｒＣꎬＬａｍｂｅｒｔ－ＺｅｃｈｏｖｓｋｙＮ.ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰＳＥａｎｄＯＸＡｂｅｔａ－ｌａｃｔａｍａｓｅｇｅｎｅｓｉｎＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｕｓｉｎｇＰＣＲ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒ￣ｐｈｉｓｍ[Ｊ].ＪＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂＣｈｅｍｏｔｈｅｒꎬ２００２ꎬ５０(１):１１－１８. [１２]㊀刘晓一ꎬ刘文恩.ＯＸＡ型超广谱β－内酰胺酶的研究进展[Ｊ].中国感染控制杂志ꎬ２０１０ꎬ(６):４６２－４６７. [１３]㊀ＥｌＧＦꎬＢｏｇａｅｒｔｓＰꎬＢｅｂｒｏｎｅＣꎬｅｔａｌ.ＯＸＡ－１９８ａｎａｃｑｕｉｒｅｄｃａｒｂａｐｅｎｅｍ－ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇｃｌａｓｓＤｂｅｔａ－ｌａｃｔａｍａｓｅｆｒｏｍＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ[Ｊ].ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈ￣ｅｒꎬ２０１１ꎬ５５(１０):４８２８－４８３３.[１４]㊀ＢｏｎｎｉｎＲＡꎬＢｏｇａｅｒｔｓＰꎬＧｉｒｌｉｃｈＤꎬｅｔａｌ.ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｈａｒａｃ￣ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｏｘａ－１９８ｃａｒｂａｐｅｎｅｍａｓｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｐｓｅｕｄｏ￣ｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｃｌｉｎｉｃａｌｉｓｏｌａｔｅｓ[Ｊ].ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒꎬ２０１８ꎬ６２(６):ｅ２０４９６－２０５１７.[１５]㊀ＬｉｕＨꎬＫｏｎｇＷꎬＹａｎｇＷꎬｅｔａｌ.ＭｕｌｔｉｌｏｃｕｓｓｅｑｕｅｎｃｅｔｙｐｉｎｇａｎｄｖａｒｉａｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅｏｐｒＤｇｅｎｅｏｆＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍａｈｏｓｐｉｔａｌｉｎＣｈｉｎａ[Ｊ].ＩｎｆｅｃｔＤｒｕｇＲｅｓｉｓｔꎬ２０１８ꎬ１１:４５－５４.[１６]㊀ＳｈａｒｉａｔｉＡꎬＡｚｉｍｉＴꎬＡｒｄｅｂｉｌｉＡꎬｅｔａｌ.Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌｉｎａｃｔｉｖａ￣ｔｉｏｎｏｆｏｐｒＤｉｎｃａｒｂａｐｅｎｅｍ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉ￣ｎｏｓａｓｔｒａｉｎｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｂｕｒｎｐａｔｉｅｎｔｓｉｎＴｅｈｒａｎꎬＩｒａｎ[Ｊ].ＮｅｗＭｉｃｒｏｂｅｓＮｅｗＩｎｆｅｃｔꎬ２０１８ꎬ２１:７５－８０.[１７]㊀ＰｏｕｒａｋｂａｒｉＢꎬＹａｓｌｉａｎｉｆａｒｄＳꎬＹａｓｌｉａｎｉｆａｒｄＳꎬｅｔａｌ.Ｅｖａｌｕａ￣ｔｉｏｎｏｆｅｆｆｌｕｘｐｕｍｐｓｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｔｐｓｅｕｄｏ￣ｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｉｓｏｌａｔｅｓｉｎａｎｉｒａｎｉａｎｒｅｆｅｒｒａｌｈｏｓｐｉｔａｌ[Ｊ].ＩｒａｎＪＭｉｃｒｏｂｉｏｌꎬ２０１６ꎬ８(４):２４９－２５６.[１８]㊀曾章锐ꎬ王卫萍ꎬ王莹ꎬ等.碳青霉烯类抗生素诱导铜绿假单胞菌外膜蛋白及外排系统突变的机制研究[Ｊ].临床检验杂志ꎬ２０１３ꎬ(６):４５０－４５４.[１９]㊀ＣｈｏｕｄｈｕｒｙＤꎬＤａｓＴＡꎬＤｕｔｔａＣＭꎬｅｔａｌ.Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌａ￣ｎａｌｙｓｉｓｏｆｍｅｘａｂ－ｏｐｒｍｅｆｆｌｕｘｐｕｍｐｓｓｙｓｔｅｍｏｆｐｓｅｕｄｏ￣ｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａａｎｄｉｔｓｒｏｌｅｉｎｃａｒｂａｐｅｎｅｍｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎａｔｅｒｔｉａｒｙｒｅｆｅｒｒａｌｈｏｓｐｉｔａｌｉｎｉｎｄｉａ[Ｊ].ＰＬｏＳＯｎｅꎬ２０１５ꎬ１０(７):ｅ０１３３８４２.[２０]㊀ＨａＤＧꎬＯ'ＴｏｏｌｅＧＡ.ｃ－ｄｉ－ＧＭＰａｎｄｉｔｓｅｆｆｅｃｔｓｏｎｂｉｏｆｉｌｍｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ:ａｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｒｅｖｉｅｗ[Ｊ].ＭｉｃｒｏｂｉｏｌＳｐｅｃｔｒꎬ２０１５ꎬ３(２):ＭＢ－０００３－２０１４. [２１]㊀ＴａｙｌｏｒＰＫꎬＶａｎＫｅｓｓｅｌＡＴＭꎬＣｏｌａｖｉｔａＡꎬｅｔａｌ.ＡｎｏｖｅｌｓｍａｌｌＲＮＡｉｓｉｍｐｏｒｔａｎｔｆｏｒｂｉｏｆｉｌｍｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｐａｔｈｏｇｅ￣ｎｉｃｉｔｙｉｎＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ[Ｊ].ＰＬｏＳＯｎｅꎬ２０１７ꎬ１２(８):ｅ０１８２５８２.[２２]㊀ＫｈｏｓｒａｖｉＡＤꎬＭｏｔａｈａｒＭꎬＡｂｂａｓｉＭＥ.Ｔｈｅｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆｃｌａｓｓ１ａｎｄ２ｉｎｔｅｇｒｏｎｓｉｎＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｓｔｒａｉｎｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｂｕｒｎｐａｔｉｅｎｔｓｉｎａｂｕｒｎｃｅｎｔｅｒｏｆＡｈｖａｚꎬＩｒａｎ[Ｊ].ＰＬｏＳＯｎｅꎬ２０１７ꎬ１２(８):ｅ０１８３０６１.[２３]㊀ＰａｐａｇｉａｎｎｉｔｓｉｓＣＣꎬＭｅｄｖｅｃｋｙＭꎬＣｈｕｄｅｊｏｖａＫꎬｅｔａｌ.Ｍｏｌｅｃ￣ｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｃａｒｂａｐｅｎｅｍａｓｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｐｓｅｕｄｏ￣ｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｏｆｃｚｅｃｈｏｒｉｇｉｎａｎｄｅｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒｃｌｏｎａｌｓｐｒｅａｄｏｆｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙｒｅｓｉｓｔａｎｔｓｅｑｕｅｎｃｅｔｙｐｅ３５７ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＩＭＰ－７Ｍｅｔａｌｌｏ－β－Ｌａｃｔａｍａｓｅ[Ｊ].ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒꎬ２０１７ꎬ６１(１２):１８１１－１８１７.[２４]㊀ＶａｎｅｇａｓＪＭꎬＣｉｅｎｆｕｅｇｏｓＡＶꎬＯｃａｍｐｏＡＭꎬｅｔａｌ.Ｓｉｍｉｌａｒｆｒｅ￣ｑｕｅｎｃｉｅｓｏｆｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｉｓｏｌａｔｅｓｐｒｏｄｕｃｉｎｇｋｐｃａｎｄｖｉｍｃａｒｂａｐｅｎｅｍａｓｅｓｉｎｄｉｖｅｒｓｅｇｅｎｅｔｉｃｃｌｏｎｅｓａｔｔｅｒｔｉａ￣ｒｙ－ｃａｒｅｈｏｓｐｉｔａｌｓｉｎｍｅｄｅｌｌíｎꎬｃｏｌｏｍｂｉａ[Ｊ].ＪＣｌｉｎＭｉｃｒｏ￣ｂｉｏｌꎬ２０１４ꎬ５２(１１):３９７８－３９８６.[２５]㊀ＴｒｅｅｐｏｎｇＰꎬＫｏｓＶＮꎬＧｕｙｅｕｘＣꎬｅｔａｌ.ＧｌｏｂａｌｅｍｅｒｇｅｎｃｅｏｆｔｈｅｗｉｄｅｓｐｒｅａｄＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａＳＴ２３５ｃｌｏｎｅ[Ｊ].ＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌＩｎｆｅｃｔꎬ２０１８ꎬ２４(３):２５８－２６６.[２６]㊀Ｃａｒｒａｒａ－ＭａｒｒｏｎｉＦＥꎬＣａｙôＲꎬＳｔｒｅｌｉｎｇＡＰꎬｅｔａｌ.Ｅｍｅｒ￣ｇｅｎｃｅａｎｄｓｐｒｅａｄｏｆｋｐｃ－２－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｉｓｏｌａｔｅｓｉｎａｂｒａｚｉｌｉａｎｔｅａｃｈｉｎｇｈｏｓｐｉｔａｌ[Ｊ].ＪＧｌｏｂＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂＲｅｓｉｓｔꎬ２０１５ꎬ３(４):３０４－３０６.(收稿日期:２０１９￣０２￣２６)。
中国碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的流行病学和防控策略
② 耐药菌控制不能采用这种方式，细菌耐药的发生是 多因素造成的，与临床不合理使用抗生素等有关
徐英春. 中国执业药师. 2013;10(4):3-8.
2012年卫生部发布的《抗菌药物临床应用管理办法》将抗菌药物分为非限制使用、限 制使用与特殊使用三类进行分级管理。建议特殊使用抗菌药物的选用应从严控制。
限制碳青霉烯类药物的使用可以降低碳青霉烯类药耐药的铜绿假单胞菌 （CRPA）比率
Pakyz A . Antimicrob Agents Chemother. 2009;53(5):1983-6.
美罗培南，环丙沙 星，头孢他啶与铜绿 耐药上升显著相关
头孢曲松，环丙沙 星，与肠杆菌科耐药
上升显著相关
胡付品等. 中国感染与化疗杂志. 2012; 12(5):321-329.
舒普深不易诱导肠杆菌科细菌耐药
舒普深不易诱导肠 杆菌科细菌耐药
Ampc酶 不会诱导肠杆菌产生Ampc酶
ESBL
治疗产ESBL肠杆菌感染，对抗生素选择 性压力影响较小
Akova M. Clin Microbiol Infect 2008; 14 (Suppl 1): 185–188.
国外CRE发生率
6.0% 5.0% 4.0% 3.0% 2.0% 1.0% 0.0%
0.3% 大肠埃希菌
5.3% 克雷伯菌
超过半数耐药细菌为产 碳青霉烯酶的菌株
- 碳青霉烯耐药大肠埃希 菌（CREc）为55%
- 碳青霉烯耐药肺炎克雷 伯菌（CRKp）为72%
数据来源于2007-2009年的SENTRY细菌耐药监测，从美国30个中心、欧洲 10个中心和拉丁美洲43个中心收集了10,432株大肠埃希菌和5,516株克雷伯菌
铜绿假单胞菌耐药性分析及分子流行病学研究
Ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ｏ ｆ ｄ ｒ ｕ ｇ ｒ ｅ ｓ ｉ ｓ ｔ ａ ｎ ｃ ｅ ａ ｎ ｄ ｍｏ ｌ ｅ ｃ ｕ ｌ ａ ｒ ｅ ｐ ｉ ｄ ｅ ｍｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ ｏ ｆ ｐ ｓ ｅ ｕ ｄ ｏ ｍｏ ｎ ａ ｓ ａ ｅ ｒ ｕ ｇ ｉ ｎ ｏ ｓ ａ Ｌ Ｚ ｈ ｉ － ｆ ａ ｎ ｇ ． Ｓ Ｈ Ｉ
Ｈ ｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ Ａ ｆ ｉ ｆ ｌ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ ｔ ｏ Ａ ｎ ｈ ｕ ｉ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ａ ｎ ｑ ｉ ｎ ｇ， Ａ ｎ ｈ ｕ ｉ ２ ４ ６ ０ ０ ０， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ
耐碳青霉烯铜绿假单胞菌耐药机制和传播机制研究
Ｌ ａ ｂ Ｍｅ ｄ Ｃ ｌ ｉ ｎ ， Ｍａ ｙ ２ ０ １ ３ ， Ｖｏ １ ． １ ０ ， Ｎｏ ． １ ０
・
论 著 ・
耐 碳 青 霉 烯 铜 绿 假 单 胞 茵 耐药 机 制 和 传 播 机 制研 究
ｍｏ ｒ ｐ ｈ ｉ ｓ ｍ— Ｐ ＣＲ （ ＲＦ ＬＰ — ＰＣＲ）ａ ｎ ｄ ｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｉ ｎ ｇ ｗｅ ｒ ｅ ｕ ｓ ｅ ｄ ｔ ｏ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｃ ｌ ａ ｓ ｓ Ｉ ｉ ｎ ｔ ｅ ｇ ｒ ｏ ｎ，Ｉ Ｓ Ｃ Ｒ１ ，ａ ｎ ｄ ｃ ａ ｒ ｂ ａ ｐ ｅ ｎ ｅ ｍａ ｓ ｅ ｓ ｇ ｅ ｎ ｅ ｓ
Ｓｔ ｕｄ ｙ ｏｎ ｍｅ ｃ ｈ ａｎ ｉ ｓ ｍ ｏ ｆ ｄｒ ｕｇ ｒ ｅ ｓ ｉ ｓ ｔ ａ ｎｃ ｅ ａ ｎ ｄ ｔ ｒ ａ ｎｓ ｍｉ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｉ ｎ ｃ ａｒ ｂａ ｐ ｅ ｎｅ ｍｓ — ｒ ｅ ｓ ｉ ｓ ｔ ａ ｎ ｔ ｐ ｓ ｅ ｕｄ ｏ ｍｏ ｎ ａ ｓ ａ ｅ ｒ ｕｇ ｉ ｎｏ ｓ ａ ｉ ｓ ｏｌ ａ ｔ ｅ ｓ
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铜绿假单胞菌耐药性分析及分子流行病学研究
铜绿假单胞菌耐药性分析及分子流行病学研究吕志芳;施炜;丁国正;胡安群;潘青;杨延国;刘静;李长东【摘要】目的分析铜绿假单胞菌(PA)耐药现状及耐药基因情况.方法收集2009~2012年临床分离的PA 305株.K-B法进行药敏试验,并检出产ESBLs菌株及耐碳青霉烯的PA,用聚合酶链反应(PCR)对产ESBLs菌株进行TEM、SHV、CTX-M基因检测,对耐碳青霉烯PA进行VIM、IPM、OXA-23基因检测.结果 3年中PA对亚胺培南、美罗培南、头孢他啶、左氧的耐药率呈上升趋势,氨曲南、阿米卡星的耐药率呈下降趋势,305株PA中共检出48株产ESBLs,57株耐碳青霉烯.PCR检测出5株PA含TEM基因,2株含SHV基因.CTX-M、VIM、IPM、OXA-23基因检测均为阴性.结论产ESBLs是我院耐药PA的重要原因,耐碳青霉烯的PA不含VIM、IPM、OXA-23基因.【期刊名称】《临床肺科杂志》【年(卷),期】2014(019)001【总页数】4页(P14-17)【关键词】铜绿假单胞菌;耐药率;超广谱β-内酰胺酶;碳青霉烯【作者】吕志芳;施炜;丁国正;胡安群;潘青;杨延国;刘静;李长东【作者单位】246000,安徽安庆,安徽医科大学附属安庆市立医院,呼吸内科;246000,安徽安庆,安徽医科大学附属安庆市立医院,呼吸内科;246000,安徽安庆,安徽医科大学附属安庆市立医院,呼吸内科;246000,安徽安庆,安徽医科大学附属安庆市立医院,检验科;246000,安徽安庆,安徽医科大学附属安庆市立医院,呼吸内科;246000,安徽安庆,安徽医科大学附属安庆市立医院,呼吸内科;246000,安徽安庆,安徽医科大学附属安庆市立医院,呼吸内科;246000,安徽安庆,安徽医科大学附属安庆市立医院,呼吸内科【正文语种】中文铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugionsa，PA)是一种常见的院内获得性感染的条件致病菌，常常感染免疫力低下的患者，铜绿假单胞菌肺炎致死率达30%以上，败血症的病死率高达80% ～90%，近年来，检出的耐药PA越来越多。
耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌金属β-内酰胺酶基因检测及其与整合子的关系研究
Ｚ ｈ ｏ ｎ ｇ ｓ ｈ ａ ｎ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｓ ｃ ｈ ｏ ｏ ｌ ｏ ｆ Ｓ ｕ ｎ Ｙ ａ ｔ － ｓ ｅ ｎ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｙ， ｔ Ｇｕ ａ ｎ ｇ ｚ ｈ ｏ ｕ ５ １ ０ ０ ８ ０ ）
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中 国抗 生 素 杂 志 ２ ０ １ ３ 年９ 月第３ ８ 卷第９ 期
７ ０ ５
文章编号：１ ０ ０ １ — ８ ６ ８ ９ ｆ ２ ０ １ ３ ） ０ ９ — ０ ７ ０ ５ — ０ ６
耐碳 青霉烯 类铜绿假单胞菌 金属 ． 内酰胺酶基 因检测及其 与整合子 的关 系研 究
张娟 叶聪秀２ 曹开源３ 刘配辰 黄小荣ｓ ，
Ｐｓ ｅ ｕ ｄ ｏ ｍｏ ｎ ａ ｓ ａ ｅ ｒ ｕ ｇ ｉ ｎ ｏ ｓ ａ
Ｚｈ ａ ｎ ｇ Ｊ ｕ ａ ｎ ， Ｙｅ Ｃｏ ｎ ｇ － ｘ ｉ ｕ ２ ， Ｃａ ｏ Ｋａ ｉ — ｙ ｕ ａ ｎ ， Ｌ ｉ ｕ Ｐ ｅ ｉ — ｃ ｈ ｅ ｎ ４ ａ ｎ ｄ Ｈｕ ａ ｎ ｇ Ｘｉ ａ ｏ — ｒ ｏ ｎ ｇ
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耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌的耐药性检测
耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌的耐药性检测摘要：目的：分析探讨耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌对其他抗菌药物的耐药性。
方法：对我院2020年1月至2020年8月收集的187株铜绿假单胞菌进行回顾性分析，均采用全自动微生物鉴定系统开展细菌鉴定和药敏试验，评定铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药的菌株数。
结果：铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药的菌株数可以达到121株，占比64.71％，其中以美罗培南和亚胺培南同时耐药为主。
改良Hodge试验的阳性菌株检出率达到52株，阳性率为42.95％。
结论：铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药的机制较为复杂，为减少耐药菌株的产生可以加强抗菌药物的合理应用，以此减少医院感染暴发流行事件。
关键词：铜绿假单胞菌；碳青霉烯酶；耐药性；微生物铜绿假单胞菌是临床一种常见的条件性致病菌，极易导致医院发生感染事件。
作为一种假单胞菌属，革兰阴性杆菌，铜绿假单胞菌会导致免疫力低下和重症监护室患者感染，成为威胁重症治疗患者生命安全的主要感染病菌[1]。
更为不利的一点是，随着近年来铜绿假单胞菌抗菌药物的广泛使用，所出现的耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌越来越多，已经成为医院感染防控的棘手问题之一，因而明确耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌对其他抗菌药物的耐药性尤为关键[2]。
本文对我院2020年1月至2020年8月收集的187株铜绿假单胞菌进行回顾性分析，现将本次研究成果作如下的分析论述。
1资料与方法1.1.一般资料对我院2020年1月至2020年8月收集的187株铜绿假单胞菌进行回顾性分析，药敏试验质控菌株ATCC27853。
1.1.方法本次试验选用由法国梅里埃公司所生产的Vitek-2 Compact 全自动微生物鉴定系统，操作过程中严格遵循相关规范，以美国临床实验室标准化研究所作出的解释标准来评定药敏结果。
在改良Hodge试验中，在无菌状态下制备大肠杆菌0.5麦氏浊度菌悬液并10倍稀释，而后用棉签蘸取菌液涂布MH平皿，在MH平皿上常规放置厄他培南纸片。
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耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌分子流行病学研究
张风 华 １ 李小 燕 ２ 王 宝枝 １ 张 晓英 ５ １ １ ４ ４ ７ ； １ ． 广卅 Ｉ 医科大 学 附属第 四医院普 外科 ， 广东 广 州
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医院普通外科临床分离的 １ ０ ２ 株铜绿假单胞菌对常用 的 １ ３ 种抗菌药物的最低抑菌浓度 （ Ｍ Ｉ Ｃ ） 。 采用脉冲场凝胶 电泳（ Ｐ Ｆ Ｇ Ｅ ） 技术对耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌进行基因分型及毒力基因筛查 ， 同时采用 Ｐ Ｃ Ｒ调查毒力基因 ｅ ｘ ｏ Ｕ、 ｅ ｘ ｏ Ｓ在耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌 中的发生率 。 结果 １ ０ ２ 株铜绿假单胞菌对 临床常用的 １ ３种抗菌药物耐药 率均低于 ３ ０ ％， 对阿米卡星的耐药率最低 （ ９ ． ８ ％） ， 对亚胺培南的耐药率为 ２ ３ ． ５ ％， 对美罗培南 的耐药率为 １ ８ ． ６ ％。
征是多有气管插管史 、 Ｉ Ｃ Ｕ住院史 、 抗感染治疗多采用联合用药 ， 以铜绿假单胞菌感染居多 ； ｅ ｘ ｏ Ｕ 一 ／ ｅ ｘ ｏ ｓ ＋ 患者的
临床 特 征是 多存 在肺 部基 础疾 病 ， 预 后好 于 ｅ ｘ ｏ Ｕ ＋ ／ ｅ ｘ ｏ Ｓ － 型患 者 ， 以 铜绿假 单胞 菌定 植居 多 。 结论 耐碳 青霉 烯
Ｚ ＨＡＮＧ Ｆ ｅ ｎ ｇ ｈ ｕ ｄ ＬＩＸｉ ａ ｏ ｙ ａ ｎ ２ ＷＡＮＧ Ｂ ａ ｏ ｚ ｈ ｉ ｊ Ｚ ＨＡＮＧ Ｘｉ ａ ｏ ｙ ｉ ｎ ｓ ｄ
１ ． Ｄｅ ｐ ａ ｒ ｔ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｆ Ｇｅ ｎ ｅ ｒ ａ ｌ Ｓ ｕ ｒ ｇ ｅ ｒ ｙ ， ｔ ｈ ｅ Ｆ ｏ ｕ ￣ｈ Ａｆ ｉ ｆ ｌ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ Ｈｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ ｏ ｆ Ｇｕ ａ ｎ ｇ ｚ ｈ ｏ ｕ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ，Ｇｕ ａ ｎ ｇ ｄ ｏ ｎ ｇ Ｐ ｒ ｏ ｖ ｉ ｎ ｃ ｅ ， Ｇｕ ａ ｎ ｇ ｚ ｈ ｏ ｕ ５ １ １ ４ ４ ７ ，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ； ２ ． Ｄｅ ｐ ａ ｒ ｔ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｆ Ｃ ｌ ｉ ｎ ｉ ｃ ａ ｌ Ｌ ａ ｂ ，ｔ ｈ ｅ Ｆ ｏ ｕ ｔｈ ｒ Ａ ｆ ｉｌ ｆ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ Ｈｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ ｏ ｆ Ｇｕ ａ ｎ ｇ ｚ ｈ ｏ ｕ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｕｎ ｉ — ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ，Ｇｕ ａ ｎ ｇ ｄ ｏ ｎ ｇ Ｐｒ ｏ ｖ ｉ ｎ ｃ ｅ ， Ｇｕ ａ ｎ ｇ ｚ ｈ ｏ ｕ ５ １ １ ４ ７ ， Ｃｈ ｉ ｎ ａ
［ Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ］Ｏｂ ｊ ｅ ｃ ｉ ｔ ｖ ｅ Ｔ ｏ ｉ ｎ ｖ ｅ ｓ ｔ ｉ ｇ ａ ｔ ｅ ｔ ｈ ｅ ｇ ｅ ｎ ｅ ｒ ａ ｌ ｓ ｕ ｒ ｇ ｅ ｒ ｙ ｏ ｆ Ｐ ｓ ｅ ｕ ｄ ｏ ｍｏ ｎ ａ ｓ ｏ ． ｅ ｒ ｗ ｇ ｉ ｎ ｏ ｓ ａ ｎ ｏ ｓ ｏ ｃ ｏ ｍｉ ａ ｌ ｇ ｅ ｎ ｅ ｈ ｏ ｍｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ａ ｎ ｄ
类铜绿假单胞菌在普通外科存在流行趋势 ， 应加强铜绿假单胞菌耐药监测 ， 防止耐药菌的暴发流行 。
【 关键 词】 铜 绿假 单胞 茵 ； 耐碳 青 霉烯 ； 脉 冲 场凝胶 电泳
【 中图分类号１ Ｒ ６ ３ ２
【 文献标识码１ Ａ
［ 文章编号１ １ ６ ７ ３ — ７ ２ １ ０ （ ２ ０ １ ５ ） ０ ６ （ ｂ ） － ０ １ ０ １ － ０ ４
２ ４株 耐碳 青 霉 Ｔ Ｉ ￣ Ｓ Ｓ ，其 中 ３株 ｅ ｘ ｏ ｕ ＋ ／ ｅ ｘ ｏ Ｓ 一 ， ２ １ 株ｅ ｘ ｏ Ｕ 一 ／ ｅ ｘ ｏ ｓ ＋ ； Ｐ Ｆ Ｇ Ｅ分型 主要 为 Ａ、 Ｂ 、 Ｃ 、 Ｄ 、 Ｅ 、 Ｆ共 ６ 型， 其 中 Ａ型 为主要 流 行株 。 回顾 性分 析表 明 ， ｅ ｘ ｏ Ｕ ＋ ／ ｅ ｘ ｏ Ｓ － 型 患者 临床 特
２ ． 广州医科大学附属第四医院检验科 ， 广东广州 ５ １ １ ４ ４ ７
【 摘要】 目的 探讨院内普通外科分离的铜绿假单胞菌的基因同源性及 Ⅲ型分泌系统（ Ｔ ｒ ｓ ｓ ） 的毒力基因的临床意 义。 方法 采用纸片扩散法 （ Ｋ Ｂ法 ） 及微量肉汤稀释法检测 ２ ０ ０ ９ 年 １ ２ 月一 ２ ０ １ ４ 年９ 月广州 医科大学 附属第四
ｎ ｏ ｓ ａ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ ｆ ｒ ｏ ｍ Ｄｅ ｃ ｅ ｍｂ ｅ ｒ ２ ０ ０ ９ ｔ ｏ Ｓ ｅ ｐ ｔ ｅ ｍｂ ｅ ｒ ２ ０ １ ４ ｉ ｎ Ｄｅ ｐ ａ ｒ ｔ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｆ Ｇｅ ｎ ｅ ｒ ｌ ａ Ｓ ｕ ｒ ｇ ｅ ｒ ｙ ， ｔ ｈ ｅ Ｆ ｏ ｕ ｔｈ ｒ Ａｆ ｆ ｉ ｌ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ Ｈｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ