免疫组化实验步骤
免疫组化实验步骤流程
免疫组化实验步骤流程1.样品制备：a.组织样品：从动物或人体获得的组织样品首先需要固定在福尔马林中，然后通过蜡包埋技术将组织固定在蜡块中。
之后，将蜡块切成薄片，然后将薄片分别放置于载玻片上。
b.细胞样品：将细胞悬浮液放置在载玻片上，并用福尔马林进行固定。
2.抗原恢复：固定的组织或细胞样品经过脱水和脱脂处理后，需要通过抗原恢复来揭示隐藏的抗原。
抗原恢复的方法可以是热处理、酶切或化学处理等。
3.形成蛋白结合位点：将载玻片上的样品用蛋白结合剂如牛血清白蛋白（BSA）、鱼胶或生物素素蛋白结合剂等进行封闭处理，以防止非特异性结合。
4.孵育抗体：a.主抗体：将特异性的首要抗体加入到样品中，与目标抗原结合形成抗原抗体复合物。
b.辅助抗体：添加荧光素或酶标记的次抗体，与主抗体结合，以扩大信号的产生。
5.洗涤：用缓冲液洗涤载玻片，以去除未结合的抗体和其他无关物质。
6.信号增强：a.酶标记的实验，为了增加信号强度，可以加入荧光素或发光底物。
b.荧光标记的实验，可以直接观察荧光。
7.显色：在酶标记的实验中，加入染色底物以产生可见的颜色，从而定位并显示目标抗原的存在。
8.盖玻片：在涂抹适当封片剂后，将载玻片盖上一片封片玻片，以保护样品并减少光的干扰。
9.显微镜观察：使用显微镜观察载玻片下的样品，并通过图像系统进行图像捕捉和分析。
10.结果评估：评估图像和数据以确定抗原的表达和分布情况。
根据实验目的，可以进行半定量或定量的数据分析。
需要注意的是，免疫组化实验中的条件、试剂和步骤会因实验目的不同而略有差异。
因此，在进行实验前需仔细阅读相关文献和制定适合的实验方案，以确保实验结果的准确性和可靠性。
免疫组化实验步骤及配方
免疫组化步骤1. 多聚甲醛灌流取材,多聚甲醛后固定,30%多聚糖溶液沉糖;2. 冰冻切片1d-14d 脊髓>=20μm;14d-28d>=10μm;DRGd=10μm3. 0.01MPBS 洗10min ×3次;4. 1NHCL 暴露抗原30min ；5. 去离子水洗,0.01MPBST 洗10min ×3次；6. 3%双氧水0.01MPBS 配制洗10min,灭活内源性HRP ；7. 0.01MPBST 洗10min ×3次；8. 5%-10%血清封闭30min0.01MPBST 配制；9. 一抗过夜,一抗用PBST 稀释；10.0.01MPBS 洗10min ×3次,二抗3孵育小时； 11.0.01MPBS 洗10min ×3次,HRP-亲和素3小时； 12. 0.01MPBS 洗10min ×3次,DAB 显色12-18min.免疫组化常用试剂配制1. 0.1MPB:14.5gNa 2HPO 4·12H 2O500mLH 2O1.5gNaH 2PO 4·2H 2O2. 0.1MPBS:500mL0.1MPB45gNaCl3. 0.01MPBST:100mL0.01MPBS10滴TritonX-1004.INHCL:盐酸：水=1：105.4%多聚甲醛：13.6gKH 2PO 43.6gNaOH40g 多聚甲醛1000mLH 2O注：1.需要60°C 加热溶解,过滤使用；2.多聚甲醛每次比需要多称10g,以弥补后面过滤的损失；3.现将多聚甲醛溶于1000mL 水中,然后一边加热搅拌一边缓慢加入多聚甲醛的助溶剂NaOH,待NaOH 和多聚甲醛都完全溶解后再加入KH 2PO 4,溶后过滤备用.6.DAB 液：以0..1MPB 配制,DAB 浓度0.05%,H 2O 2浓度0.03%.注：1.H 2O 2临用时再加；2.用DAB 染后用0.01MPB 洗.7.30%蔗糖：150g 蔗糖500mL4%多聚甲醛注：可同时沉糖后固定.8.封闭液：10%山羊血清做免疫荧光时另加0.1%BSA.。
免疫组化实验步骤(优选.)
最新文件---------------- 仅供参考--------------------已改成-----------word文本 --------------------- 方便更改免疫组化操作步骤一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2. 水浴锅（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L. 2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。
3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH调至ph8.0, 加水至1000ml.4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0, 加水1000ml。
5. 酶消化液：a.0.1%胰蛋白酶:用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。
b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制7. 风裱剂：a.甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS(PBS)配制8．TBS/PBS PH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
免疫组化实验步骤
1.PBS冲洗5min×3次
2.加修复液，低温加热10min/高温2min
3.室温冷却10min
4.PBS冲洗5min×3次，用滤纸吸干PBS
5.滴加试剂A（封闭用正常山羊血清工作液），湿盒内室温孵育15min
6.一抗稀释
预实验：Anti-MGMT 1:100 1:200 1:400
Anti-XRCC1 1:100 1:200 1:400
Anti-P53 1:50 1:100 1:200
正式试验：Anti- MGMT 1:400
Anti-XRCC1 1:400
Anti- P53 1:100
7.滴加上述稀释好的一抗，4℃过夜
8.滴加二抗试剂B（生物素标记山羊抗兔IgG），室温孵育20min
9.PBS冲洗3min×3次，用滤纸吸干PBS
10.滴加试剂C（辣根酶标记链酶卵白素），室温孵育20min
11.PBS冲洗3min×3次，用滤纸吸干PBS
12.DBA显色，在显微镜下进行观察，待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液。
13.自来水冲洗10min
14.苏木素复染
15.自来充分水冲洗，蒸馏水浸泡2min
16.酒精梯度脱水3min×7次
17.透明，二甲苯Ⅰ5min，二甲苯Ⅱ5min
18.树胶封片，80℃烤箱烤干。
HE染色
1.苏木素染色10min，自来水充分冲洗。
2.伊红染色2min，自来水充分冲洗
3.酒精梯度脱水3min×7次
4.透明，二甲苯Ⅰ5min，二甲苯Ⅱ5min
5.树胶封片，80℃烤箱烤干。
免疫组化实验步骤完整版
免疫组化实验步骤完整版步骤1：标本采集和固定首先，需要从待检测样本中采集组织或细胞。
可以使用手术切片、活体组织、培养的细胞等作为标本。
然后，将采集的样本固定在载玻片或切片上，以保持其结构和形态的完整性。
步骤2：抗原暴露和体细胞抗原消除接下来，需要处理标本以使抗原裸露出来，并消除非特异性的抗体结合和细胞膜结合的抗原。
这一步骤常常涉及对组织或细胞的预处理，例如用石蜡脱脂、酶解抗体和孵化等。
步骤3：抗体特异性结合选择特异性的抗体用于检测待测蛋白质。
这些抗体可以是直接标记的一抗，或间接标记的二抗。
一抗是专门与目标抗原结合的抗体，而二抗则可以与一抗结合，以提高信号的灵敏度和特异性。
这一步骤中还需要选择适当的阴性对照，即未携带待检测抗原的样本。
步骤4：探针检测根据需要，可以使用不同的探针来检测目标分子。
常用的探针有标记的一抗、荧光探针、放射性标记物等。
标记的一抗可以直接结合抗原，然后使用染色剂进行可视化；荧光探针则通过荧光显微镜进行检测；放射性标记物可以通过放射自显影等方法进行检测。
步骤5：显色和对比计数将荧光、酶标记或放射性标记的物质显色，以便于检测和计数。
在染色的过程中，需要防止非特异性的染色，例如使用阻断剂、胶原等。
步骤6：结果分析根据观察到的染色强度、分布模式等结果，分析待测蛋白质在样本中的表达情况。
这可能需要与阴性对照和阳性对照进行比较，以确定实验结果的可靠性。
步骤7：图像捕获和分析使用显微镜或其他成像设备，将荧光、染色或放射性标记的图像捕获下来。
可以使用图像分析软件来计算和比较样本中的染色强度、面积等参数。
步骤8：数据统计和结果报告根据实验结果进行数据统计和分析，并将结果记录在报告中。
报告应包括样本信息、实验方法、结果和结论等内容，并根据需要进行解释和讨论。
总结：免疫组化实验是一种广泛应用于研究、诊断和治疗的方法。
它的步骤包括标本采集和固定、抗原暴露和体细胞抗原消除、抗体特异性结合、探针检测、显色和对比计数、结果分析、图像捕获和分析、数据统计和结果报告。
免疫组化流程
免疫组化流程
免疫组化是一种生物技术，用于研究一个或多个蛋白质的交互性及它的细胞上的定位，从而探究蛋白质在复杂的细胞环境中的功能及其作用机制。
免疫组化是以抗体作为特异性
捕获识别分子的标记物，以检测某一特定的蛋白质在细胞中的形态分布，其主要分为三个
步骤：样本处理、抗体淬取和检测荧光。
1. 样本处理：由于免疫组化需要在细胞环境下完成实验，所以在处理样品前，先要
将细胞或组织悬浮，再利用活细胞分离技术将其分离出来，以制备出水平固定、正常形态
的细胞阵列。
2.抗体淬取：抗体淬取是查找蛋白质在细胞中的分布的主要步骤，将具有指示特定蛋
白质的特定抗体喷射在分离的细胞上是大多数实验的基本过程，抗体可以通过多种不同的
方法混合到细胞上，例如管接收、块接收和碰撞接收。
3.检测荧光：检测荧光是一种利用荧光探针标记抗体和膜蛋白，在荧光显微镜上观察
膜蛋白的分布情况，字膜上的膜蛋白和脱离细胞膜的膜蛋白也可以由不同颜色的荧光探针
标记，从而确定膜蛋白的分布情况。
以上三个步骤合在一起，就能完成免疫组化实验，从而检测蛋白质在细胞中的空间分布，免疫组化还可以用来分析蛋白质如何在细胞周围的其他分子之间相互作用。
这个实验
技术具有高灵敏度、可重复性强和节省时间等优点，可以大大提高细胞内目标蛋白质的分
析能力，同时为细胞医学研究和更深入地研究细胞功能提供重要的实验证据。
免疫组化(IHC)实验具体步骤及说明
免疫组化（IHC）实验具体步骤及说明一、试剂和溶液乙醇: 无水乙醇，95%乙醇，85%乙醇，70%乙醇抗原修复液: 0.01M 的柠檬酸钠缓冲液：58.82g 柠檬酸三钠及7.56g 柠檬酸溶于200ml 纯水，调pH 至6.0，纯水1:100 稀释为工作液3%过氧化氢-甲醇: 30%的过氧化氢与无水甲醇1:9 稀释10X PBS: 80g NaCl，2g KCl, 14.4g Na2HPO4 和2.4g KH2PO4 加1 L 纯水，调pH 至7.4 洗涤液: 1×PBS：纯水稀释10× PBS；1× PBST：含0.05% Tween-20 的1×PBS（1×PBST）super block，生物素标记的UltraTek Anti-Polyvalent 二抗，酶标亲和素UltraTek HRP，DAB 显色试剂盒：Cat. KT1002a 抗体稀释液：3%BSA-PBS 0.5%盐酸-乙醇：0.5～1%盐酸，95.0-95.5%乙醇苏木素：苏木精2g 溶于250ml 无水乙醇，十六水合硫酸铝17.6g 溶与750ml 纯水，以上溶液充分混合，加入碘酸钠0.2g 和冰醋酸20ml二、实验步骤1.组织固定：烘箱温度65-75℃ 30min 或者65℃过夜；2.脱蜡：二甲苯浸泡三次，每次10 分钟；3.水化：依次经过无水乙醇，95%乙醇，85%乙醇，70%乙醇浸泡，每次5min；4.洗涤：自来水冲洗1 次，PBS 浸泡3min；5.抗原修复：放入稀释100 倍的柠檬酸盐缓冲液(pH6.0) 中，高压锅煮沸10min，常温冷却30min；6.洗涤：纯水浸泡2 次，PBS 浸泡1 次，每次3min；7.灭活酶：室温下3%过氧化氢-甲醇暗处处理切片15min；8.洗涤：纯水浸泡1 次，PBS 浸泡2 次，每次3min；9.封闭：加入适当体积的super block（KT1002a Reagent A），37℃温箱孵育5min；10.洗涤：纯水浸泡1 次，PBS 浸泡2 次，每次3min；11.一抗：加入反应体积为0.15ml，适合浓度的一抗, 37℃ 湿盒孵育60min。
免疫组化步骤
一步法免疫组化实验步骤详解：
1.脱蜡：脱蜡要达到将原组织玻片上的石蜡充分脱掉的目的，加热只是为了加速石蜡的溶解；
二甲苯Ⅰ（15min 60度）-- 二甲苯Ⅱ（15min 60度)-- 100%乙醇（10min)--90%乙醇（5min）--80%乙醇（5min)--70%乙醇（5min）--蒸馏水（5min）
2.抗原修复（微波修复法）：目的是让蛋白抗原充分暴露
1）柠檬酸盐溶液：(PH：6.0) 500ml 不同的蛋白应采用不同的抗原修复条件，比如说膜蛋白PDGFRA 的煮沸时间不能过长；核蛋白KI67及包浆蛋白应充分煮沸；
2）EDTA修复液（PH：9.0）稀释后体积是500ml cox2及PDGFRA蛋白的抗原修复的效果较好；
3.清洗：PBS 5min*3次；
4.去除组织H2O2 酶：3%H2O2 37度10min；
5.清洗：PBS 5min*3次；
6.一抗孵育：4度过夜；
过夜--过夜--过夜--过夜--过夜
7.取出玻片盒，放置于室温复温30min（一般不做此步骤）；
8.一抗回收：将一抗回收标记清楚以备进行其他实验；
9.清洗：PBS 5min*3次；
10.孵育二抗：37度30min；二抗的添加主要是根据一抗的来源，抗鼠、抗兔或者其他；
11.清洗：PBS 5min*3次
12.DAB显色：DAB的显色时间主要取决于棕色颗粒的数目和浓度；一般在3min-10min之间；
13.复染：用苏木精染色，根据显微镜下核的深度来判断；
14.蓝化：将染过的核放在水中10min左右；
15.透明、封片：蓝化后的玻璃切片滴加中性树脂透明后封片；
16.放置于65度烤箱，烘干，观察实验结果。
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免疫组化实验步骤 Revised final draft November 26, 2020
石蜡切片免疫组化实验步骤
石蜡切片步骤按照晓峰整理的步骤进行（From徐晓峰、朱老师的“石蜡切片”方案）：
1）材料的准备
在本实验室条件下推荐使用FAA（50%ethanol,5%aceticacid,3.7%甲醛）固定材料。
FAA固定液（100ml），室温保存：
无水乙醇50ml
冰醋酸5ml
37%甲醛10ml
水35ml
第一天：组织固定
用FAA固定，详见“石蜡切片”protocol。
第二天：脱水
以上所有步骤中每换好一步乙醇均置于4℃冰箱等待，并不时轻摇。
*组织可在70%ethanol4℃可存放几个月
第三天：进一步脱水和浸蜡
以下所有步骤在4℃进行并不时轻摇
以下所有步骤在室温进行并不时轻摇
准备工作：60℃预热plus蜡片（ParaplastPlus）石蜡可反复融凝而去气泡
第四天：浸蜡2
将材料置于42℃直至蜡块完全熔化。
再加1/4体积的蜡块至完全熔化后移至60℃。
几个小时后换上新鲜熔好的蜡液，过夜。
第五天：浸蜡3
换蜡两次（ParaplastPlus）
第六天：浸蜡4
换蜡两次（ParaplastPlus）
第七天：浸蜡5
换蜡两次（ParaplastPlus）
准备工作：60℃预热Regular蜡片（ParaplastRegular）
第八天：包埋（包埋块可长久保存）
第九天及之后：
开始切片，切片应包括自己的片子及正负对照等。
事先打开烘片机至37度，在涂有多聚赖氨酸的玻片上加1~2ml的蒸馏水。
切好的片子轻至于加水的玻片上。
待所有片子准备完之后盖上盖子，烘片过夜。
用自来水及双蒸水清洗免疫组化专用塑料，放在烘箱烘干待用。
第二天：开始脱蜡（From徐晓峰、朱老师整理的“石蜡切片”protocol）
（用新买来的免疫组化塑料小盒，每一步只需加入试剂220~250毫升）
抗原修复：
在切片还浸入酒精时，可以事先将煮锅清洗干净，用蒸馏水洗1~2遍，最后加入0.01M柠檬酸钠缓冲液(PH=6.0)，煮沸(保持在95度左右)，将过完PBS的片子让入煮沸的锅中，煮片10~15min。
然后将电磁炉关闭，自然冷却锅中切片（千万不要把片子拿出来，放在缓冲液中一起自然冷却至室温！！！）
将片子浸入PBS（PH=7.4）5min。
重复一遍。
封闭：
在抗原修复时可以事先配制封闭液，用PBS（PH=7.4）配制3%BSA的封闭液。
将PBS中的切片放入封闭液中，室温放置30分钟~1小时。
杂一抗：
在封闭时可先剪好与切片大小相当的封口膜，并准备加有少量水的塑料大盒，用卫生纸垫在塑料大盒中附带的塑料板上。
用封闭液稀释一抗(GFP兔多抗以1:100稀释，其它一抗需要另外尝试)。
将稀释完的一抗加在片子上，每张片子保证不少于100ul，用封口膜封上，检查是否有汽泡，轻轻赶走气泡。
将片子放在塑料大盒
中，盖上塑料盖子，放入冰库过夜。
杂二抗：
事先配制好TBS(PH=7.4)缓冲液，用TBS（PH=7.4）缓冲液稀释带有碱性磷酸酶(AP)标记的抗兔二抗，比例为1:200。
将塑料大盒从冰库中拿出，浸入TBS（PH=7.4）
缓冲液中洗一抗，5min，重复3次，在洗一抗的过程中准备封口膜。
将片子上的残余缓冲液倒去（但片子必须保持湿润！！！）每张片子加不少于100ul的二抗稀释液，盖上封口膜，放入塑料大盒中，室温放置1~1.5小时。
洗二抗并显色
用TBS(PH=7.4)缓冲液洗二抗，5min,重复3次。
同时在暗处配制显色液（40ul溶
液A+40ul溶液B+720ul水，可根据实际切片数量按比例配制显色液），剪切封口膜。
将片子至于暗处，倒去缓冲液，每张片子加不少于100ul的显色液，轻轻盖上封口膜，放于暗处进行显色。
每隔15分钟左右看一下片子是否开始显色(根据经验，加入显色液30min~1小时会开始显色,但是需要根据不同蛋白表达强弱，把握显色
时间)。
发现显色之后需加蒸馏水终止反应，再盖上盖玻片进行观察并拍照。
试剂：
1.0.01MPBS（PH=7.4）:
购买的小包装粉末，溶于1L水中，待粉末溶解后调PH值至7.4。
2.TBS:
2.4gTris,8.8gNaCl溶于1L水中，调PH值至7.4
3.0.01M柠檬酸钠缓冲液(PH=6.0)：
2.94g柠檬酸三钠2H2O溶于1L蒸馏水中，用固体柠檬酸调PH至6.0
4.3%BSA封闭液
7.5gBSA溶于250毫升PBS(PH=7.4)中。