HER2检测试剂盒(免疫组化法)说明书-Agilent
HER2检测试剂盒（免疫组化法）说明书
【产品名称】
通用名称：HER2检测试剂盒（免疫组化法）
英文名称：HercepTest? for Automated Link Platforms
【包装规格】
50测试/盒
【预期用途】
用于常规经福尔马林固定、石蜡包埋的乳腺癌组织的组织学评估和HER2的过表达的半定量检测。以及经福尔马林固定、石蜡包埋的胃腺癌组织切片，包括胃食管连接处肿瘤中的HER2的过表达检测。
该抗体着色为棕色DAB染色，定位于细胞膜。是一种半定量免疫组化分析方法，适用于考虑接受曲妥单抗治疗患者的辅助评价方法。
人HER2基因（也称之为ERBB2或NEU）编码蛋白通常称之为HER2或p185HER2。HER2蛋白是一种膜受体酪氨酸激酶，与表皮生长因子受体（EGFR或HER1）具有同源性(1-8)。HER2蛋白通常由各种表皮细胞表达，是一种正常组织成分（8）。
部分乳腺癌患者，HER2蛋白过表达是其恶性转化及肿瘤进展过程的一部分（9）。乳腺癌细胞的表面过表达HER2，提示可能是抗体治疗的一个靶点。曲妥单抗是一种人源的单克隆抗体（10），该抗体能够HER2蛋白高亲和力结合，而且，体内和体外研究已经证实，这种结合可以抑制过表达HER2蛋白的细胞的生长。
大量研究结果表明胃癌中HER2蛋白过表达，HER2基因扩增（31）。无论是IHC还是FISH检测结果中，大约20%的胃癌患者HER2阳性。体内和体外前期临床研究表明，曲妥单抗在不同的胃癌模型上被证实有效，从而带动了多项临床研究（31-35）。在一项III期BO18255临床研究中，ToGA试验，HER2-阳性患者，以及不能手术治疗局部进展期胃癌，胃部复发性/转移性胃癌，或胃食管连接处癌，这些患者被随机地分配接受5-FU或卡培他滨以及顺铂治疗，既可以单独应用也可以与曲妥单抗联合应用。在一项III期BO18255临床研究中，ToGA试验，不能手术治疗局部进展期胃癌，胃部复发性/转移性胃癌，或胃食管连接处癌等HER2-阳性患者被随机地分配接受5-FU或卡培他滨以及顺铂治疗，可单独应用也可与曲妥单抗联合应用。联合治疗的患者整体生存率（OS）有显著性差异（36,37）。曲妥单抗是一种人源化的单克隆抗体（10），可与HER2蛋白高亲和力结合，体内和体外研究均显示，其可抑制肿瘤细胞的生长（32-35）。
【检测原理】
HercepTest?检测试剂盒包含对常规处理的、石蜡包埋的样本进行两步法免疫组化染色所需要的全部试剂。兔抗人HER2蛋白一抗孵育后，该试剂盒采用基于葡聚糖技术的即用型显色试剂。该试剂包含羊抗兔二抗和偶联至葡聚糖多聚体骨架上的辣根过氧化酶分子。因此，不需要再依次使用连接抗体，人免疫球蛋白显色试剂和胎牛血清之间的交叉反应也因为使用固相吸附材料而消除。依次填加的色素原的酶转换，也使得显色反应发生于抗原所在部位。标本需要复染和封片。反应结果在光学显微镜下观察。质控玻片包含3个福尔马林固定、石蜡包埋的人类乳腺癌细胞系，染色强度分别在0、1+、以及3+，提供用于对染色结果进行评估。这些细胞的染色强度与其所表达的受体密度一致。
【主要组成成分】
1.所提供的试剂：代码SK001
以下所列举的材料足够用于50个测试（50张切片与抗HER2蛋白一抗孵育，50张切片与相应的阴性质控试剂孵育）。测试数是根据每张切片使用200 微升的试剂，抗原修复液除外。该试剂盒所提供的材料足够用于最多10次免疫组化染色。
数量说明
1×22 mL
过氧化物酶阻断剂。
3%的过氧化氢，含有15 mmol/L的叠氮钠（NaN3）。
1×12 mL
兔抗人HER2多克隆抗体。
即用型亲和分离的抗体,保存在0.05 mol/L Tris/HCl, 0.1 mol/L NaCl, 1%BSA, 酒
石黄(Tartrazin), 专利蓝V(Patentblue V), 15 mmol/L NaN3, pH 7.2溶液中。
免疫原：合成的HER2蛋白的C-末端（细胞质部分）片段部分，并偶联至血蓝蛋
白上。
特异性：HER2蛋白
纯化方法：该抗体采用固相的HER2蛋白肽段亲和分离。
1×22 mL
显色试剂。
辣根过氧化物酶偶联的葡聚糖聚合物和亲和分离的的羊抗兔免疫球蛋白。保存在
Tris/盐酸缓冲液内，该缓冲液内含1.1% NaCl ，3.5% 聚乙二醇（PEG）及2% BSA，
0.05% 氨基安替比林和0.05% 酪蛋白。
1×10 mL
阴性质控试剂。
与HER2抗体等价蛋白浓度下的正常兔血清免疫球蛋白成分，保存在0.05 mol/L
Tris/HCl, 0.1 mol/L NaCl, 15 mmol/L NaN3, pH 7.2，并含有1%BSA稳定剂的溶液
内。
2×22 mL
DAB底物缓冲液。
50 mM咪唑, 1mM N, N'-乙基双(2-[2-羟基苯基]甘氨酸) (EDHPA), 0.1%乙基苯基
聚乙二醇（Nonidet P-40）, 0.02% 过氧化氢, 0.01% 氯化苯二甲烃铵, pH 7.5。1×1mL
DAB 显色液。
5% 3, 3’-二氨联苯胺四盐酸显色剂溶液。
3×500mL
抗原修复液（包含清洗剂）（10×）。
0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液，1% 吐温-20，pH 5.7。
2 × 5
质控切片
每张切片包含3个福尔马林固定的、石蜡包埋的乳腺癌细胞系，代表了不同的
HER2表达水平：MDA-231（0），MDA-175（1+），以及SK-BR-3（3+）。质控切
片已经进行了热处理，以便使组织切片能够更好地黏附至玻片上。任何对质控切
片的其它热处理均可能影响组织切片与玻片的黏附性能，而影响染色效果。
10 ×
试剂瓶
用户可充填式试剂瓶，12 mL容量。
每瓶可容纳12毫升的试剂。瓶内装有显色液时（也可以参阅试剂制备部分），使
用前应该混匀。此瓶以单独的包装袋提供。
提示：所有的试剂配方均专用于本测试。根据指定的方法进行测试，不能进行替换。
2.必需但未提供的材料
1)Dako洗脱缓冲液，代码S3006
2)复染：苏木素染色液，如用于Dako公司Automated Link平台的苏木素缓冲液，（代码
SK308）
3)盖玻片
4)蒸馏水或去离子水
5)干燥箱，能够保持在60oC或较低的温度。
6)乙醇，纯乙醇和95%
7)光学显微镜（4-40倍物镜放大率）
8)封片剂，诸如Dako Faramount (代码S3025) 或Dako Glycergel (代码C0563)
9)用于过程控制的阳性或阴性组织（参阅质控切片部分）
10)载玻片，SuperFrost Plus防脱载玻片, 多聚赖氨酸包被载玻片, 或Dako 硅烷载玻片
(代码S3003)
11)二甲苯，甲苯，或二甲苯替代品
SK001 用于Dako公司组织染色机，更多信息及使用说明请参考Dako公司组织染色机说明书。
【储存条件及有效期】
有效期9个月。
未上机时，2～8℃保存。HercepTest?过氧化物酶阻断剂，HercepTest?显色剂，HercepTest?DAB底物缓冲液，以及HercepTest?DAB色素原2～8℃暗处保存。
载机稳定性为24°C，80小时。
开瓶稳定性如下:
制备的底物显色液在2～8℃下可稳定保存5天。
未使用的稀释后的抗原修复液，室温下存放效期为1周（7天），2～8℃条件下存放效期为1个月（31天）。
不要在瓶上标记的效期后使用。如果试剂未按说明书指定的条件存储，用户须对存储条件进行有效性确认（14a，14b）。注意，质控玻片也必须2～8℃保存。
尚没有证据显示该产品不稳定。因此，在对患者标本进行检测时，应同时运行阳性和阴性质控。如果异常的染色结果不能用实验室检测过程变化解释，怀疑是抗体的问题质量所导致，请与我们的技术支持人员联系。
生产日期，失效日期：见标签。
【适用仪器】
组织染色机（AutoStainer link 48）
【样本要求】
用于免疫组化染色的活检标本必须进行保存处理。标准的组织处理方法应该适用于所有标本（15）。
对于胃腺癌标本，包括源自活检，剪切，或手术切除的胃食管结合部癌，必须正确处理以保存组织用于免疫组织化学染色。当检测小的活检标本时，确认完整的肿瘤形态学，并保存有足量的肿瘤细胞用于IHC评价。如果对活检标本进行HercepTest?检测，需不同肿瘤区域的的多个标本（7-8）来评价活检的标本，以确保对HER2蛋白的评价更为客观。
石蜡包埋的组织切片
组织标本应保存在中性福尔马林缓冲液（对于乳腺癌组织标本：或Bouin’s固定液）内常规处理并石蜡包埋以备使用。例如，活检标本厚度应该在3-4毫米之间，在中性福尔马林缓冲液内固定18-24小时。在胃癌ToGA临床试验中活检标本固定6-8小时（请参阅（36））。经一系列酒精和二甲苯脱水、透明，然后在不超过60o的熔化石蜡内浸蜡。如果存储于温度较低的环境内（15-25oC），经适当固定和包埋的表达HER2蛋白的组织在切片和封片前可无限期保存（15，16）。在美国，1988年颁布的临床实验室改善法案，CFR第42款493.1259（b）要求“实验室自检查之日起必须保留染色后的切片至少10年，相应的组织蜡块自检查之日起至少2年”（16）。
组织标本应该切割成为4-5微米厚的切片并固定于玻片上，室温下干燥至少12小时（直至干燥），或37oC过夜或60oC条件下1小时。注意：在≥60oC的环境超过1小时，可能会导致膜相关蛋白HER2免疫反应活性的降低或丧失（17）。
为了保留免疫原性，封闭在载玻片（SuperFrost Plus，多聚-赖氨酸或硅烷化玻璃切片）上的组织，当在室温（20-25oC）下存储时应该在4-6周内进行染色（18）。需要进行HER2蛋白表达评价并确认肿瘤是否存在的切片，也应该同期准备。建议至少准备5张切片，1张切片用于观察肿瘤是否存在，2张切片用于HER2蛋白表达的评价（1张与兔抗人HER2蛋白抗体孵育，1张与阴性对照试剂孵育），另外2张切片备份保存。为了保留免疫原性，封闭在载玻片（SuperFrost Plus，多聚-赖氨酸或硅烷化玻璃切片）上的组织，当一直在室温（20-25oC）下保存时应该在4-6周内进行染色（18）。
HercepTest?对脱钙组织的应用效果尚未验证，不推荐使用。
参阅Dako公司的“教育指南：免疫组化染色方法”（19），更详细的标本制备信息，请参阅参考文献15和16部分。
【检测方法】
1.染色前的组织处理
为获得最理想的结果，在0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液内进行抗原修复是必须的。HercepTest?试剂盒内已提供此抗原修复液。该方法涉及到将固定在玻片上的组织切片放入盛有0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液的带刻度的水浴箱内或Dako免疫组化预处理系统（PT Link）内，在要求的温度内(95–99 °C) 进行热修复（20）。位于海拔高度较高的实验室应该应确定保持所需温度的最佳方法。
其它的抗原修复法也进行了测试，但未获得理想的重复性。未能按照以上给出的方法操作可能会影响检测结果。
2.试剂配制：
在染色前可以很方便地制备相应的试剂：
抗原修复液
用蒸馏水或去离子水按照1：10的比例配制足够的抗原修复液，用于既定的染色过程。未使用的稀释后的溶液，室温下存放效期为1周，2-8oC条件下存放效期为1个月。若溶液变浑浊，应丢弃。更详细的资料请参阅Dako公司的Automated Link Platform用户指南。
洗脱缓冲液
用蒸馏水或去离子水按照1：10的比例配制足量的清洗缓冲液。若溶液变浑浊，应丢弃。更详细的资料请参阅Dako公司的Automated Link Platform用户指南。
底物–显色液（DAB）
在用户可充填式试剂瓶内制备底物-显色液，每1毫升的DAB底物缓冲液内添加25微升的
DAB显色液并混匀。制备的底物显色液在2-8o下可稳定保存5天。该溶液在使用前应该充分混匀。溶液内出现的任何沉淀不影响染色效果。
用户可充填式试剂瓶中装入混合后的底物-显色液后，在使用前必须在Dako公司的Automated Link Platform工作平台上进行设定。更详细的信息，请参阅Dako公司的Automated Link Platform工作平台用户指南。
提示：DAB显色液的颜色在透明至浅棕黄色之间。颜色的变换不会影响产品的染色性能。请按照说明书进行稀释。向DAB底物缓冲液内添加过量的DAB显色液可能会导致阳性标记的褪色。
复染
DAB染色反应的最终显色反应在酒精和水溶液内。DAB染色反应的终产物难溶于乙醇和水。苏木素染色液（代码SK308）用于复染。必要的步骤和孵育时间已经在Dako Link的软件内设定。无须制备其它试剂。
封片剂
推荐使用非水溶性，永久封片剂。但是，水溶性封片剂也可以使用。推荐使用Dako Faramount水溶性封片剂，即用型（代码S3025）或Dako Glycergel?封片剂（代码C0563），用于水溶性封片。液化的glycergel在使用前应该预热至大约40（± 5）oC。
3. 检测步骤
方法要点
用户应该仔细阅读使用说明书，并熟悉所有成分和试剂的使用方法（参阅注意事项部分）。
在染色过程中的任何阶段均不能使切片干燥。组织切片干燥可能会增加非特异性着色。
染色过程中的所有必需的步骤和孵育时间在Dako Link软件内均进行了设定。参阅Dako Automated Link Platform(s)相关资料中有关程序方案，放置载玻片和试剂详细说明等。如果染色过程被中断，切片可保存在缓冲液中，接着进行一抗孵育，在室温（20-25 oC）下1小时不会影响染色的效果。
脱蜡及再水化
在进行染色前，组织切片必须脱蜡，以清除包埋介质并重新水化。避免脱蜡不完全。包埋介质残留将会导致非特异性染色的增加。这些操作步骤应该在室温（20-25 oC）下进行。
1)将切片浸入二甲苯染缸中，孵育5（±1）分钟。更换染缸再重复1次。
2)除去过量的液体，并将切片浸入纯乙醇内3（±1）分钟。更换染缸再重复1次。
3)除去过量的液体，并将切片浸入95%的乙醇内3（±1）分钟。更换染缸再重复1次。
4)除去过量的液体，并将切片浸入蒸馏水或去离子水内30秒。
按照切片染色规程中抗原修复部分中所描述的内容开始染色。
二甲苯和酒精溶液应该在使用40张切片后更换。也可以使用甲苯或二甲苯替代品，诸如Histoclear。
提示：本试剂盒所使用的试剂和说明书已经进行了相应的最佳优化。对试剂进一步的稀释或改变孵育温度可能会导致错误或不一致的结果。用户所在实验室组织处理及技术方法的差异，可能会导致使用曲妥单抗疗法患者选择的错误。
染色规程
所有必要的步骤及孵育时间在Dako公司的全自动连接工作平台上Automated Link Platform(s)的软件内进行了设定。脱蜡，水化及抗原修复后，设备将按照以下流程对切片进行处理。
步骤1：抗原修复
将抗原修复液（参阅试剂制备部分）倒入免疫组化预处理系统Dako PT水槽或染色缸中，例如Coplin染色缸。
Dako 免疫组化预处理系统PT Link：将抗原修复液倒入免疫组化预处理系统水槽内预热至85oC。一经加热抗原修复液即呈雾状。将室温下脱蜡的切片放置到在自动染色系统支架上，
浸入预热的抗原修复溶液内。将免疫组化预处理系统Dako PT Link加热至97oC，并在97oC条
件下孵育40（±1分钟）。使切片在免疫组化预处理系统Dako PT Link内冷却85 oC。从免疫组
化预处理系统Dako PT Link内取出装有切片的支架。使染色缸在工作台上打开盖子继续冷
却。采用清洗缓冲液清洗切片。更详细的信息，请参阅Dako PT Link用户指南。
Coplin染色缸：将装有抗原修复液的染色缸置于水浴锅内。加热水浴锅，使修复液的温
度达95-99oC。一旦抗原修复液成云雾状外观，盖上染色缸盖子，使温度稳定在一个水平上，
并避免蒸发。将室温下脱蜡的切片浸入染色缸中预热的抗原修复液内。将水浴箱和抗原修复
液的温度调回95-99oC。并在95-99oC条件下孵育40（±1分钟）。从水浴箱内取出装有切片的
染色缸。室温下使切片在抗原修复液内冷却20（±1）分钟。倒出抗原修复液后用洗脱缓冲液
清洗切片。
为了获得最佳的性能，在染色前，抗原修复后，将切片在洗脱缓冲液内浸泡5-20分钟。
提示，抗原修复液为一次性使用品，不要重复使用。
步骤2：染色过程
抗原修复后，将切片放置于支架上，并将支架放置于Dako Automated Link Platforms上。
机器将进行染色过程，添加适量的试剂，监控孵育时间，并在每次添加试剂之前清洗切片。
试剂的孵育时间已经在Dako Link软件内预先进行了相应的设定。
步骤3：复染
采用苏木素染色液（代码SK308）进行玻片复染。Dako软件内提供了两种染色方案。一
种染色方案包括苏木素染色液复染，而另外一种染色方案不包括苏木素染色液复染。苏木素
染色液的孵育时间在包括复染的方案内已预先设定。有关程序设定方案更详细的资料，请参
阅于Dako Automated Link Platforms用户指南。
步骤4：封片
推荐使用非水溶性，永久封片剂。但是，水溶性封片剂也可以使用。Dako Faramount
水溶性封片剂，即用型（代码S3025）或Dako Glycergel?封片剂（代码C0563），用于水溶性
封片。
提示：可方便时再读片。但是，如果用的是水溶性的封片剂，暴露于强光下1周可能会
退色。为了最大限度地减少退色，应该将切片于室温（20-25oC）下暗处存储。
3.质量控制
实验室在组织标本固定，处理，以及包埋过程中与本方法的差异可能会导致染色结果的
显著性差异，除了Dako公司提供的质控切片，定期常规的室内质控是必须的。
在美国，有关质控问题，可以参阅美国病理学院（College of American Pathologists，CAP)
认证项目内有关免疫组化的相关问题，也可以参阅CLSI（正式的名称为NCCLS）有关免疫
组化质量控制，已经批准的指南（23）及标准24内附加的资料。
组织：跟患者标本一样固定和处理特异性抗体及检测系统非特异性抗体*或同样用于特
异性抗体的缓冲液检测系统
阳性质控：
包含可检测到目的抗原的组织或细胞（位于患者的组织）。理想的质控应该是弱阳性的染色组织，由于这些组织对抗体或抗原降解最敏感
控制所有的分析步
骤。采用HER2蛋白染色
对试剂和方法进行评价
检测非特异性染色背景
阴性质控：
阴性的组织或细胞（位于患者
检测意外的抗体与
细胞或细胞成分的交叉
检测非特异性染色背景
组织或阳性质控组织内）反应
患者组织检测特异性染色检测非特异性背景染色由Dako公司提供质控切片只控制染色过程
表1：日常质控的目的。
* 特异性抗体是来自同一物种的血清标本，但是并不直接针对同一靶抗原。
检测非特异性抗体结合，例如，与组织内抗体的Fc段结合。
质控切片（提供）
每一片所提供的质控切片内包含3个福尔马林固定，石蜡包埋的人类乳腺癌细胞系，染色强度评分为0，1+，和3+。每次染色需要一张切片。Dako公司提供的细胞系染色质控切片旨在对染色有效性进行评价。
阳性质控组织
质控应该是新鲜的尸检/活检/手术标本，并和患者标本同样的方法尽快固定、处理和石蜡包埋。阳性组织质控可标示出组织制备正确，染色技术适当。每次染色运行应包括每个测试条件的阳性质控组织的检测。
阳性质控组织应该给出弱阳性的染色结果，以便能够检测到一抗灵敏度的微弱变化。试剂盒内提供的质控切片或标本如果处理方法与患者标本的处理方法不同，仅能够对试剂的性能进行评价，并不能确认组织制备方法的优劣。前述的HER2蛋白2+过表达侵入性（浸润性）人类乳腺癌组织，可作为理想的阳性质控组织。
提示：已知的阳性质控组织仅能用于监控标本处理和测试试剂的性能，并不能用于辅助患者标本的特定诊断。如果阳性质控标本未能显示适当的阳性染色，患者标本的检测结果应是无效的。
阴性质控组织
阴性质控组织（已知HER2蛋白表达阴性）的固定，处理，以及包埋方法与患者标本一致，在每次染色运行时用以确认一抗的特异性，并能够提供特异性染色的背景。结肠，肝脏或甲状腺组织为合适的阴性质控组织。多数组织切片内不同细胞类型的多样性提供了内部阴性质控部位（这种对照应该由用户确认）。正常的乳腺腺管细胞也可以作为内部质控。
如果阴性质控组织或内部阴性质控出现了特异性染色，患者标本的检测结果应是无效的。
有关质控切片详细资料，请参阅Dako Automated Link Platforms用户指南。
非特异性阴性质控试剂
用所提供的非特异性阴性质控试剂代替一抗，检测每一个患者标本切片评估非特异性染色，可对抗原部位的特异性染色给出更好的解释。阴性质控试剂孵育时间应和一抗的孵育时间一致。
分析性能验证
在诊断过程中染色系统初次使用之前，用户应该在一系列室内质量控制的组织上进行分析性能确认，与已知的免疫组织化学性能特征相比较，这些性能特征反映在已知的阳性和阴性组织上。参阅既往质量控制方法内所述的具有代表性的已知阳性和阴性组织。参考本产品说明书内既往所述的质量控制方法，以及CAP认证项目有关免疫组化及/或CLSI（正式名称为NCCLS）免疫组化质量保证部分，已经批准的指南（23）。这些质量控制程序应该对每个新批号的抗体或分析参数的变化都是可重复的。对于乳腺癌检测，已经明确HER2蛋白表达强度0-3+的乳腺癌，及阴性组织，如结肠，肝脏，或甲状腺组织是合适的分析验证组织。
对于胃癌检测，已经明确HER2蛋白表达强度0-3+的胃腺癌组织，包括胃食管结合部癌组织，及阴性组织，如结肠，肝脏，或甲状腺组织是合适的分析验证组织。
4.故障处理
参阅Dako公司的参考手册内的故障处理部分（19），有关校正措施，或发现异常染色直接与Dako公司的技术支持人员联系。
问题可能的原因建议措施
1. 切片无染色1a. 程序设定错误。试剂未按正确顺
序使用。
1b. 清洗液内含有叠氮钠。
1c. 组织切片在脱蜡和热诱导抗原
修复前对组织过度加热，也可
能会导致HER2蛋白免疫反应
性的丧失。1a. 检测玻片的处理日志确认程序选择正确。
1b. 仅能采用Dako公司的清洗缓冲液，代码S3006.
1c. 在室温下空气内组织切片干燥至少12小时，或直至其干燥。
相应地，37°C过夜干燥或60°C
干燥至多1小时。组织切片在温
度升高的环境内干燥必须在有
校准功能的烤箱内进行，热量的
分布必须均一（17）。
2. 切片染色弱2a. 抗原修复不充分。
2b. 试剂孵育时间不够。
2c. 所用的固定方法不合适。
2d. 组织切片在脱蜡和抗原修复前
固定时加热过渡导致免疫反应
性丧失。2a. 检查切片抗原修复日志，确认已经进行了正确的抗原表位修复。2b. 设和切片日志确认试剂孵育时间是否正确。
2c. 确认患者的组织没有过渡固定，或没有使用适当的固定剂。
2d. 在室温下空气内组织切片干燥至少12小时，或直至其干燥。
相应地，37°C过夜干燥或60°C
干燥至多1小时。组织切片在温
度升高的环境内干燥必须在有
校准功能的烤箱内进行，热量的
分布必须均一（17）。
3. 切片背景染色
过重。3a. 未能彻底脱蜡。
3b. 在组织固定到玻片上之前添加
淀粉。
3c. 切片未能充分清洗。
3d. 在染色过程中切片干燥。
3e. 使用不适当的固定方法。
3f. 试剂与组织非特异性结合。
3a. 采用新鲜配制的溶液脱蜡。
3b. 避免使用淀粉添加剂将组织粘
附到切片上。许多添加剂有免疫
反应性。
3c. 检查切片日志，确认切片已经过
充分清洗。
3d. 确认向玻片上添加的试剂体积
是否正确。
3e. 确保使用批准的固定剂。替代固
定剂可能会导致背景染色过深。
3f. 检查标本的固定方法及是否有坏
死。
4. 组织脱片。4a. 使用不正确切片。4a. 采用硅烷化玻片，诸如Dako公司
的硅烷化玻片，（代码S3003），
SuperFrost Plus或多聚赖氨酸包
被的玻片。
问题导致问题的原因建议采取的措施
5. 特异性染色过
强。
5a. 使用的固定方法不适当。
5b. 试剂孵育时间过长。
5c. 使用不适当的洗脱缓冲液。5a. 确保仅能使用批准的固定剂和固定方法。
5b. 审核切片日志，确认试剂孵育时间正确。
5c. 只能使用Dako洗脱缓冲液，代码S3006。.
6. 质控切片细胞
系1+弱阳性。
6a. 采用的抗原修复方案不正确。
6b. 未能与底物显色液（DAB）反应。
6c. 质控切片降解。6a. 审核切片日志，确认是否进行了正确的抗原修复。
6b. 审核运行日志，确认显色剂制备是否正确。审核切片日志，确认
显色剂孵育时间是否正确。
6c. 检查试剂盒有效期，以及试剂盒包装上的存储条件。
7. 当加热时，抗
原修复溶液是
否呈云雾状外
观。7. 当加热溶液时，是否转化成云
雾状外观。
7. 这是正常的现象，不影响染色效
果。
8. 存储过程中
（未加热时），
抗原修复液即
呈云雾状外
观。8. 溶液存储条件错误或溶液已经
超过了有效期。
8. 检查试剂盒外包装上的存储条
件，丢弃过期的抗原修复液。
提示：如果问题不能归咎于任何上述原因，或按照建议的纠正措施操作，问题仍未能解决，请与Dako公司的技术支持联系，寻求进一步的帮助。有关染色技术和标本制备的其他详细资料，可以在Dako公司操作手册（19）（可从Dako公司获取），Atlas免疫组织化学（29）以及免疫过氧化物技术手册内找到。也可以参阅肿瘤诊断的实用方法。
【检测结果的解释】
针对乳腺癌
1)染色结果的解释
HER2蛋白过表达仅检测膜的染色强度和方式，应该采用表2内给出的评分标准进行评价。由病理学家在光学显微镜下对切片进行评价。采用10倍放大的光学显微镜用于免疫组化染色的评价及打分是合适的。用20-40倍放大的光学显微镜对染色打分进行确认。细胞质的染色为非特异性染色，不列入膜染色强度的评价（8）。为了帮助0，1+，2+，以及3+染色强度的鉴别，请参阅Dako公司的“HercepTest?解释手册–乳腺癌”- 染色强度图例。
只对侵润性乳腺癌患者的标本进行评分。如果同一标本内既有原位癌又有浸润癌，只对浸润癌评分。
表2：细胞膜染色强度标准
染色判读评分（报告给主治
医生）HER2蛋白过表达评价（报告给主治医生）
没有观察到染色或低于10%肿瘤细胞
膜染色
0 阴性
超过10%的肿瘤细胞弱的膜染色或几
乎难以察觉的膜染色。这些细胞仅是
部分膜染色。
1+ 阴性
超过10%的细胞弱到中等完整的膜染
色。
2+ 弱阳性
超过10%的肿瘤细胞细胞膜强染色3+ 强阳性HercepTest?针对HER2蛋白过表达的检测结果为阴性（染色强度为0和1+），弱阳性（染色强度为2+），以及强阳性（染色强度为3+）。HercepTest?并非用于为患者和医生提供预后诊断信息，也不能针对该目的进行评价。
每轮染色，切片均需按照表3内给出的顺序进行检查，确定每轮染色结果的有效性，以此对样本组织的染色强度进行半定量评价。
表3：切片评估的顺序。
读片顺序基本原理
1. 包含3个细胞
系的质控切片SK-BR-3质控细胞系呈现3+的棕色细胞膜染色（边缘），质控细胞系MDA-175部分棕色边缘染色，MDA-231质控细胞系无染色，表明是一次有效染色。
在MDA-175质控细胞系内也可以观察到少数至中等数量的弱阳性1+染色，呈不均一及不连续型膜染色。该细胞系也可观察到在细胞质的Golgi（高尔基）体区城点状免疫染色。MDA-231质控细胞系内棕色染色（HER2蛋白染色为阴性）表明分析过程存在非特异性染色。分析结果可能因为过度染色而无效。
2. 阳性质控组织
切片应该能够观察到棕色的膜染色。细胞质染色和阴性组织染色应该不超过1+。
3. 阴性质控组织
切片阴性质控组织切片上未出现特异性染色，证明试剂盒对相应的细胞/细胞成分没有交叉反应。如果在阴性质控组织切片上出现了特异性膜染色，该患者的标本染色结果应该考虑是无效的。
4. 采用阴性质控
试剂所进行患
者标本切片染
色缺乏特异性膜染色证明针对靶抗原的一抗标记为特异性标记。
用阴性质控试剂处理过的标本细胞质内的深棕色或棕色染色，诸如结缔组织，白细胞，红细胞，或坏死组织，应是非特异性背景染色，应该在相应的数据报告单内给出注释。
5. 用一抗进行的
患者组织切片
染色当在标本内检测到HER2蛋白过表达时，应该以棕色环形出现于一抗处理后的肿瘤细胞膜上。
1. 质控切片（提供）：用于HercepTest?染色的质控切片应该首先进行观察，以确认所有的试剂功能正常。在细胞膜上存在棕色（3, 3’-二氨基联苯胺, DAB）反应产物应该认为是阳性反应。
3+质控细胞系SK-BR-3存在环形的棕色细胞膜染色（环型），1+质控细胞系MDA-175存在部分的棕色环形，以及0质控细胞系MDA-231没有染色，表示该染色为有效染色。如果任何质控细胞系的染色超过了这个标准，现有标本的染色结果应该是无效的。
2. 阳性质控组织：阳性质控组织切片应该随后检查。该切片确认固定方法和抗原修复的有效性。采用完整的细胞系解释染色的结果，因为坏死和变性的细胞通常会出现非特异性染色（25）。染色应该在肿瘤组织内观察到棕色，呈细胞膜染色。细胞质的棕色染色及标本内阴性组织染色强度评分不应该超过1+。
3. 阴性质控组织：阴性质控组织切片应该在阳性质控组织切片检测后进行，以确认一抗标记靶抗原的特异性。阴性质控组织内缺乏特异性抗原染色证明该试剂盒与细胞系/细胞成分没有交叉反应。如果阴性质控组织出现特异性染色，患者标本的检测结果应为无效。相应地，阳性质控组织的阴性部分可以作为阴性质控组织，但这需要用户进行确认。值得注意的是在多数正常上皮组织可以观察到弱反应（染色强度为0~1+）。可能的阴性质控组织包括：结肠，肝脏和甲状腺。
非特异性染色，如果存在，将呈弥散形外观。点状散在的结缔组织染色也可在福尔马林固定过度的组织切片上观察到。
4+5. 患者组织：最后对用HercepTest?染色的患者组织进行检测。阳性染色强度的判定应该在阴性质控试剂染色的非特异性着色背景下进行。由于进行任何免疫组织化学分析，阴性的结果意味着抗原未能被检测到，抗原在所分析的细胞/组织内缺乏。参阅有关HercepTest?免疫反应性的总结和解释，局限性，以及性能参数特殊信息部分。
2)对HercepTest?染色结果解释的其他推荐信息
多数转移性乳腺癌HER2蛋白过表达的结果获得0或者3+评分。当这些患者中的多数已经全切or全部切除，少数1+和2+的病例依然难以确定。在您的实验室可用下列指南进行HercepTest?染色结果解释。
1.评价质控细胞系以确认分析性能。
2.评价阳性和阴性质控片的结果。
3.苏木素伊红（H&E）对样本的染色结果可以作为初次评价。（在HercepTest?染色背
景下肿瘤细胞可能不明显。病理学家要求进行苏木素伊红染色以确定组织中是否存在肿瘤细胞）。HercepTest?应该同一蜡块一对（连续）切片上进行。
4.HER2蛋白过表达切片染色应该在首先在低倍镜下进行。大部分的阳性细胞可以在
低倍放大下清晰地观察到。
5.保存完好，染色充分的标本区域应用于阳性肿瘤细胞数目的检测。
6.一般而言，患者的评分应在低倍镜下清晰判读。如果在低倍镜下1+/2+的判读困难，
通常评分记为1+。
7.为了确认膜染色，采用20-40倍的物镜放大倍数。
8.如果大多数肿瘤细胞有完整的膜染色，染色结果是2+或3+，需用20-40倍的放大镜
进行评分确认。
9.对于多数3+患者，至少有80%的肿瘤细胞为阳性染色，膜染色强度强。
10.如果标本中有接近10%临界值的肿瘤细胞阳性，推荐至少计数100个肿瘤细胞，以
确定染色细胞的百分数。
11.如果肿瘤细胞完整膜染色在弱和中等之间但计数超过10%，标本的评分应该为2+。
这种情况下其余的肿瘤细胞多数伴有不完整的膜染色。
12.如果有低于10%的肿瘤细胞有完整的环形膜染色，尽管其他肿瘤细胞可能显示不完
整的膜染色，评分应该为1+。
13.如果有低于10%的肿瘤细胞有完整的或不完整的环形膜染色，积分应该为0。
针对胃癌
1）染色结果的解释
HER2蛋白过表达仅检测膜的染色强度和方式，应该采用表9内给出的评分标准进行评价。由病理学家在光学显微镜下对切片进行评价。采用10倍放大的光学显微镜用于免疫组化染色的评价及打分是合适的。用5-40倍放大的光学显微镜对染色打分进行确认。细胞质的染色为非特异性染色，不列入膜染色强度的评价（8）。为了帮助0，1+，2+，以及3+染色强度的鉴别，请参阅Dako’s公司的“HercepTest?解释手册–胃癌”- 染色强度图例。
只对胃腺癌，包括胃食管癌患者的标本进行评分。如果同一标本内既有肠上皮化生又有胃腺癌，只对胃腺癌评分。对于HercepTest?切片染色结果，推荐每簇肿瘤细胞应该至少包括5个肿瘤细胞。在至少染色阳性的5个肿瘤细胞簇中，相邻的HER2染色阳性肿瘤细胞至少5个。
表9：HER2免疫组织化学HER2细胞膜染色的解释及评分
HercepTest?针对HER2蛋白过表达的检测结果为阴性（染色强度为0和1+），不确定（染色强度为2+），以及强阳性（染色强度为3+）。HercepTest?不用于为患者和医生提供预后信息，此用途未评价。
每轮染色，切片均需按照表10内给出的顺序进行检查，确定每轮染色结果的有效性，以此对样本组织的染色强度进行半定量评价。
表10：切片评估的规则。
读片规则基本原理
1. 包含3个细胞
系的对照玻片3+质控细胞系SK-BR-3呈现3+的棕色细胞膜染色（边缘），1+质控细胞系MDA-175部分棕色边缘染色，0质控细胞系MDA-231无染色，表明是一次有效染色。
在MDA-175质控细胞系内也可以观察到少数至中等数量的弱阳性1+染色，呈不均一及不连续型膜染色。该细胞系也可观察到在细胞质的Golgi体区成点状免疫染色。
0质控细胞系MDA-231内棕色染色（HER2蛋白染色为阴性）表明分析过程存在非特异性染色。分析结果可能因为过度染色而无效。
2. 阳性质控组织
切片应该能够观察到棕色的膜染色。细胞质染色和阴性组织染色应该不超过1+。
3. 阴性质控组织
切片阴性质控组织切片上没有特异性染色，证明试剂盒对相应的细胞/细胞成分没有交叉反应。如果在阴性质控组织切片上出现了特异性膜染色，该患者的标本染色结果应该考虑是无效的。
4. 采用阴性质控
试剂所进行患
者标本切片染
色缺乏特异性膜染色证明针对靶抗原的一抗标记为特异性标记。
用阴性质控试剂处理过的标本细胞质内的深棕色或棕色染色，诸如结缔组织，白细胞，红细胞，或坏死组织，应是非特异性背景染色，应该在相应的数据报告单内给出注释。
5. 用一抗进行的
患者组织切片
染色当在标本内检测到HER2蛋白过表达时，应该以棕色环形出现于一抗处理后的肿瘤细胞膜上。
1. 质控切片（提供）：用于HercepTest?染色的质控切片应该首先进行观察，以确认所有的试剂功能正常。在细胞膜上存在棕色（3, 3’-二氨基联苯胺, DAB）反应产物应该认为是阳性反应。
3+质控细胞系SK-BR-3存在环形的棕色细胞膜染色（环型），1+质控细胞系MDA-175存在部分的棕色环形，以及0质控细胞系MDA-231没有染色，表示该染色为有效染色。如果任何质控细胞系的染色超过了这个标准，现有标本的染色结果应该是无效的。
2. 阳性质控组织：阳性质控组织切片应该随后检查。该切片确认固定方法和抗原修复是有效的。采用完整的细胞系解释染色的结果，因为坏死和变性的细胞通常会出现非特异性染色（25）。染色应该在肿瘤组织内观察到棕色，呈细胞膜染色。细胞质的棕色染色及标本内阴性组织染色强度评分不应该超过1+。
3. 阴性质控组织：阴性质控组织切片应该在阳性质控组织切片检测后进行，以确认一抗标记靶抗原的特异性。阴性质控组织内缺乏特异性抗原染色证明该试剂盒与细胞系/细胞成分没有交叉反应。如果阴性质控组织出现特异性染色，患者标本的检测结果应为无效。相应地，阳性质控组织的阴性部分可以作为阴性质控组织，但这需要用户进行确认。值得注意的是在多数正常上皮组织可以观察到弱反应（染色强度为0~1+）。可能的阴性质控组织包括：结肠，肝脏和甲状腺。
非特异性染色，如果存在，将呈弥散形外观。点状散在的结缔组织染色也可在福尔马林固定过度的组织切片上观察到。
4+5. 患者组织：最后对用HercepTest?染色的患者组织进行检测。阳性染色强度的判定应该在阴性质控试剂染色的非特异性着色背景下进行。由于进行任何免疫组织化学分析，阴性的结果意味着抗原未能被检测到，抗原在所分析的细胞/组织内缺乏。参阅有关HercepTest?免疫反应性的总结和解释，局限性，以及性能参数特殊信息部分。
2）对HercepTest?染色结果解释的其他推荐信息
胃腺癌，包括胃食管结合癌患者HER2蛋白过表达评分范围从0至3+。当0和3+的患者已经全切or全部切除，少数1+和2+的病例依然难以确定。
在您的实验室可用下列指南进行HercepTest?染色结果解释。
1.评价质控细胞系以确认分析性能。
2.评价阳性和阴性质控片的结果。
3.苏木素伊红（H&E）对样本的染色结果可以作为初次评价。（在HercepTest?染色背
景下肿瘤细胞可能不明显。病理学家要求进行苏木素伊红染色以确定组织中是否存在肿瘤细胞）。HercepTest?应该同一蜡块一对（连续）切片上进行。
4.HER2蛋白过表达切片染色应该在首先在低倍镜下进行。大部分的阳性细胞可以在低
倍放大下清晰地观察到。
5.对于1+的患者，采用40倍物镜放大倍数确认细胞膜的染色。
6.对于2+的患者，采用10到20倍物镜放大倍数确认细胞膜的染色。
手术标本
1.保存完好，染色充分的标本区域应用于阳性肿瘤细胞数目的检测。
2.如果多数肿瘤细胞显示完整的，基底或侧面膜染色，染色强度应该为2+或3+。
3.手术标本中大于或等于10%的肿瘤细胞显示完整的，基底或侧面膜强染色，标本染
色强度应该为3+。
4.手术标本中大于或等于10%的肿瘤细胞显示完整的弱至中等程度的，基底或侧面膜
染色，标本染色强度应该为2+。
5.手术标本中大于或等于10%的肿瘤细胞部分细胞膜着色，强度为弱或微弱，标本染
色强度应该为1+。
6.手术标本中只有低于10%的肿瘤细胞染色，无论染色的模式如何（如，完整的，基
底侧面或侧面部分细胞膜），该标本染色强度均为零。
7.没有染色，染色强度评分为0。
活检标本
1.至少有5个染色的肿瘤细胞组成的细胞团，由5个连续的HER2蛋白染色肿瘤细胞
构成。
2.至少有5个染色的肿瘤细胞组成的细胞团，其染色呈强的完整性，基底侧面或侧面
膜染色，评分应该为3+，不考虑染色肿瘤细胞所占的比例。
3.至少有5个染色的肿瘤细胞组成的细胞团，其染色呈弱至中等强度完整的基底侧面
或侧面膜染色，评分应该为2+，不考虑染色肿瘤细胞所占的比例。
4.至少有5个染色的肿瘤细胞组成的细胞团，其染色呈微弱/弱的可见部分膜染色，评
分应该为1+，不考虑染色肿瘤细胞所占的比例。
5.如果该活检标本上没观察到染色，评分为0。
6.如果膜染色（不考虑染色强度）少于5个肿瘤细胞团，评分为0。
【检测方法的局限性】
1）一般局限性
1.免疫组织化学是一种多步骤的诊断方法，要求在适当的试剂选择；组织的筛选，固
定和处理；免疫组织化学切片的制备；以及染色结果的解释时均需经过特殊的培训。
2.组织染色的结果取决于在染色前对组织的处理或加工。不适当的固定，冷冻，冻融，
清洗，干燥，加热，切片，或其他组织或液体的污染均可能导致人为的误差，抗体封闭，或假阴性的结果。不一致的结果可能是由于固定或包埋方法的不同所致，或可能由于组织内部变化导致。
3.过度或不完整的复染也可能会导致对结果的误判。
4.对任何阳性结果或阴性结果的临床解读，必须在临床表现的范围内解释，并结合形
态学及其他病理组织学标准。对任何染色或缺乏染色的临床结果的解释，必须通过形态学观察，以及其他诊断测试并进行适当质控下进行。对染色结果进行解释是病理学家职责，他们熟悉抗体、试剂、以及使用方法。染色必须在有资质的实验室，在病理学家的监督下进行，由其负责审核染色结果并确保阳性和阴性质控的准确。
5.感染乙肝病毒患者，且乙肝病毒表面抗原（HBsAg）阳性患者的组织，用辣根过氧
化物酶染色时可能会表现为非特异性染色（26）。
6.试剂可能会与既往未测试过的组织产生非预期反应。非预期反应即便是在已测试过
的组织也不可能完全排除，由于抗原在新生组织上抗原表达的生物多样性所致，或由于其他病理组织所导致（27）。出现非预期反应，请联系Dako公司的技术支持。
7.假阳性的结果可能是由于蛋白质的非免疫性结合或与底物反应所致。也可能会导致
假性过氧化物酶活性（红细胞），以及内源性过氧化物酶活性（细胞色素C）（27）。
8.染色过程需在程序设定的室温（20-25°C）下进行。
2）产品特性的局限性
1.质控细胞系MDA-175上的抗原易于随时间而降解。评价质控玻片的结果应该结合质
控玻片的有效期。MDA-175细胞的阴性染色结果可能仅仅是表明质控切片上抗原已经降解。质控切片必须2-8°C储存。
2.假阴性的结果也可能是由于组织内的抗原随时间而降解。在室温（20-25°C）储存时，
标本应该在切片后4-6周内进行染色。
3.不要用其他批号的试剂，或来其他厂商的试剂替换试剂盒内的试剂。
4.假阳性的结果可能源自对细胞质染色的评价。当评定染色结果时，仅对细胞膜染色
强度进行读取。
5.染色的质控切片只用于染色运行的确认，不能用作组织切片染色结果的评分依据。
6.偶见强病灶染色（3+），即所谓的“热点”。可能是固定及/或组织处理不均一所致。推
荐用同一标本的另一个蜡块进行染色。
7.用HercepTest?中的固定剂固定标本而不是用中性福尔马林缓冲液或Bouin’s固定
剂，其结果尚未确认。
8.乳腺组织中的正常上皮组织染色强度应该在0和1+之间。如果正常上皮染色高于1+，
应重复检测。值得注意的是正常扁桃体和食管上皮的染色强度可能会达到2+。
9.需要注意的是正常的扁桃体和食管上皮细胞染色强度可能达到2+。
10.应该避免对活检组织边缘碎裂的胃癌标本判读，这些标本的结果是容易受人为因素
的影响染色结果。
【产品性能指标】乳腺
临床比对研究
“研究用免疫组化试剂（CTA）”用于为曲妥单抗临床研究选择合适的患者，该试剂现已不再使用，HercepTest?是为替代CTA而研发的产品。
HercepTest?检测HER2蛋白过表达的性能通过对548例乳腺癌采用HercepTest?与CTA染色进行比对分析来完成。这些患者中没有参加曲妥单抗临床研究的患者。结果显示，这两种检测方法对这些患者的检测具有79%的符合率。
这些一致性结果也表明，HercepTest?检测结果为3+，非常有可能对应于CTA上的阳性结果，这些患者可能符合临床试验的入选标准（2+或3+）。HercepTest?检测2+的结果与CTA的检查结果并不一致。大约42%（53/126）的HercepTest?检测为2+的结果采用CTA 检测结果为阴性（0~1+），这些患者不能入选参加曲妥单抗临床试验。
HercepTest?对HER2过表达的检测结果分为阴性（染色强度0和1+），弱阳性（2+染色强度），强阳性（3+染色强度）。
HercepTest?与CTA的结果比较。
样本包括274例HER2蛋白阳性（2+或3+）适用曲妥单抗治疗的合适患者以及相同数量的HER2蛋白表达阴性的乳腺癌患者。表4是结果的2x2列联表，其中0和1+为阴性，而2+和3+为阳性。
表4：HercepTest?结果与CTA结果（标本数）的一致性2x2表。
HercepTest?结果与临床试验结果的整体双向一致性为79%（431/548），双侧95%
的置信区间为76~82%。两种测试方法之间21%的患者不一致。
H ercepTest?结果报告范围为0-3+，HER2蛋白过表达分为阴性（染色强度0和1+），
弱阳性（2+染色强度）和强阳性（3+的染色强度）。
表5：HercepTest?结果与CTA 结果的一致性3x3表。
CTA 的阳性结果一致，可能符合曲妥单抗临床研究的入组标准（2+和3+）。其中2+的HercepTest?检测结果 与CTA 的分析结果可能并不一致。大约为42%（53/126）的HercepTest?分析结果2+，但CTA 分析结果为阴性（0~1+），可能不能入组参加曲妥单抗临床试验。
准确性
HercepTest?也在两台显微镜上对来自石蜡包埋的168例乳腺癌组织进行了测试。
这些肿瘤组织已经采用其他5种不同的方法对HER2基因扩增或蛋白过表达进行了测定，包括室内Southern blot ，荧光原位杂交（FISH ）用于DNA
扩增，Northern blot RNA 分析，Western blot ，以及在冰冻组织上免疫细胞化学分析（28）。结果见表6。
表6. HercepTest?结果与基因扩增与HER2蛋白过表达联合分析的结果（OE ）比
较。
阳性一致率：43/69 = 62%
阴性一致率：99/99 = 100%
阳性（2+和3+）和阴性（0和1+）总体符合率85%(142/168)（95%的置信区间为78-89%）。5种分析方法均证实为阴性的患者中没有1例HercepTest?检测结果为阳性，而5种联合分析方法检出更多的阳性例数。
重复性
批内重复性
在1个实验室内对5个不同ICC强度染色评分标本进行了重复染色。每个标本采用随机双盲法重复染色3次。该方案在自动染色系统上进行。所有标本给出了100%的重复性结果。
批间重复性
批间重复性在3个实验室内4天中对5例不同的ICC强度标本进行染色评分，采用随机双盲法，在自动染色系统上进行。阳性结果比阴性结果具有更好的重复性，在同一个实验室内出现了2例标本评分出现1+和2+之间的差异。2+和3+的标本重复性为100%。
室间的重复性
室间重复性测试在三所地理位置不同的实验室间进行，对40例随机双盲的各种ICC染色强度标本进行评分。新鲜切片同时提供给每个实验室用于自动染色系统，并由病理专家进行评分，采用阳性/阴性评分，0和1+为阴性，2+和3+确定为阳性。室间一致性的百分比为83%~90%之间。与进行CTA检测的参考实验室检测结果进行比较，阴性结果（0和1+）之间存在12.5%（15/120）的差异。阴性结果（2+和3+）之间存在10%（12/120）的差异。
免疫反应性
表7是HercepTest?检测一组正常组织的免疫活性的结果。所有的组织均为福尔马林固定、石蜡包埋的的组织，并按照说明书给出的方法进行用HercepTest?进行测试。
表7：HercepTest?对正常组织反应性的检测结果总结。
3个标本均有同样的染色强度，除非另外说明。
【产品性能指标】胃
临床比对研究
曲妥单抗的安全性和有效性在临床研究ToGA中得以证实（37,38）。在ToGA中，3803例患者进行了HER2蛋白表达检测的入组检测。该临床研究同时采用IHC方法(HercepTest?，Dako)和FISH 方法(HER2 FISH（pharmDx?, Dako)检测HER2基因的表达水平。共获得3665例有效结果。
ToGA研究显示按照试验方案设定的标准，样本经由IHC 或FISH检测，22.1%的进展期胃癌患者HER2阳性。
这项研究是HER2阳性患者开放标记，随机，多中心III期临床，患者为不能手术的晚期癌症，复发性及/或转移性胃腺癌或胃食管连接处癌患者。
在ToGA实验中，HER2阳性被定义为IHC阳性（3+）(HercepTest?, Dako) 及/或HER2 FISH (HER2/CEN17 ≥2.0) 阳性(HER2 FISH pharmDx? Kit, Dako)。
患者入组后，被随机分配接受化疗（5-FU或卡培他滨以及顺铂）或化疗加曲妥单抗治疗。本研究的一级研究终点为患者存活（OS）。
在这项研究中，共594例患者被随机选中，584例患者接受了研究用药物，并参加最终分析数据。化疗联合曲妥单抗的一级研究终点统计结果显示优于单纯化疗的治疗结果。OS中位数从11.1个月增加至13.8个月（p = 0.0046），危险度为0.74（95%的置信区间为：0.60-0.91）。有关OS的Kaplan-Meier曲线结果见图1。
生存概率
治疗组
图1. OS的Kaplan-Meier曲线（n = 584）
一旦数据可用，预先指定的分析亚组通过HER2蛋白表达状态可以进行相应的分析。根据IHC评分的结果，两个新的HER2蛋白亚组已经明确定义：
第1组（“低表达HER2表达组”）：IHC 0/FISH+ and IHC 1+/FISH+ (n=131)
第2组（“高表达HER2表达组”）：IHC 2+/FISH+ 和IHC 3+ (FISH + 或FISH- 或FISH 没有结果(n=446)
对“HER2高表达组”（n=446）的OS的初步分析进行多重比较后发现联合用药组的获益更为明显。化疗联合曲妥单抗的患者的平均OS增加至16.0个月，而单纯化疗的患者仅11.8个月。该分析的危险度降低至0.65（95%CI:0.51-0.83）。有关OS的Kaplan-Meier曲线“HER2蛋
白高表达组”见图2。
ToGA 试验表明， IHC 和FISH 都能够有效预测化疗联合曲妥单抗的疗效，统计分析结果表明， HER2蛋白 (IHC2+/FISH+ 和 IHC3+)高表达患者治疗获益更多，这可以通过该蛋白是曲妥单抗的靶蛋白来解释。有关ToGA 试验更详细的资料，请参阅曲妥单抗说明书。
重复性
批内重复性
在同一实验室内对3个不同IHC 强度标本进行了重复染色。每个标本采用随机双盲法重复染色3次，在自动染色系统上进行。所有标本达到100%的重复性结果。
另一组批内重复性在同一实验室对11个不同IHC 评分的标本进行分析。每个标本重复3次，用手工染色。所有标本得到100%的重复性结果。
批间和室间重复性
HercepTest?检测了60例取自胃或胃食管结合处的不同的胃癌标本，这些标本为手术切除及活检标本，检测在不连续的5天里在3个研究中心进行。60例样本均匀分布在三个HER2状态, 由6位病理学家进行了总共2040例HER2评分。
日间一致性（阴性，不确定，阳性）范围从83.1%~98.3%。60例样本中的47例符合率为≥ 90%。由表11可见，3个研究中心日间一致性符合率分别为91.2%, 92.5% 以及 92.5%。
室间一致性结果为82.7%, 75.0% 以及 88.0%。根据Fisher 检验，不同中心之间结果没有差异。
每个研究中心的不同病理学家之间的评分一致性分别为88.0%, 83.6% 以及 81.0%（表
13）。
结论是，日间、室间及不同人员评分之间具有很好的一致性。
表11. 每天之间整体一致性百分数 – 60例次比较中的12例次 观察者 1 观察者 2 平均
一致性 CI95 LL 1 一致性 CI95 LL 1 一致性
中心 1 第 天1 vs 第 2天 85.0 74.4 93.3 84.9 91.2 第 3 天vs 第 4天 93.3 84.9 93.3 84.9
中心 2 第 1天 vs 第 2 天 95.0 87.3 83.1 72.0 92.5 第 3 天vs 第 4 天 96.7 89.7 95.0 87.3
中心 3 第 1天 vs 第 2 天 90.0 80.5 91.7 82.7 92.5 第 3 天vs 第 4 天 96.7 89.7 91.7 82.7
1C195LL ： 95%置信区间下限 表12. 中心之间整体一致性以百分数表示
一致性 CI95 LL 1
平均 一致性 中心1 vs 中心2 第 1天 vs 第 1 83.3
72.4 82.7 第 2天vs 第 2天 85.0
74.4 第 3天vs 第 3天 85.0
74.4 第 4天vs 第 4天 81.7
70.5 第 5天vs 第 5天 78.3
66.7 中心1 vs 中心3 第 1天vs 第 1天 80.0
68.6 75.0
第 2天vs 第 2天 73.3
61.2 第 3天vs 第 3天 78.3
66.7 第 4天vs 第 4天 68.3
55.9 第 5天vs 第 5天 75.0 63.0
免疫组化抗体手册
免疫组织化学 抗体手册 目录 中间丝 细胞角蛋白 AE1/AE3 Cam5.2 MNF-116 34βE12 CK5/6 常见肿瘤中的特殊角蛋白 CK1 CK7 CK8 CK13 CK14 CK18 CK19 CK20
TTF-1，CK7和CK20的表达有助于诊断原发性肺腺癌还是转移性腺癌Vimentin（波形蛋白） Desmin（结蛋白） GFAP（胶质纤维酸性蛋白） Neurofilament proteins（神经细丝蛋白） Acid phosphatase（酸性磷酸酶） Actins（肌动蛋白） Muscle-specific actin（HHF35）肌肉特异性肌动蛋白（MSA）Smooth muscle actin（SMA）平滑肌肌动蛋白 α-actinin（α-肌动蛋白） NPM/ALK（间变性淋巴瘤激酶） AAT、AACT （α 1-抗胰蛋白酶、α 1－ 抗糜蛋白酶） AFP （甲胎蛋白） α-lactalbumin （α-乳清蛋白） Angiotensin-converting enzyme（血管紧张素-转换酶）Anti- Mullerian hormone（AMH），Mullerian-抑制因子Cyclin D1（PRAD-1，bcl-1,CCND1）细胞周期蛋白D1 bcl-2 Bcl-6
Ber-EP4 Ca15.3 B72.3 (BRST-3) BCA-225 CA125 CA19.9 CEA（CD66e）Cadherins Calcitonin h-Caldesmon S-100 Calponin Calretinin CD1 CD2 CD3 CD4 CD5 CD7
安捷伦_Agilent电源使用手册
Ａｇｉｌｅｎｔ电源使用手册69311B/D,69309B/D
一前面板显示栏说明的具体意义 CV 输出或输出处于固定电压模式 CC 输出1或输出2处于固定电流模式 Unr 输出或输出不能进行调整 Dis输出处于关闭状态按Output On/Off键使输出打开 OCP 过电流保护为打开状态按OCP键使过电流保护状态关闭Proc 由于保护功能起作用显示输出已经被禁止按Prot Clear键 来清除保护功能 Shift Shift键已被按下 Rmt 程序控制接口HP-IB,RS232处于工作状态按Local键使电源回到手动控制状态 Addr 读写接口的地址口 Err SCPI错误序列中出现一个错误按Error键来看错误代码 SRQ 接口需要维修 二前面板菜单的实际作用 前面板控制菜单图示 <1> System Keys 蓝色无标签的按键就是Shift键起到按键功能转换的作用例如 按shift键在显示栏上就显示Shift标示则按键上方标示的功能起 作用如Error再次按Shift键则回到按键功能
使电源从程序控制状态转换到手动控制状态如果电源已经处于LOCAL 状态则local 按键无效 ADDRESS
化工设备课程设计计算书(板式塔)
《化工设备设计基础》 课程设计计算说明书 学生姓名：学号： 所在学院： 专业： 设计题目： 指导教师： 2011年月日 目录 一.设计任务书 (2)
二.设计参数与结构简图 (4) 三.设备的总体设计及结构设计 (5) 四.强度计算 (7) 五.设计小结 (13) 六.参考文献 (14) 一、设计任务书 1、设计题目 根据《化工原理》课程设计工艺计算内容进行填料塔（或板式塔）设计。
设计题目： 各个同学按照自己的工艺参数确定自己的设计题目：填料塔（板式塔）DNXXX设计。 例：精馏塔（DN1800）设计 2、设计任务书 2.1设备的总体设计与结构设计 （1）根据《化工原理》课程设计，确定塔设备的型式(填料塔、板式塔)； （2）根据化工工艺计算，确定塔板数目(或填料高度)； （3）根据介质的不同，拟定管口方位； （4）结构设计，确定材料。 2.2设备的机械强度设计计算 （1）确定塔体、封头的强度计算。 （2）各种开孔接管结构的设计，开孔补强的验算。 （3）设备法兰的型式及尺寸选用；管法兰的选型。 （4）裙式支座的设计验算。 （5）水压试验应力校核。 2.3完成塔设备装配图 （1）完成塔设备的装配图设计，包括主视图、局部放大图、焊缝节点图、管口方位图等。 （2）编写技术要求、技术特性表、管口表、明细表和标题栏。 3、原始资料 3.1《化工原理》课程设计塔工艺计算数据。 3.2参考资料： [1] 董大勤.化工设备机械基础[M].北京：化学工业出版社，2003. [2] 全国化工设备技术中心站.《化工设备图样技术要求》2000版[S]． [3] GB150-1998.钢制压力容器[S]． [4] 郑晓梅.化工工程制图化工制图[M]．北京：化学工业出版社，2002. [5] JB/T4710-2005.钢制塔式容器[S]． 4、文献查阅要求
免疫组化方法(冰冻切片)
免疫组化方法（冰冻切片） A. 所需溶液和试剂 1.二甲苯 2.无水乙醇（100% 和95%，变性无水乙醇，组织学级） 3.苏木精（可选） 4.固定剂：请参考产品说明书选取合适的固定剂。 a.10%中性福尔马林 b.丙酮 c.甲醇 d.3%甲醛溶液：配制时，将18.75 ml 16%甲醛溶液加入到81.25 ml 1X PBS中。 5.10X Tris缓冲盐水（10X TBS）：在800 ml蒸馏水中加入24.2 g 三羟甲基氨基甲烷（Trizma base ，C4H11NO3）和80 g 氯化钠（NaCl）。用浓盐酸将pH调节到7.6。 6.漂洗（缓冲）液：1 X Tris缓冲盐水（TBS）。100 ml 10 X TBS加900 ml水至1L。 7.甲醇/过氧化氢：配制时，将10 ml 30% H202加入到90 ml甲醇中。保存在-20°C。 8.封闭液：1X TBS / 0.3% Triton-X 100 / 5%正常山羊血清。 9.配制时，将500 μl山羊血清和30 μl Triton-X 100加入到9.5 ml 1X TBS中。 10.检测系统：根据厂家说明书使用。已有的检测系统*。 11.DAB试剂或合适的底物：按产品说明配制。 B. 切片 1.对于保存在-80°C的样品：切片前先从冰箱中取出放在-20°C平衡15分钟左右。这可以避免切 片时样品断裂。 2.将样品切成大约6-8 μm厚，铺在带正电性的玻片上。 3.固定前，可以把切片摊开放在实验台上风干几分钟。（这有助于切片贴紧玻片） C. 固定 注意：参考产品说明书（抗体）选择合适的固定剂 1.玻片上的切片风干后，选用如下合适的固定剂进行固定。 a.10%中性福尔马林：室温10分钟。立即进行染色操作。 b.冰丙酮：-20°C 10分钟。风干。立即进行染色操作。 c.甲醇：-20°C 10分钟。立即进行染色操作。 d.3%甲醛溶液：室温15分钟。立即进行染色操作。
安捷伦 LCR表 Agilent 4263B 用户操作手册 中文
LCR Meter Aglient 4263B简明用户手册（中文） 1使用前准备 (2) 1.1使用范围 (2) 1.2设定供电电压（线电压） (2) 1.3设定线电压频率 (2) 2基本操作4263B (3) 2.1恢复默认设置 (3) 2.2连接测试夹具 (3) 2.3设定测试线长 (4) 2.4选择测试参数 (4) 2.5设定测试信号频率 (4) 2.6设定测试信号等级 (5) 2.7设定直流偏置源电压DC Bias (5) 2.8选择测量时间模式 (5) 2.9设定平均值比率 (6) 2.10选择测试量程 (6) 2.11选择触发方式 (7) 2.12设定触发延迟时间 (7) 2.13开路校正 (8) 2.14短路校正 (8) 2.15使用范围限定分拣功能 (8) 2.16使用连通确认功能，检测节点。 (9) 2.17使用精度偏差分拣功能 (9) 2.18选择显示模式 (10) 2.19使用等级监视功能 (11) 2.20选择蜂鸣模式 (11) 2.21设定打印机，打印测量数据 (12) 2.22连接被测试物体 (12) 2.23使用直流偏置 (12) 2.24触发测量 (12) 2.25查证当前设置 (12) 2.26问与答 (13) 2.27参考 (13) 2.28相关选用附件 (14) 2.29测量量程设定 (15) 3测量举例 (15)
1使用前准备 1.1使用范围 1.2设定供电电压设定供电电压（（线电压线电压）） 后面板电压档115V 或者230V 。 1.3设定线电压频率 按LINE 打开电源。完全启动后，依次按，
多次按选择，使闪烁，表示选中项，再按进入，会看到 用选择合适频率，（中国就是50HZ市电），确认，退出一步，再次确认退出设置。 以上设定只需一次，以后不需要再设定。 2基本操作4263B 2.1恢复默认设置 ， 使用选择Yes，确认。 2.2连接测试夹具 此操作很简单，旋入连上即可。
免疫组化操作方法原理步骤以及常见问题处理大总结
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结 1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。 2、免疫组化最大的优势是定位和定性。相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。尤其对于有些因子的转位研究十分有用。 3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。 4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。 5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。当然也不能做假阳性或假阴性结果。 6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。 7、实验方法需要动手+动脑。如今我还不敢说我在免疫组化什么都知道。我只所以今天敢在这里说这说那，这是因为我经过了反复的动手+动脑，把理论原理运用于实践，在把实践中发现的问题带到理论知识中去解决，最终把理论与实践融会贯通。 一、概念和常用方法介绍 1、定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较
AGILENT设备的使用说明及操作流程
AGILENT设备的使用说明及操作流程1.路测设备连接 图 1 路测设备连接图 2.前台软件 在运行Agilent E6474软件后，出现如图 2所示窗口。 图 2 Agilent E6474运行后界面图 首先，创建一个新工程，出现如图 3所示窗口。
图 3 工程窗口 其次，根据实际所连接设备型号及所在端口进行配置，最后得到如图 4所示窗口，选中Sagem OT96MGPRS Phone，点右键，选中Edit Label，可以对各个设备进行标注，以便区别，如图4所示，可以分为主叫和被叫。当然这个标注要跟实际设置相符，否则容易混淆。 图 4 系统设置窗口 接下来，选中Sagem OT96MGPRS Phone，点右键，选中Properties，出现如图 5所示窗口，可以根据实际要求进行设置。
图 5 Properties设置窗口 然后，选Tools菜单栏中的Option，选择基站数据库文件，以便在Route Map窗口实时显示。 在所有设置完后，保存，以便下次运行时可以读取。 最后，连接设备，开始路测数据采集。 在实际路测过程中，要密切关注实时数据，以及时发现问题。可以根据实际需要以及个人习惯打开相应窗口。一般可选View菜单中的GSM Lay3、GSM Neighboring Cells、GSM Signal、Route Map等。
3.后台软件 当完成了一次的路测任务后，将对此次的路测结果进行分析。目前，主要用的是Mapinfo。为了能够使用Mapinfo进行分析，必须将路测数据进行处理成.txt格式的文件。 根据实际要求，我们可以先制作一个关于DT测试的Plan，用于导出数据。 首先，选中Tools菜单栏中的Export Wizard，出现如图 6所示窗口。 图 6 Select Export Plan窗口 选中New export plan，点击下一步。设置成如图 7所示窗口。注意各参数顺序要跟窗口所示一样。 图 7 Select Columns for Export 窗口 接下来，将LAC和Cell ID列进行填充，以更方便进行今后的分析。具体如图 8、图 9所示。
免疫组化入门实验操作
免疫组化入门实验操作 一、实验目的： 1.了解免疫组化基本原理。 2.了解免疫组化实验操作及注意事项。 3.免疫组化结果判定。 通过实验，让学生熟悉免疫组化操作流程及注意事项，对抗原抗体结合、抗原修复和酶催化底物显色进行研究。要求学生通过查阅文献，在归纳、对比、总结的基础上对免疫组化有进一步的了解。 二、实验原理： 三、实验材料： 一抗：CD5、CK8、Ki67 二抗：MaxVision3 其它：柠檬酸抗原修复液、过氧化物酶阻断剂、PBS缓冲液、DAB、孵育盒、染色架、苏木素、盖玻片、冲洗瓶、中性树胶，孵育盒。 四、实验步骤：
1.脱蜡水化 二甲苯5min，二甲苯5min，二甲苯5min，无水乙醇2min，无水乙醇2min，95%酒精2min，85%酒精2min，自来水冲洗。 2.抗原修复 高压锅中加入1200mL柠檬酸修复液，电磁炉煮沸后放入切片，扣紧锅盖，功率调至800W，至压力阀均匀喷气后计时 1.5min，移开高压锅室温冷却10min，自来水冷却。 3.过氧化物酶阻断 修复结束后，流水冲洗干净，除去自来水，在离组织3mm处用免疫组化油笔画圈或用纸巾擦干组织外残留的液体，滴加50 μL（一滴）过氧化物酶阻断剂，室温孵育10min，PBS冲洗3×3min。 4.一抗 甩去PBS，纸巾擦干组织3mm外的残留液体，每张切片加50 μL（一滴）相应一抗，室温下孵育60分钟，PBS冲洗3×3min。 5.二抗 甩去PBS，纸巾擦干组织3mm外的残留液体，每张切片加50 μL（一滴）MaxVisionTM试剂，室温下孵育30分钟，PBS冲洗3×3min。 6.DAB 甩去PBS液，纸巾擦干组织3mm外的残留液体，每张切片加50 μL（一滴）新鲜配制的DAB，显色5分钟，自来水冲洗。 7.苏木素复染 每张切片滴加50 μL（一滴）苏木素，20-30秒后自来水冲洗30s以上，或浸泡于PBS中30s以上再自来水冲洗。 8.封片 梯度酒精脱水干燥（85%酒精2min，95%酒精2min，无水乙醇2min，无水乙醇2min，二甲苯1min），或直接电吹风吹干，中性树胶封固。
塔设备设计说明书精选文档
塔设备设计说明书精选 文档 TTMS system office room 【TTMS16H-TTMS2A-TTMS8Q8-
《化工设备机械基础》 塔设备设计 课程设计说明书 学院：木工学院 班级：林产化工0 8 学号： 035 036 姓名：万永燕郑舒元 分组：第四组
目录
前言 摘要 塔设备是化工、石油等工业中广泛使用的重要生产设备。塔设备的基本功能在于提供气、液两相以充分接触的机会，使质、热两种传递过程能够迅速有效地进行；还要能使接触之后的气、液两相及时分开，互不夹带。因此，蒸馏和吸收操作可在同样的设备中进行。根据塔内气液接触部件的结构型式，塔设备可分为板式塔与填料塔两大类。板式塔内沿塔高装有若干层塔板(或称塔盘)，液体靠重力作用由顶部逐板流向塔底，并在各块板面上形成流动的液层；气体则靠压强差推动，由塔底向上依次穿过各塔板上的液层而流向塔顶。气、液两相在塔内进行逐级接触，两相的组成沿塔高呈阶梯式变化。填料塔内装有各种形式的固体填充物，即填料。液相由塔顶喷淋装置分布于填料层上，靠重力作用沿填料表面流下；气相则在压强差推动下穿过填料的间隙，由塔的一端流向另一端。气、液在填料的润湿表面上进行接触，其组成沿塔高连续地变化。目前在工业生产中，当处理量大时多采用板式塔，而当处理量较小时多采用填料塔。蒸馏操作的规模往往较大，所需塔径常达一米以上，故采用板式塔较多；吸收操作的规模一般较小，故采用填料塔较多。 板式塔为逐级接触式气液传质设备。在一个圆筒形的壳体内装有若干层按一定间距放置的水平塔板，塔板上开有很多筛孔，每层塔板靠塔壁处设有降液管。气液两相在塔板内进行逐级接触，两相的组成沿塔高呈阶梯式变化。板式塔的空塔气速很高，因而生产能力较大，塔板效率稳定，造价低，检修、清理方便
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总 结 1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。 2、免疫组化最大的优势是定位和定性。相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。尤其对于有些因子的转位研究十分有用。 3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。 4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS 或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。
5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。当然也不能做假阳性或假阴性结果。 6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。 7、实验方法需要动手+动脑。如今我还不敢说我在免疫组化什么都知道。我只所以今天敢在这里说这说那，这是因为我经过了反复的动手+动脑，把理论原理运用于实践，在把实践中发现的问题带到理论知识中去解决，最终把理论与实践融会贯通。 一、概念和常用方法介绍 1、定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等
免疫组化实验步骤
免疫组化实验步骤 Revised final draft November 26, 2020
石蜡切片免疫组化实验步骤 石蜡切片步骤按照晓峰整理的步骤进行（From徐晓峰、朱老师的“石蜡切片”方案）： 1）材料的准备 在本实验室条件下推荐使用FAA（50%ethanol,5%aceticacid,3.7%甲醛）固定材料。 FAA固定液（100ml），室温保存： 无水乙醇50ml 冰醋酸5ml 37%甲醛10ml 水35ml 第一天：组织固定 用FAA固定，详见“石蜡切片”protocol。 第二天：脱水 以上所有步骤中每换好一步乙醇均置于4℃冰箱等待，并不时轻摇。 *组织可在70%ethanol4℃可存放几个月 第三天：进一步脱水和浸蜡 以下所有步骤在4℃进行并不时轻摇
以下所有步骤在室温进行并不时轻摇 准备工作：60℃预热plus蜡片（ParaplastPlus）石蜡可反复融凝而去气泡 第四天：浸蜡2 将材料置于42℃直至蜡块完全熔化。再加1/4体积的蜡块至完全熔化后移至60℃。几个小时后换上新鲜熔好的蜡液，过夜。 第五天：浸蜡3 换蜡两次（ParaplastPlus） 第六天：浸蜡4 换蜡两次（ParaplastPlus） 第七天：浸蜡5 换蜡两次（ParaplastPlus） 准备工作：60℃预热Regular蜡片（ParaplastRegular）
第八天：包埋（包埋块可长久保存） 第九天及之后： 开始切片，切片应包括自己的片子及正负对照等。事先打开烘片机至37度，在涂有多聚赖氨酸的玻片上加1~2ml的蒸馏水。切好的片子轻至于加水的玻片上。待所有片子准备完之后盖上盖子，烘片过夜。 用自来水及双蒸水清洗免疫组化专用塑料，放在烘箱烘干待用。 第二天：开始脱蜡（From徐晓峰、朱老师整理的“石蜡切片”protocol） （用新买来的免疫组化塑料小盒，每一步只需加入试剂220~250毫升） 抗原修复： 在切片还浸入酒精时，可以事先将煮锅清洗干净，用蒸馏水洗1~2遍，最后加入0.01M柠檬酸钠缓冲液(PH=6.0)，煮沸(保持在95度左右)，将过完PBS的片子让入煮沸的锅中，煮片10~15min。然后将电磁炉关闭，自然冷却锅中切片（千万不要把片子拿出来，放在缓冲液中一起自然冷却至室温！！！） 将片子浸入PBS（PH=7.4）5min。
塔设备设计说明书
《化工设备机械基础》 塔设备设计 课程设计说明书 学院：木工学院 班级：林产化工0 8 学号： 姓名：万永燕郑舒元 分组：第四组 目录 前言............................................................... 错误！未定义书签。 摘要 (2) 关键字 (2) 第二章设计参数及要求 (2) 1.1符号说明 (2) 1.2.设计参数及要求 (3) 3 3 第二章材料选择 (4) 2.1概论 (4) 2.2塔体材料选择 (4) 2.3 裙座材料的选择 (4) 第三章塔体的结构设计及计算 (5) 3.1 按计算压力计算塔体和封头厚度 (5) 3.2 塔设备质量载荷计算 (5) 3.3 风载荷和风弯矩 (6) 3.4 地震弯矩计算 (7) 3.5 各种载荷引起的轴向应力 (7) 3.6 塔体和裙座危险截面的强度与稳定校核 (8) 3.7 塔体水压试验和吊装时的应力校核 (9) 3.7.1 水压试验时各种载荷引起的应力 (9) 9 3.8塔设备结构上的设计 (10) 10 10 板式塔的总体结构 (11) 小结 (11) 附录 (11) 附录一有关部件的质量 (11)
附录二矩形力矩计算表 (12) 附录三螺纹小径与公称直径对照表 (12) 参考文献 (12) 前言 摘要 塔设备是化工、石油等工业中广泛使用的重要生产设备。塔设备的基本功能在于提供气、液两相以充分接触的机会，使质、热两种传递过程能够迅速有效地进行；还要能使接触之后的气、液两相及时分开，互不夹带。因此，蒸馏和吸收操作可在同样的设备中进行。根据塔内气液接触部件的结构型式，塔设备可分为板式塔与填料塔两大类。板式塔内沿塔高装有若干层塔板(或称塔盘)，液体靠重力作用由顶部逐板流向塔底，并在各块板面上形成流动的液层；气体则靠压强差推动，由塔底向上依次穿过各塔板上的液层而流向塔顶。气、液两相在塔内进行逐级接触，两相的组成沿塔高呈阶梯式变化。填料塔内装有各种形式的固体填充物，即填料。液相由塔顶喷淋装置分布于填料层上，靠重力作用沿填料表面流下；气相则在压强差推动下穿过填料的间隙，由塔的一端流向另一端。气、液在填料的润湿表面上进行接触，其组成沿塔高连续地变化。目前在工业生产中，当处理量大时多采用板式塔，而当处理量较小时多采用填料塔。蒸馏操作的规模往往较大，所需塔径常达一米以上，故采用板式塔较多；吸收操作的规模一般较小，故采用填料塔较多。 板式塔为逐级接触式气液传质设备。在一个圆筒形的壳体内装有若干层按一定间距放置的水平塔板，塔板上开有很多筛孔，每层塔板靠塔壁处设有降液管。气液两相在塔板内进行逐级接触，两相的组成沿塔高呈阶梯式变化。板式塔的空塔气速很高，因而生产能力较大，塔板效率稳定，造价低，检修、清理方便 关键字 塔体、封头、裙座、。 第二章设计参数及要求 1.1符号说明 Pc ----- 计算压力，MPa； Di ----- 圆筒或球壳内径，mm； [Pw]-----圆筒或球壳的最大允许工作压力，MPa； δ ----- 圆筒或球壳的计算厚度，mm； δn ----- 圆筒或球壳的名义厚度，mm； δe ----- 圆筒或球壳的有效厚度，mm；
免疫组化超详细步骤
免疫组化超详细步骤 Prepared on 22 November 2020
免疫组化 一实验目的：分别用KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体检测肺癌组织中KRAS、NRAS、HRAS蛋白的表达情况 二实验原理:应用基本原理——抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使的（、酶、、）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和），对其进行定位、定性及定量的研究，称为或. 三实验试剂及耗材:经病理医生确认的肺癌组织切片、KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体、DAB显色试剂盒、抗原修复液、PBS、苏木素染料、1%盐酸酒精溶液、%氨水、二甲苯、等 四实验设备：切片机、4℃冰箱、显微镜、烤片机 五主要试剂配置: 缓冲液 应用液配成1000毫升溶液 应用液BNa2HPO4·配成1000毫升溶液 配制1000毫升PBS需要14毫升应用A液，36毫升应用B液，加。 枸橼酸钠抗原修复液 应用液A枸橼酸配成1000毫升溶液 应用液B柠檬酸三钠（三水合柠檬酸三钠）配成1000毫升溶液 配制500毫升抗原修复液需要9毫升应用A液，41毫升应用B液。 苏木素染液配方：苏木素2g,无水乙醇250毫升，硫酸铝蒸馏水750毫升，碘酸钠，冰醋酸20毫升。先将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝溶于蒸馏水水中。两液溶解后将其混合，加入碘酸钠，最后加入冰醋酸。 抗体说明书建议的抗体稀释度 N-Ras1:50-1:500 H-Ras1:50-1:500 K-Ras1:20-1:200 六实验步骤： 1组织常规石蜡切片厚度3-5um，防脱片捞片后晾干，放入72℃烤箱烤片2小时。 2切片脱蜡水化程序 ⑴二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各12分钟； ⑵无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各3分钟；（洗二甲苯） ⑶95%乙醇3分钟； ⑷85%乙醇3分钟； 3自来水漂洗3分钟，洗涤一定要充分。 4组织修复采用高温高压法：压力锅中加入，抗原修复液约1000ml，切片插入塑料架上，放入压力锅，盖上锅盖（此时不扣上压力阀）1600W预热至沸腾，扣上压力阀1300W，待高压锅阀门喷气开始计时，修复时间为2分钟。 5停止加热并用流水冲洗高压锅以降温，室温冷却。 6将抗原修复后切片置自来水中，浸泡2分钟。将样本置于内源性过氧化物酶阻断剂 3%H2O2，室温放置4分钟。（需要盖盖子）自来水洗2分钟，PBS缓冲液洗涤2分钟。
安捷伦仪器使用说明书中文
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《分子实验》06 免疫组化实验
免疫组化操作步骤 （一）、仪器设备 1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉. 2. 水浴锅 （二）、试剂 1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl 2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L. 2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226;2H2O,用 10mmol/L NaOH调至ph8.0,加水至1000ml. 4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至ph8.0, 加水1000ml。 5. 酶消化液：a. 0.1%胰蛋白酶：用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。 6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制 7.风裱剂：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（ph9.0–9.5）等量混合b 油和TBS(PBS)配制 8．TBS/PBS PH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本 （三）、操作流程 1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。 a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟
b 无水乙醇中浸泡五分钟 c 95%乙醇中浸泡五分钟 d 75%乙醇中浸泡五分钟 2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片： A 抗原热修复 a 高压热修复在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。 b 沸热修复电炉或水浴锅加热0.01枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10-15分钟。 c 微波炉加热在微波炉里加热0.01枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。适用的抗原Bcl-2. Bax. AR. PR. C-fos. x-jum. z-kit. c-myc. E-cadherin. ChromograninA. Cyclin. ER. Heatshock. Protein. HPV.Ki-67.MDMZ.P53.P34.P15.P-glycoprotein.PKC.PCNA.ras.Rb.等 B 酶消化方法常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热37℃，消化时间约为5-30分钟。适用于被固定遮蔽的抗原：包括Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.C-erB-2.LCA.LN.等 3、免疫组化染色SP法 （1）脱蜡、水化 （2）PBS洗2-3次各5分钟 （3）3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上，室温静置10分钟
免疫组化操作步骤
免疫组化操作步骤 This manuscript was revised by the office on December 10, 2020.
免疫组化操作流程试剂准备 1. PBS缓冲液（pH7.2～7.4）： NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。 2. 0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。即抗原修复液 3.PBST: PBS+吐温-20（1000:1）洗液可全部运用PBST 4. 3% 甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。 5. 封片剂：中性树脂+二甲苯。 操作流程 免疫组织化学染色 SP法： 1. 脱蜡、水化： 脱蜡前，应将切片在60℃恒温箱中烘烤60~120分钟，观察石蜡应溶解。 从烤箱拿出切片后尽快置于二甲苯中浸泡30分钟，更换二甲苯后再浸泡30分钟； 无水乙醇中浸泡3分钟； 95%乙醇中浸泡3分钟； 70%乙醇中浸泡3分钟（我用80%）； 50%乙醇中浸泡3分钟； 自来水中浸泡3分钟；
梯度脱蜡 2. 抗原修复：（用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片） 高压热修复高压锅里放少许水，用一量杯或容器（大小能容纳玻片架为宜）装抗原修复液放入高压锅里一起煮沸，再放入玻片架，盖上不锈钢高压锅的盖子，将排气阀门套上，待听到阀门冒气时，即可倒计时2min，之后将玻片杯一起放入凉水中，静置15min，平衡至室温。电磁炉1000W 2min。 3.丢弃抗原修复液，将玻片浸泡在去离子水中（时间不限）可省略 4.用组织笔沿组织边缘画线（可与组织边缘留适当间隙），画完立即放入PBST溶液中浸泡3遍X3min（三个容器，每个容器3min，时间不限制）。 5. 3%H2O2滴加在切片上，室温静置15分钟(3%的H2O2用30%的 H2O2加双蒸水稀释10倍，现配现用。目的为阻断内源性过氧化物酶)； 6. PBST洗3次各3分钟(过三缸) 7. 滴加正常山羊血清封闭液,室温30分钟。用与一抗不同源的血清即可，本人用Western-blotting的含胎牛血清封闭液。 8. 甩去封闭液（注：不要冲洗），滴加一抗50ul（至少50ul否则易干片），4℃孵育过夜。4℃过夜后需在37℃复温45分钟（未验证：室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。）。 9. PBST洗3次各3分钟；
免疫组化实验
免疫组化实验 实验原理：应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使酶标记的抗体与显色剂进行显色反应，生成有色的不溶性产物，来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量。 实验目的：通过染色结果强弱，对所研究蛋白在组织水平的表达进行判断比较。（干净的背景会使结果判断的更加准确）。 在实验室实验时遇到的难题：染色强度不够，背景较深，染色对比不够明显。 实验效果不好的可能原因：一抗效果不够好，脱蜡水化后有机溶剂冲洗的不够干净，抗原修复的程度不够，二抗效果不够好，DAB染色时间过久。 修改后的protocol： 1.烘片：IHC白片，60度或70度烘箱，烘片40min。 2.脱蜡：二甲苯分别浸泡两次，10min/次。（脱蜡时间可以适当延长，不需严格遵守10min 时间，脱蜡脱得越干净越好） 3.水化：依次放入100%酒精，95%酒精，80%酒精，各2min。 4.自来水冲洗：水化后在自来水流水下冲洗。（水流不能太急，务必将有机溶剂完全冲洗 干净，否则会影响后续实验效果） 5.抗原修复：将片子浸没在抗原修复液中，高压锅20min，高温修复。 **实验室中可用小电饭锅或者微波炉替代，若在微波炉中操作，要保证液体在咕噜噜冒泡煮沸状态下煮20min，不然可能抗原修复力度不够。 **关于抗原修复液的选择：选用酸性柠檬酸缓冲液或碱性EDTA，最好根据抗体购买时说明书上推荐使用的缓冲液。 6.冷却：浸泡在修复液中冷却，时间充裕可放在室温下慢慢冷却；也可直接在室温冷却 10min后，用自来水流水冲洗冷却，但不可直接在自来水下冲洗冷却。 7.封闭：3% H2O2中浸泡10min，去除内源性的过氧化氢酶。 8.冲洗：清水冲洗，PBST清洗两次，摇床上3min/次。（摇床可以清洗的更干净） 9.封闭：封闭液（3% FBS或3% BSA或10%山羊血清）室温下封闭1h。 10.冲洗：PBST清洗三次，摇床上3min/次。 11.抗体孵育：一抗，按照稀释比稀释，37度烘箱湿盒中孵育1h（最好不要超过1h，不 然背景会很强），PBST摇床清洗3次，3min/次。二抗，按照稀释比稀释，37度烘箱湿盒中孵育30min。PBST摇床清洗3次，3min/次。 （如果可以，买抗体稀释液，成分更稳定） 12.显色：1XDAB显色，仔细观察，棕色显现后立马用自来水终止反应。（若第一次显色强 度不够，可以再次显色） 13.苏木精复染：苏木精染色1min，自来水冲洗，显微镜下观察，若不够可重复苏木精染 色。（苏木精没染好可以将苏木精洗去，再染，清洗配方没记得，后续再补充） 14.脱水：依次放入80%酒精，95%酒精，100%酒精，各2min。 15.封片：60度烘箱中烘干片子，中性树脂封片，完全晾干后，显微镜下观察，拍照。 注意点： ?本实验室所用切片一般是石蜡切片。
板式塔设计计算说明书
一、设计任务 1. 结构设计任务 完成各板式塔的总体结构设计，绘图工作量折合A1图共计4张左右，具体包括以下内容： ⑴各塔总图1张A0或A0加长； ⑵各塔塔盘装配及零部件图2张A1。 2. 设计计算内容 完成各板式塔设计计算说明书，主要包括各塔主要受压元件的壁厚计算及相应的强度校核、稳定性校核等内容。 二、设计条件 1. 塔体内径mm 2000=i D ，塔高m 299.59H i =； 2.设计压力p c =2.36MPa ，设计温度为=t 90C ?； 3. 设置地区：山东省东营市，基本风压值q 0=480Pa ，地震设防烈度8度，场地土类别III 类，地面粗糙度是B 类； 4. 塔内装有N=94层浮阀塔盘；开有人孔12个，在人孔处安装半圆形平台12个，平台宽度B=900m m ，高度为1200m m ； 5. 塔外保温层厚度为δs =100m m ，保温层密度ρ2=3503m /kg ； 三、设备强度及稳定性校核计算 1. 选材说明 已知东营的基本风压值q 0=480Pa ，地震设防烈度8度，场地土类别III 类；塔壳与裙座对接；塔内装有N=94层浮阀塔盘；塔外保温层厚度为δs =100m m ，保温层密度ρ 2=350 3m /kg ；塔体开有人孔12个，在人孔处安装半圆形平台12个，平台宽度B=900m m ， 高度为1200m m ；设计压力 p c =2.36MPa ，设计温度为=t 90C ?；壳 3m m ，裙座厚度附加量2m m ；焊接接头系数取为0.85；塔内径mm 2000=i D 。 通过上述工艺条件和经验，塔壳和封头材料选用Q345R 。对该塔进行强度和稳定计算。 2. 主要受压元件壁厚计算