免疫组化标准操作规程
免疫组化标准操作规程
免疫组化标准操作规程
一、适用范围
适用于实验室从事免疫组化实验的实验技术人员和研究生。
（基于基础操作的流程化程序。
）
二、操作规程
1）石蜡切片，常规脱蜡至水；
2）0.3%或3%H2O2去离子水（无色液体）孵育10-30分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性；
3）蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟；
4）候选步骤：采用抗原修复-微波（建议30分钟内4次中火）、高压、酶修复方法。
自然冷却，再用3分钟×3次；
5）血清封闭：室温15-30分钟，尽可能与二抗来源一致。
倾去，勿洗；
6）滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育2至3小时或4℃过夜（最好复温）。
PBS 冲洗，3分钟×5次；
7）滴加生物素标记的二抗，室温或37℃孵育30分钟到1小时；
8）PBS 冲洗，3分钟×5次；
9）滴加SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室温或 37℃孵育30分钟到1小时；
10）PBS冲洗，3分钟×5次；
11）显色剂显色（DAB等）；
12）自来水充分冲洗；
13）可进行复染，脱水，透明；
14）选择适当的封片剂封片。
注意事项：本法仅适用于SP法，其它方法请参考相关说明书。
病理科业务学习免疫组化染色步骤
•切片取出后放入PBS缓冲液中洗涤1分钟x3次。
• 取出放入3%过氧化氢水溶液中5-10分钟，以去除内源性 过氧化物酶。
• 取出放入PBS缓冲液中洗涤1分钟x3次。
•取出切片，擦干组织周围液体后滴加一抗，注意保持组织湿润状 态但表面不能有液体，要求抗体全部覆盖组织面，不能有气泡，以 使抗体能全部与组织接触。
•取出切片，擦干组织周围体后滴加DAB，显色时间5分钟左右， 如显色时间太短，阳性强度不够，阳性部位不突出，如显色时间过 长，背景着色较深，阳性部位对比差，均不利于诊断。
• 取出洗去DAB，放入苏木素中复染细胞核，一般时间为40 秒左右（依照苏木素新旧不同可适当增减时间）
• 分化、反蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
谢谢！
免疫组化染色步骤
免疫组化标准操作程序
1、常规石蜡切片厚度3～4微米，放入80℃烤片机烤片15分 钟； 2、切片脱蜡程序： 二甲苯I、II、III脱蜡各10分钟； 无水乙醇I、II各5分钟； 95%乙醇I、II各5分钟。 3、流水冲洗，待组织修复。
•组织修复采用高温高压法：待高压锅内EDTA修复液沸腾后，放入 切片，盖紧高压锅盖，待高压锅阀门喷气开始计时，一般修复时间 为2.5-3分钟。
•滴加一抗后放入专用孵育盒内室温孵育1-2小时或4℃冰箱内过夜。 由于一抗孵育时间较长，因此一抗滴加量不宜过少。
•甩掉一抗，切片放入PBS缓冲液中洗涤1分钟x3次，充分洗涤， 防止因洗涤不净引起的非特异性染色。
•滴加辣根酶标记聚合物（基本要求同一抗），室温孵育时间为2025分钟。
•取出切片放入PBS缓冲液中洗涤1分钟x3次，充分洗涤，防止因洗 涤不净引起的非特异性染色。
免疫组化基本操作流程
免疫组化基本操作流程操作流程：1、脱蜡和水化脱蜡前，将组织切片放在60℃恒温箱中烘烤30-90分钟。
（1）置于二甲苯 I中浸泡 10分钟，在二甲苯I I中再浸泡 10分钟；（2）无水乙醇 I中浸泡5分钟，在无水乙醇I I中再浸泡5分钟；（3）95%乙醇中浸泡3-5分钟；（4）80%乙醇中浸泡3-5 分钟；（5）75%乙醇中浸泡3-5分钟；（6）蒸馏水中浸泡3-5分钟；2、去除内源性过氧化氢酶用蒸馏水或 PBS配置新鲜的 3%H2O2，室温封闭 10分钟，PBS/蒸馏水洗3次，每次3-5分钟。
3、抗原修复用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片（1）微波热修复：取一定量的抗原修复液于微波盒中，微波加热至沸腾；将脱蜡水化后的组织芯片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中高档微波P-60继续处理10-20分钟；取出微波盒冷却至室温，取出玻片，先用蒸馏水洗两次后用PBS洗3-5次，每次5分钟。
（2）酶消化方法：常用0.1% 胰蛋白酶和0.4% 胃蛋白酶液。
胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5-30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为10-30 分钟。
4、免疫组织化学染色（1）滴加正常山羊血清封闭液，37℃，30分钟。
（2）甩去多余液体，滴加一抗，37℃孵育1小时或4℃过夜（4℃过夜后在37℃复温30-45分钟）。
（3）PBS洗3次，每次5分钟。
（4）滴加二抗，孵育条件参见所用试剂盒。
（5）PBS洗3次，每次5分钟。
（6）DAB显色，在显微镜下掌握染色程度。
（7）自来水/蒸馏水洗终止染色，苏木素复染，盐酸酒精分化；（8）脱水、透明、封片、镜检。
操作规程1、脱蜡和水化（1）脱蜡前，将组织切片放在60℃恒温箱中烘烤1-3小时，恒温箱温度不得高于70℃，恒温箱内不得长期（超过24小时）存放物品，烤片结束后且恒温箱内没有其他切片等物品，请及时关闭恒温箱，避免恒温箱使用时间过长。
（2）使用通风橱内的二甲苯和梯度乙醇脱蜡，不得将二甲苯和梯度乙醇拿到通风橱外使用。
免疫组化标准操作程序
免疫组化标准操作程序
Elivision™plus免疫组化染色原理：Elivision™plus试剂盒将多个抗鼠和抗兔的IgG分子与辣根过氧化物酶聚合，所形成的聚合物直接与一抗结合，从而放大了抗原抗体结合的信号。
一、染色步骤：
1、蜡切片脱蜡和水化后，用PBS（pH7.4）冲洗三次，每次3分钟（3*3分钟）。
2、根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。
3、如有必要，每张切片加1滴或50ul3%过氧化氢溶液，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶。
PBS冲洗3*3分钟。
4、甩去PBS,每张切片加1滴或50Ul的第一抗体，室温下孵育60分钟或4。
C过夜，具体参阅各种抗体的说明书。
5、PBS冲洗3*3分钟。
6、甩去PBS液,每张切片加1滴或50ul聚合物增强剂（试剂A）,室温下孵育20分钟。
7、PBS冲洗3*3分钟。
8、甩去PBS液，每张切片加1滴或50ul酶标抗鼠/兔聚合物（试剂B）,室温下孵育30分钟。
9、PBS冲洗3*3分钟。
10、甩去PBS液，每张切片加2滴或100ul新鲜配制的DAB或AEC 显色液，显微镜下观察3-10分钟。
11、蒸储水或自来水冲洗，苏木素复染，0.1%盐酸分化，自来水冲洗，PBS冲洗返蓝。
12、如果用DAB显色，则切片经过梯度酒精脱水干燥，（二甲苯透
明）中性树胶封片；如果用AEC显色，则切片不能经酒精脱水,而直接用水性封片剂封片。
二、染色结果：
镜下观察阳性显色为棕色或红色。
免疫组化操作规程及操作流程
免疫组化操作规程一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。
三、试剂配制1. 0.01 M PBS(pH 7.34 )：9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB 加双蒸水至1000 ml；1000 ml0.2M PB (pH 7.4)＝5.93 g NaH 2 PO 4 ·2H 2 O＋58.02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 双蒸水或＝190 ml A + 810 ml B（A. 0.2 M NaH 2 PO 4 ·2H 2 O：15.6 g in 500 ml ddH 2 O；B. 0.2M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O：71.632 g in 1000 ml dH 2 O）。
2. Citrate Buffered Saline（0.01 M 柠檬酸缓冲液，PH6.0）：28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O（A.Citrate acid（柠檬酸）：10.5 g 加双蒸水至1000 ml；B.Citrate sodium（柠檬酸钠）：29.41 g 加双蒸水至1000 ml）。
3. 细胞通透液：由终浓度分别为0.3%双氧水和0.3%Triton X-100 混合而成。
配制方法是先用微波加热的36 ml PBS，再接着加120 ul TritonX-100，并加热一会儿，冷却至临用前加0.4 ml 30％H 2 O 2 。
免疫组化的原理及操作规程
免疫组化的原理及操作规程免疫组化，即免疫组织化学染色技术，是一种利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（如荧光素、酶、金属离子、同位素等）显色，从而确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质）的定位、定性及相对定量的研究方法。
该技术广泛应用于临床病理诊断、生物医学研究以及药物开发等领域。
本文将详细介绍免疫组化的原理及操作规程。
一、免疫组化的原理免疫组化的基本原理是抗原与抗体的特异性结合。
抗原是指能够刺激机体产生免疫应答，并能与免疫应答产物（抗体或致敏淋巴细胞）发生特异性结合的物质。
抗体是机体的免疫细胞在抗原刺激下产生的具有特异性识别能力的免疫球蛋白。
在免疫组化中，通常将目标抗原（如某种蛋白质或多肽）作为待检测物，通过特定的抗体与之结合，再利用标记技术使抗体可视化，从而实现对目标抗原的定位、定性和定量研究。
免疫组化的标记技术主要有直接法和间接法两种。
直接法是将标记物（如荧光素、酶等）直接标记在抗体上，使其与目标抗原结合后直接显色。
间接法则是利用未标记的抗体（一抗）先与目标抗原结合，然后再通过标记的二抗（与一抗特异性结合的抗体）与一抗结合，最终实现显色。
间接法具有更高的灵敏度和灵活性，因此在实际应用中更为常见。
二、免疫组化的操作规程免疫组化的操作规程主要包括以下几个步骤：1. 标本处理：根据实验需求选择合适的组织标本，并进行固定、脱水、包埋等处理，制备成组织切片或细胞涂片。
固定是为了保持组织或细胞的形态结构，防止抗原丢失；脱水则是为了去除组织中的水分，便于后续操作；包埋则是将组织块包裹在支持物（如石蜡）中，便于切片。
2. 抗原修复：由于固定和脱水等处理过程可能导致抗原表位的遮蔽或改变，因此在进行免疫组化染色前，需要对抗原进行修复。
常用的修复方法包括热修复、酶修复和酸修复等。
具体方法应根据实验需求和抗原性质进行选择。
3. 阻断内源性酶活性：为了避免组织内源性酶对后续显色反应的干扰，需要使用相应的阻断剂（如过氧化氢）对内源性酶活性进行阻断。
免疫组化操作规范
免疫组化操作规范第一、首先确定所下遗嘱能否收上费，一般有住院号的可以确定做免疫组化，最终以收费结果来确定，免疫组化需要用胶片来染色，特染用普通片就可以，所做项目用铅笔在载玻片的磨片上写对应的抗体名称。
第二、胃癌和肠癌套餐用全自动免疫组化仪来做，其他的用手工来操作，切好片子机染和手染分别摆放，机染的需要打好标签方便明天操作，核对医嘱信息是否和所切的片子相符，60℃过夜烤片。
第三、石蜡切片常规脱蜡至水，自来水冲洗干净浸泡在水中待用，不同的抗原做相应的修复，我科常规修复方法有柠檬酸缓冲液修复（2min）、EDTA缓冲液修复(15min)、胃蛋白酶修复和胰酶修复(37℃*30min)。
第四、修复结束后冷却10分钟后（可以用自来水降温），取出切片在相应的组织边缘画圈，然后把画好的切片背靠背放进染缸，染缸内盛有蒸馏水以防止干片。
HRP系统的抗体需要用过氧化氢来阻断，我科需要用3%过氧化氢在摇床上孵育 10分钟即可（3%过氧化氢配制方法：100mlPBS中加入3ml3%过氧化氢，以此类推），倒掉3%过氧化氢在用蒸馏水清洗2遍，然后加入PBS在摇床上洗 3min/2 次。
第五、把切片从染缸中取出放入湿盒中，滴加5%羊血清封闭液，在室温下孵育10分钟。
甩去羊血清（切勿清洗），滴加一抗工作液，室温孵育一个半小时。
甩去一抗工作液，把切片放入染缸中，用蒸馏水清洗2遍，用PBS浸泡下午上班后倒掉PBS，直接滴加二抗工作液，在室温下孵育20分钟。
第六、甩去二抗工作液，用蒸馏水清洗2遍，再用PBS缓冲液洗 3min/2 次。
每1ml DAB缓冲液中滴加1滴DAB，混匀后滴加到切片上，孵育 3 － 5 分钟，具体颜色自己控制，自来水充分冲洗 , 苏木素复染，分化，返蓝，脱水 , 透明 , 封片。
第七、归类好片子，根据医嘱信息把片子送到医生手中，打印医嘱信息。
免疫组化操作规程及操作流程
免疫组化操作规程及操作流程免疫组化技术是一种常用的细胞和组织学研究方法，广泛应用于病理学、生物学、药理学等领域。
下面将详细介绍免疫组化操作规程及操作流程。
一、实验前准备1.准备实验所需的试剂和试验设备，包括抗体、缓冲液、加标物、显色剂等。
2.检查免疫组化试剂的有效期，确保试剂的质量。
二、标本处理1.收集组织标本，如活检样本或动物组织。
2.快速处理标本，迅速取出，并选择适当的处理方法，如固定、包埋等。
3.处理过程中要避免标本的冻融、干燥等。
三、抗原回复1.对于经过固定的组织标本，使用抗原回复方法来恢复组织标本中的抗原活性。
2.选择适当的抗原回复方法，如热处理、酶解等。
四、非特异性结合阻断1.使用非特异性抗血清或蛋白质来阻断非特异性结合位点。
2.使非特异结合抗体活性降低，减少假阳性结果。
五、抗体处理2.优化抗体浓度，确保抗体与标本中的抗原结合。
3.对于特定抗体，可以进行荧光标记或酶标记等。
六、免疫组织染色1.用适当的缓冲液稀释抗体，并将其应用于组织标本上。
2.根据实验需求选择适当的孵育时间和温度。
3.利用显色剂或荧光显像剂对标本进行染色。
七、显微镜观察与分析1.将染色后的标本放置在显微镜下观察，并选择适当的增强荧光信号方法。
2.结合相关的正对照和负对照进行结果分析，确定一些蛋白质在组织中的表达情况。
3.分析结果并记录数据。
八、结果分析与报告1.根据观察结果，分析样本中目标抗原的表达情况。
2.比较不同样本之间的差异，得出结论并撰写实验报告。
九、实验后处理1.清洗使用过的实验工具和材料，避免交叉污染。
2.妥善处理废弃物和化学品，根据实验室内相应的安全操作规范进行处理。
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免疫组化标准操作规程(SOP)
名称：免疫组化标准操作规程(SOP)
关键词：免疫组化
目的：规范免疫组化操作
主要步骤:
1、脱蜡和水化
脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；
2）无水乙醇中浸泡5分钟；
3）95%乙醇中浸泡5分钟；
4）70%乙醇中浸泡5分钟；
2、抗原修复
用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。
1）抗原热修复
（1）高压热修复在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。
盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。
将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。
10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。
本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
(2)煮沸热修复电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15分钟。
(3)微波热修复在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。
适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。
2)酶消化方法常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。
胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。
适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。
3、免疫组织化学染色步骤
Elivision Plus 法（二步法）
1）脱蜡、水化；
2）PBS洗2～3次各5分钟；
3）抗原修复；（视具体抗体情况决定是否要做修复，本抗体PCNA不需修复）；
4）PBS洗2～3次各5分钟；
5）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟，以阻断内源型过氧化酶；
6）PBS洗2～3次各5分钟；
7）滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。
8）4℃过夜后需在37℃复温45分钟。
9）PBS洗3次各5分钟；
10）甩去PBS液，滴加Ⅱ抗聚合物增强剂40～50μl，室温静置，或37℃半小时；
11）PBS洗3次各5分钟；
12）甩去PBS液，滴加酶标抗鼠/兔聚合物40～50μl，室温静置，或37℃半小时
13）PBS洗3次各5分钟
14）DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度；
15）PBS或自来水冲洗10分钟；
16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；
17）自来水冲洗10～15分钟；
18）脱水、透明、封片、镜检。