免疫组化超详细步骤
超详细的免疫组化步骤
超详细的免疫组化步骤免疫组化步骤操作步骤取出细胞-------PBS冲洗3次，每次5分钟-------用预冷的丙酮或甲醇溶液固定10分钟----PBS 冲洗3次，每次5分钟-----每张爬片加50ul非免疫性动物血清（封闭液）室温下10分钟---甩掉封闭液-----加一抗50ul，37℃培养箱孵育60分钟，或4℃过夜--------PBS冲洗3次，每次5分钟----每张爬片加二抗50ul,37℃或室温30--60分钟---PBS冲洗3次，每次5分钟----显色，酶标二抗加酶的底物（如DBA）染色，显微镜下观察3--10分钟，控制染色情况---自来水冲洗，苏木素复染，中性胶固定-------金标记或荧光标记在显微镜下直接观察。
结果判读：根据阳性对照和阴性对照，判断免疫染色是否成功。
阳性细胞定位是否明确，是胞膜，胞浆还是胞核阳性，间质是否清晰，无背景着色，同时阳性细胞达5%以上，方为阳性。
注意：浓缩型抗体应根据厂家提供的抗体效价，进行分装，按50ul或100ul分装，放入-20---70℃冰箱保存1--5年。
用PBS稀释抗体在4℃可放1--3天。
使用时必须按不同免疫染色方法找出抗体最佳稀释度。
即用型抗体可直接使用，无需稀释阴性对照可以使用PBS或10%的正常非免疫动物血清。
（用PBS 或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致，排除有无一抗外的非特异性染色。
）阳性对照可使用自己收集或购买的阳性切片。
假阳性：抗体的稀释度不正确，浓度太高；部分多克隆抗体的特异性问题。
假阴性：抗体和检测试剂盒配对不合理。
如单克隆抗体（多为鼠）试剂盒应为鼠用试剂盒；多克隆抗体（多为兔）试剂盒应为兔用试剂盒。
抗体浓度太低；孵育时间太短(SP法一抗孵育时间为1小时，二抗，三抗为10分钟；PAP 法或ABC法一抗为1小时或过夜，二抗，三抗为30分钟)；染色步骤错误；染色过程爬片过分干燥。
封闭液：封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。
免疫组化实验的详细步骤
免疫组化实验的详细步骤1. 制备组织切片- 将组织固定在适当的固定液中(如甲醛溶液)- 通过脱水、清理和浸蜡等步骤制备石蜡包埋块- 使用切片机将包埋块切成4-6微米厚的切片- 将切片贴附到载玻片上2. 脱蜡和水化- 将载玻片浸入二甲苯或者相似的溶液中,去除石蜡- 使用梯度浓度的乙醇溶液(100%,95%,70%)逐步水化切片3. 抗原修复- 抗原修复是一个关键步骤,可以暴露被固定过程掩盖的抗原表位 - 常用的方法包括加热诱导抗原修复和酶促抗原修复4. 内源性过氧化物酶或者生物素的封闭- 使用3%的过氧化氢溶液处理切片,以封闭内源性过氧化物酶活性 - 对于利用生物素-亲和素系统的实验,需要使用生物素封闭试剂进行封闭5. 加入封闭液- 使用含有蛋白质成分的封闭液(如牛血清白蛋白)处理切片- 这一步可以阻止抗体的非特异性结合6. 加入一抗- 将特异性的一抗(如小鼠抗人蛋白单克隆抗体)稀释至适当浓度- 滴加到切片上,在湿盒中于4℃过夜或37℃温育1-2小时7. 加入二抗- 洗去未结合的一抗- 加入与一抗种属相匹配的二抗(如生物素标记的羊抗小鼠抗体)8. 加入探针- 对于酶促反应型免疫组化,加入酶标记的亲和素(如过氧化物酶-亲和素复合物)- 对于荧光免疫组化,加入荧光标记的亲和素9. 显色- 酶促反应型:加入适当的染色底物(如),产生可见的棕黄色沉淀- 荧光免疫组化:不需要此步骤10. 染色和封片- 用苏木素对细胞核进行复染- 用封片剂和覆盖玻片封闭切片,制成永久装片11. 观察结果- 使用光学显微镜或荧光显微镜观察目的蛋白的分布和表达情况以上是免疫组化实验的一般步骤,具体操作细节可能因实验目的和具体方法而有所调整。
准确无误的实验步骤需要参考相关文献和说明。
免疫组化详细步骤
免疫组化步骤取组织、固定、制片（脱水、透明、浸蜡、包埋）、切片、烤片、抗原修复、滴加抗体一、取组织二、固定三、制片1、脱水透明的酒精梯度和时间70%酒精20min 80%酒精1h90%酒精1h 95%酒精Ⅰ2h95%酒精Ⅱ2h 无水乙醇Ⅰ15min无水乙醇Ⅱ15min 无水乙醇Ⅲ15min二甲苯酒精1:1 15min 二甲苯Ⅰ25min二甲苯Ⅱ25min 二甲苯Ⅲ15min2、浸蜡：石蜡融化后，在石蜡Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各浸蜡1h3、包埋四、切片烤片用切片机切片，取完整组织切片放于37℃温水中展片，取完整组织于载玻片上，并放入到60℃的烤箱中烤6个小时五、脱蜡至水六、抗原修复配置柠檬酸抗原修复液于微波中煮沸，在高压锅内放入自来水煮沸（不盖锅盖），将装有煮沸的抗原修复液的烧杯置于高压锅内，将水化后的玻片放入煮沸的抗原修复液中，盖上锅盖，待其压力达到最大时维持三分钟七、取出玻片，水浴逐渐降温直至完全冷却八、将玻片放置于塑料板上，滴加3%的过氧化氢室温孵育10min，以阻断内源性过氧化氢酶，10min过后PBS冲洗2次×3分钟九、除去PBS（甩干或者吸水纸吸干），每张切片滴加第一抗体（稀释相应倍数），4℃过夜十、PBS冲洗3次×2分钟，除去PBS液，每张切片滴加聚合物增强剂，室温孵育10min十一、PBS冲洗2分钟×3次，除去PBS，每张切片滴加酶标抗兔聚合物，室温孵育10min十二、PBS冲洗2分钟×3次，除去PBS，每张切片滴加新配制的DAB（二氨基联苯胺），室温孵育2~10分钟，显微镜观察十三、苏木精复染：苏木精复染5min，水洗3min，0.1%HCl浸提两次，水洗3min，反蓝液数秒，水洗十四、脱水透明：70%酒精3min、80%酒精3min、90%酒精3min、无水乙醇3min、二甲苯Ⅰ3min、二甲苯Ⅱ3min十五、封片。
免疫组化步骤
取组织：1.心脏灌注将小鼠在肋弓下缘剪开，夹住胸骨角，向上翻开，暴露胸腹膜，从右向左剪开胸腹膜，暴露心脏，剪开右心耳（在心尖靠右一点）插入针管，先打入10ml水，再注入10%甲醛约10ml，（可重复一次），至肝脏发白，四肢有抽搐为成功。
2.取脑取脑后放入4%多聚甲醛中，固定保存24h3.梯度脱水(不是必须步骤，但做的效果可能更好，但标本脱片是否与之有关系？)将脑放入5%蔗糖 48h----2.5%蔗糖 48h----1%蔗糖48h后放入4%多聚甲醛中，固定保存，制成切片。
4. 自制蜡块三步法，sp试剂盒，需要摸浓度，还有PBS自己配免疫组化1.常规石蜡切片，石蜡脱水60℃烤片30min脱蜡：二甲苯Ⅰ 5min二甲苯Ⅱ 10min无水乙醇—95%酒精Ⅰ—95%酒精Ⅱ—80%酒精各5sPBS液洗3次，每次5min2.抗原修复①枸橼酸盐微波修复（冷却与小火之间） 13min 室温冷却至常温②枸橼酸盐微波修复（冷却与小火之间） 2 x 10min（10min后加少许冷枸橼酸）室温冷却至常温（此步作为①未作出时的办法，最大可以尝试到3x 10min）③枸橼酸盐微波修复（高火） 4 x 6min 室温冷却至常温（此步作为①②均未作出时的办法）3. 3%H2O2 10min（买30%的回来自己稀释）PBS液洗3次，每次3min4.封闭用正常山羊血清工作液室温孵育20min5.一抗 4℃过夜，第二天将过夜片放入37℃温箱孵育1hPBS液洗3次，每次3min6.生物素化二抗工作液37℃温箱孵育 30minPBS液洗3次，每次3min7.辣根酶标记链霉卵白素工作液37℃温箱孵育 30minPBS液洗3次，每次3min8.DAB显色（此步最重要，一定要摸出最佳显色时间，要浪费三张片子，一张显过了，一张未显出来，一张介于二者之间）9.自来水终止显色10.苏木素染色2min，自来水冲洗（8次以上，不能怕麻烦），盐酸酒精分化，自来水冲洗（6次以上），PBS返蓝20min（PBS要预热15min）11.脱水，透明（80%酒精—95%酒精Ⅱ—95%酒精Ⅰ—无水乙醇—二甲苯Ⅱ—二甲苯Ⅰ各5秒，就是将脱蜡反过来了）12.树胶封片（就滴很少，用手按压可以顺便将气泡压出，滴多了，树胶容易翻上盖玻片，那就麻烦了）注：95%酒精Ⅱ95%酒精Ⅰ二甲苯Ⅱ二甲苯Ⅰ都有卖的PBS自己配很划算（下页是配制方法）A液：0.1mol/L磷酸二氢钾：磷酸二氢钾（KH2PO4，MW136.09）1.361g，加双蒸水至100ml。
免疫组化实验步骤完整版
免疫组化实验步骤完整版步骤1：标本采集和固定首先，需要从待检测样本中采集组织或细胞。
可以使用手术切片、活体组织、培养的细胞等作为标本。
然后，将采集的样本固定在载玻片或切片上，以保持其结构和形态的完整性。
步骤2：抗原暴露和体细胞抗原消除接下来，需要处理标本以使抗原裸露出来，并消除非特异性的抗体结合和细胞膜结合的抗原。
这一步骤常常涉及对组织或细胞的预处理，例如用石蜡脱脂、酶解抗体和孵化等。
步骤3：抗体特异性结合选择特异性的抗体用于检测待测蛋白质。
这些抗体可以是直接标记的一抗，或间接标记的二抗。
一抗是专门与目标抗原结合的抗体，而二抗则可以与一抗结合，以提高信号的灵敏度和特异性。
这一步骤中还需要选择适当的阴性对照，即未携带待检测抗原的样本。
步骤4：探针检测根据需要，可以使用不同的探针来检测目标分子。
常用的探针有标记的一抗、荧光探针、放射性标记物等。
标记的一抗可以直接结合抗原，然后使用染色剂进行可视化；荧光探针则通过荧光显微镜进行检测；放射性标记物可以通过放射自显影等方法进行检测。
步骤5：显色和对比计数将荧光、酶标记或放射性标记的物质显色，以便于检测和计数。
在染色的过程中，需要防止非特异性的染色，例如使用阻断剂、胶原等。
步骤6：结果分析根据观察到的染色强度、分布模式等结果，分析待测蛋白质在样本中的表达情况。
这可能需要与阴性对照和阳性对照进行比较，以确定实验结果的可靠性。
步骤7：图像捕获和分析使用显微镜或其他成像设备，将荧光、染色或放射性标记的图像捕获下来。
可以使用图像分析软件来计算和比较样本中的染色强度、面积等参数。
步骤8：数据统计和结果报告根据实验结果进行数据统计和分析，并将结果记录在报告中。
报告应包括样本信息、实验方法、结果和结论等内容，并根据需要进行解释和讨论。
总结：免疫组化实验是一种广泛应用于研究、诊断和治疗的方法。
它的步骤包括标本采集和固定、抗原暴露和体细胞抗原消除、抗体特异性结合、探针检测、显色和对比计数、结果分析、图像捕获和分析、数据统计和结果报告。
免疫组化超详细步骤
免疫组化超详细步骤免疫组化（immunohistochemistry，IHC）是一种通过使用抗体来检测组织或细胞中特定蛋白质的方法。
该技术的原理基于抗体与其特异性抗原结合的特性。
下面将详细介绍免疫组化的步骤。
第一步，固定组织：将待检测的组织或细胞固定在载玻片上。
常用的固定剂包括甲醛和乙醛，可通过浸泡、喷洒或滴加等方式施加在组织上，使细胞和蛋白质保持其形态和结构。
第二步，脱水：将固定的组织经过一系列浓度逐渐升高的酒精溶剂中处理，以去除水分，使组织逐渐与酒精混合。
第三步，脱脂：将组织在适当的溶剂（如二甲苯或苯）中脱脂，以去除酒精和脂质。
第四步，石蜡浸渍：将脱脂的组织浸泡在液态石蜡中，使其渗透并替代脱脂剂和二甲苯，然后固化组织。
第五步，切片：使用微tome切割固化的样本，制备出薄片，常见的切片厚度为4-5μm。
第六步，脱离：将切好的薄片与载玻片分离，常用的方法是利用热水浸泡薄片，使其松散分离。
第七步，抗原修复：利用高温和压力的方法，如蒸汽煮沸或压力锅，对薄片上的蛋白质进行解散，以恢复其免疫活性。
第八步，阻断非特异性结合：使用一些蛋白质如牛血清蛋白、动物血清或其他蛋白质来包裹薄片上的非特异性结合位点，以减少假阳性反应。
第九步，抗体处理：将特异性抗体加到薄片上，与待检测的蛋白质结合。
抗体可以是原代抗体（直接与靶蛋白质结合）或二抗（与原代抗体结合）。
第十步，洗涤：用缓冲液洗去未结合的抗体，并去除阻断剂和非特异性结合物。
第十一步，检测：将检测试剂滴加到薄片上，以产生特定色素或荧光信号。
常用的检测方法包括酶标法（如辣根过氧化物酶法，HRP法）和荧光标记（如荧光素酶法，AP法）。
第十二步，显微镜检查：使用显微镜观察薄片上的染色结果，评估标记物的定位和表达情况。
通过上述步骤，免疫组化技术可以帮助研究人员检测并定位组织或细胞中感兴趣的蛋白质。
其广泛应用于生物医学研究、临床诊断以及药物研发等领域，为揭示疾病的分子机制和开发新的治疗手段提供了重要的工具。
免疫组化法实验操作步骤
免疫组化法实验操作步骤步骤一：取材固定1.将需要处理的组织或细胞样本，如切片或离心沉淀等，放置在含有适当浓度的固定试剂（如4%的中性缓冲甲醛）中，使其固定。
2.这一步的目的是保持蛋白质的结构和形态，使其对后续步骤的抗体反应更加稳定。
步骤二：脱水和包埋1.将样本从固定试剂中洗涤，并逐渐转移到乙醇溶液中，以脱水。
2.将样本转移到适当浓度的透明剂（如甲基丙烯酸甲酯）中，使其透明化。
3.最后，将样本包埋在合适的固化剂（如尼龙、蜡、树脂等）中，以便后续的切片操作。
步骤三：切片和烘干1.使用组织切片机将样本以适当的厚度切成切片。
2.将切片放置在加热平台上，烘干以去除切片中的水分。
步骤四：抗体处理1.使用适当的抗体稀释液将抗体与切片接触。
抗体可为一抗或二抗，具体选择取决于实验需求。
2.将切片放置在含有抗体的湿润孵育盒中，使其与抗体反应。
孵育温度和时间取决于抗体的要求，一般在4℃下孵育过夜。
步骤五：洗涤1.将切片取出，并置于洗涤缓冲液中，用于去除未结合的抗体。
2.反复洗涤3-4次，每次至少5分钟，确保切片完全清洗。
步骤六：标记1.添加适当浓度的二抗，如辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，与已经结合的一抗反应。
2.孵育切片与二抗共反应，孵育温度和时间根据试剂的要求进行。
步骤七：显色和染色1.使用合适的显色剂将切片进行显色。
常见的显色剂有DAB（二氨基联苯氧化物）和VIP（有机磷染料）等。
2.彩色染色可根据实验需求进行，可以使用核染料如伊红、快速伊红等对细胞核进行染色。
步骤八：石蜡去除和封片1.将切片浸入去石蜡溶液中，去除石蜡。
2.使用适当稀释的巴豆胶溶液将切片封闭，确保切片在显微镜下观察时保持湿润。
步骤九：显微镜观察1.将封片放置在显微镜载物台上，使用适当放大倍率的显微镜观察切片。
2.观察切片的染色情况、抗体标记的结果等，记录并进行分析。
这些是一般的免疫组化法实验操作步骤，根据具体实验需求和试剂要求，可能会有一些细微的差异和额外的步骤。
免疫组化超详细步骤
免疫组化超详细步骤免疫组化是一种常用的实验方法，用于检测细胞或者组织中特定的分子，如蛋白质、核酸和糖等。
下面是免疫组化的详细步骤：1.样本准备：a.细胞或组织准备：首先需要获取细胞或组织样本，可以通过培养细胞或直接取得组织切片。
b.保存和处理：细胞或组织样本需要保存在合适的液体中，如福尔马林或液氮，以保证样本的完整性和保存时间。
c.切片：对于组织样本，需要将其切割成薄片，常用的方法是冰冻切片或石蜡包埋切片。
2.抗原的暴露：a.反应原位：对于固定的细胞或组织样本，可以直接进行免疫组化实验。
b.透化处理：对于未固定的细胞或组织样本，需要进行透化处理，以使抗体能够穿透细胞膜或组织间隙。
3.抗原检测步骤：a.抗原恢复：有时，抗原可能会受到固定或透化处理的损伤，需要进行抗原恢复步骤。
常见的方法有热处理、酶消化和抗体消除等。
b.阻断非特异性结合：为了减少非特异性结合，需要对样本进行阻断处理，可以使用一些蛋白质，如牛血清白蛋白（BSA）或鱼胶。
4.抗体标记检测：a.一抗：选择特异对应抗原的一抗（原抗体），将其加入到样本中，与样本中的特定抗原结合。
b.二抗：将含有特异对一抗的二抗（辅助抗体）标记的溶液加入到样本中，与一抗结合。
二抗通常会与荧光染料、酶或金颗粒等标记结合。
5.洗涤：a.用缓冲液洗涤样本，以去除未结合的抗体和其他非特异性的结合物。
6.反应可视化：a.荧光标记：对于荧光染料标记的样本，可以通过荧光显微镜观察到标记物的信号。
b.酶标记：对于酶标记的样本，需要使用合适的基质使酶产生染色反应，并通过显微镜观察到染色的结果。
7.整理和分析：a.包装：用透明性的封片将样本封装，以便保存并观察。
b.分析：使用显微镜分析样本的结果，例如观察染色的细胞或组织的形态、信号定位等。
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免疫组化
一实验目的：分别用KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体检测肺癌组织中KRAS、NRAS、HRAS蛋白的表达情况
二实验原理: 应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术.
三实验试剂及耗材:经病理医生确认的肺癌组织切片、KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体、DAB 显色试剂盒、抗原修复液、PBS、苏木素染料、1%盐酸酒精溶液、0.05%氨水、二甲苯、等
四实验设备：切片机、4℃冰箱、显微镜、烤片机
五主要试剂配置:
缓冲液
应用液A NaH2PO4 38.4g配成1000毫升溶液
应用液B Na2HPO4·12H2O 114.8g配成1000毫升溶液
配制1000毫升PBS需要14毫升应用A液，36毫升应用B液，加8.5gNaCl。
枸橼酸钠抗原修复液
应用液A 枸橼酸 10.55g配成1000毫升溶液
应用液B 柠檬酸三钠（三水合柠檬酸三钠） 29.01g 配成1000毫升溶液
配制500毫升抗原修复液需要9毫升应用A液，41毫升应用B液。
苏木素染液配方：苏木素2g,无水乙醇250毫升，硫酸铝17.6g蒸馏水750毫升，碘酸钠0.2g，冰醋酸20毫升。
先将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝溶于蒸馏水水中。
两液溶解后将其混合，加入碘酸钠，最后加入冰醋酸。
抗体说明书建议的抗体稀释度
N-Ras 1:50-1:500
H-Ras 1:50-1:500
K-Ras 1:20-1:200
六实验步骤：
1组织常规石蜡切片厚度3-5um，防脱片捞片后晾干，放入72℃烤箱烤片2小时。
2 切片脱蜡水化程序
⑴二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各12分钟；
⑵无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各3分钟；（洗二甲苯）
⑶ 95%乙醇3分钟；
⑷ 85%乙醇3分钟；
3 自来水漂洗3分钟，洗涤一定要充分。
4 组织修复采用高温高压法：压力锅中加入pH 6.0 ，0.01M抗原修复液约1000ml，切片
插入塑料架上，放入压力锅，盖上锅盖（此时不扣上压力阀）1600W预热至沸腾，扣上压
力阀1300W，待高压锅阀门喷气开始计时，修复时间为2分钟。
5 停止加热并用流水冲洗高压锅以降温，室温冷却。
6将抗原修复后切片置自来水中，浸泡2分钟。
将样本置于内源性过氧化物酶阻断剂3%H2O2，室温放置4分钟。
（需要盖盖子）自来水洗2分钟，PBS缓冲液洗涤2分钟。
7 取出切片，擦干组织周围液体后滴加10%BSA封闭液，37℃孵育40分钟。
滴加一抗（浓
度配比,PBS稀释1:20、1:50、1:100、1:200）60ul，注意保持组织湿润状态但表面不能有液体，用试管使抗体全部覆盖组织面且不能有气泡，以使抗体能全部与组织接触。
8 滴加一抗后放入专用孵育盒内，4℃冰箱过夜。
9 切片放入PBS缓冲液中清洗3分钟×3次，充分洗涤，防止因洗涤不净引起的非特异性
染色。
（前两次的PBS倒掉）
10擦干组织周围液体后滴加70微升辣根酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物（根据实际情况要求覆盖样本），37℃温箱内孵育40分钟。
PBS缓冲液洗涤3分钟×3次.
11 显色，滴加现配适量DAB显色剂（在1ml试剂2（DAB底物液）中，加入1滴（约50ul）试剂1（DAB浓缩液），混合液，即配成DAB工作液），配置DAB显色剂的容器在冰冻切片机旁边的冰箱里，其它试剂在入门口冰箱。
室温显色,5-20分钟。
自来水终止显色。
第一
遍的自来水需集中处理，自来水洗涤3分钟。
12 复染，苏木素染液中染色40秒，水洗1分钟。
13 1%盐酸酒精溶液分化3秒，流水漂洗。
14 蓝化10秒，流水漂洗。
15 脱水，切片依次置于85%乙醇，95%乙醇各1分钟，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ中各2分钟。
16 透明，切片依次置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各2分钟
17 中性树胶封片。