免疫组化相关步骤
免疫组化的完整步骤及各步原理
免疫组化的完整步骤及各步原理免疫组化是一种常用的实验诊断技术，它通过检测细胞或组织中的特定蛋白质来帮助诊断疾病。
免疫组化的完整步骤包括抗原制备、抗体制备、预处理、染色和结果分析等几个环节。
下面我将详细介绍每个环节的原理及操作步骤。
首先是抗原制备。
抗原是指能够与特异性抗体结合的物质，常见的抗原有蛋白质、多肽和核酸等。
在免疫组化中，我们需要选择一种合适的抗原，并将其制备成适合免疫反应的浓度和形式。
一般来说，抗原可以采用化学合成法、生物来源法或基因工程技术等方法进行制备。
接下来是抗体制备。
抗体是指能够与抗原特异性结合的免疫球蛋白，它是免疫组化的核心成分。
在抗体制备过程中，我们需要先确定需要检测的抗原类型和数量，然后选择合适的动物或植物源材料，进行细胞融合或表达纯化等步骤，最终得到高纯度的单克隆抗体。
第三步是预处理。
在进行免疫组化之前，我们需要对样品进行一系列的预处理操作，以去除杂质和干扰物质的影响。
预处理包括样品稀释、缓冲液调整、基质效应消除等步骤。
还需要根据具体的实验设计选择合适的预处理方法和条件。
第四步是染色。
染色是免疫组化的核心步骤之一，它可以将标记有抗体的二抗与待测样本中的抗原结合，形成可视化的斑点分布。
常用的染色方法包括直接荧光法、间接荧光法、免疫印迹法等。
在染色过程中，需要注意染料的选择、浓度和作用时间等因素，以保证染色效果的质量和稳定性。
最后一步是结果分析。
免疫组化的结果分析需要综合考虑多个因素，如阳性对照品的比较、背景值的控制、图像处理和统计分析等。
常用的结果分析方法包括图像分析软件(如ImageJ)和统计分析软件(如SPSS)。
在结果分析过程中，需要注意数据的可靠性和准确性，避免误判和漏判的情况发生。
免疫组化是一项复杂而精细的技术，它需要综合运用多种知识和技能才能完成高质量的实验诊断任务。
希望以上的介绍能对您有所帮助！。
免疫组化相关步骤
免疫组化相关步骤免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测、定位和定量特定蛋白质在组织或细胞中的表达。
以下是免疫组化的一般步骤：1.取材和预处理：首先，选择需要研究的物种的组织样本，可以是固定和包埋的组织切片，也可以是细胞培养物。
对于固定组织，常用的固定剂包括福尔马林、乙醛等。
然后进行脱水、透明化、包埋等预处理步骤。
2.标本切片：将处理好的组织或细胞样本切成较薄的切片，常见的切片厚度为4-6微米。
切片后，可以将其固定在载玻片上。
3.抗原恢复：对于一些已经固定的样本，抗体可能无法充分与蛋白质结合。
因此，进行抗原恢复是必要的。
常见的抗原恢复方法包括加热诱导抗原恢复（如高温加热或压力加热）和酶或蛋白酶诱导的抗原恢复。
这些方法有助于揭示抗原并提高抗体的结合。
4.阻断非特异性结合：在进行免疫组化反应之前，需要阻断非特异性结合位点，以减少假阳性结果。
常用的非特异性结合位点阻断方法包括使用血清蛋白、牛血清白蛋白、胶原蛋白等。
5.一抗反应：将特异性抗体（一抗）加入切片或细胞上，并进行孵育。
一抗可以是多克隆抗体或单克隆抗体。
一般情况下，常用的抗体稀释倍数为1:100到1:1000。
此步骤的时间和温度也需要根据具体的抗体选择进行调整。
6.洗涤：完成一抗反应后，需要进行多次洗涤来去除未结合的抗体。
洗涤可以使用生理盐水、PBS等缓冲液，重复2-3次洗涤，每次洗涤时间持续5-10分钟。
7.二抗反应：8.洗涤：与一抗反应类似，完成二抗反应后需要进行多次洗涤来去除未结合的二抗。
洗涤可以使用生理盐水、PBS等缓冲液，重复2-3次洗涤，每次洗涤时间持续5-10分钟。
9.染色和显微镜观察：根据实验需要，可以选择合适的染色方法，如荧光染色或酶联染色。
染色后，可以使用荧光显微镜或光学显微镜进行观察和拍照记录。
10.分析和结果解读：根据染色的结果和显微镜观察，进行定性和定量分析。
可以使用图像处理软件来分析染色的强度和分布情况。
根据实验设计和相关的对照组，对实验结果进行解读。
免疫组化实验步骤及配方
免疫组化步骤1. 多聚甲醛灌流取材,多聚甲醛后固定,30%多聚糖溶液沉糖;2. 冰冻切片1d-14d 脊髓>=20μm;14d-28d>=10μm;DRGd=10μm3. 0.01MPBS 洗10min ×3次;4. 1NHCL 暴露抗原30min ；5. 去离子水洗,0.01MPBST 洗10min ×3次；6. 3%双氧水0.01MPBS 配制洗10min,灭活内源性HRP ；7. 0.01MPBST 洗10min ×3次；8. 5%-10%血清封闭30min0.01MPBST 配制；9. 一抗过夜,一抗用PBST 稀释；10.0.01MPBS 洗10min ×3次,二抗3孵育小时； 11.0.01MPBS 洗10min ×3次,HRP-亲和素3小时； 12. 0.01MPBS 洗10min ×3次,DAB 显色12-18min.免疫组化常用试剂配制1. 0.1MPB:14.5gNa 2HPO 4·12H 2O500mLH 2O1.5gNaH 2PO 4·2H 2O2. 0.1MPBS:500mL0.1MPB45gNaCl3. 0.01MPBST:100mL0.01MPBS10滴TritonX-1004.INHCL:盐酸：水=1：105.4%多聚甲醛：13.6gKH 2PO 43.6gNaOH40g 多聚甲醛1000mLH 2O注：1.需要60°C 加热溶解,过滤使用；2.多聚甲醛每次比需要多称10g,以弥补后面过滤的损失；3.现将多聚甲醛溶于1000mL 水中,然后一边加热搅拌一边缓慢加入多聚甲醛的助溶剂NaOH,待NaOH 和多聚甲醛都完全溶解后再加入KH 2PO 4,溶后过滤备用.6.DAB 液：以0..1MPB 配制,DAB 浓度0.05%,H 2O 2浓度0.03%.注：1.H 2O 2临用时再加；2.用DAB 染后用0.01MPB 洗.7.30%蔗糖：150g 蔗糖500mL4%多聚甲醛注：可同时沉糖后固定.8.封闭液：10%山羊血清做免疫荧光时另加0.1%BSA.。
免疫组化相关步骤
免疫组化相关步骤免疫组化（immunohistochemistry，IHC）是一种基于抗原抗体反应的方法，用于检测组织或细胞中其中一种特定蛋白质的表达。
下面将详细介绍免疫组化的相关步骤。
免疫组化的步骤包括样品制备、抗原修复、阻断、一抗反应、二抗反应和染色，具体如下：1.样品制备：首先，需要获取组织标本。
通过活体组织切片、细胞涂片或冷冻切片等方法制备标本。
制备好的标本需要保持完整和有代表性，通常要求切片不超过5μm厚。
2.抗原修复：组织切片在固定过程中会损害抗原的完整性，因此需要进行抗原修复，以恢复抗原的表达。
常用的抗原修复方法包括热解修复（如加热、压力煮等）和酶解修复（如胰蛋白酶消化等）。
3.阻断：组织切片会与非特异抗体结合，影响免疫反应的特异性，因此需要进行阻断。
常用的阻断方法包括用牛血清白蛋白（BSA）或奶粉进行阻断，以防止非特异性背景信号的产生。
4.一抗反应：将含有特异性抗体的试剂加到组织切片上，使其与目标抗原结合。
特异性抗体可针对不同的抗原进行选择，如研究一些蛋白质的表达，可以选择该蛋白的特异性抗体。
5.二抗反应：一抗与抗原结合后，需要加入与该一抗来自不同物种的二抗。
二抗通常是免疫出来的，其与一抗结合后，可形成复合物，具有荧光或酶标记。
6.染色：最后，通过染色方法来显示抗原的表达。
染色可以是荧光染色或酶标染色。
荧光染色利用特定颜料对特异性标记的抗体进行荧光标记，并在荧光显微镜下观察。
酶标染色则使用酶标记的二抗，再加入相应的底物进行染色。
除了以上的基本步骤1.控制组：为了验证实验是否准确，通常需要设置阴性和阳性对照组。
阴性对照组通常是替代一抗的种属、浓度和机制抗体；阳性对照组是已知具有目标蛋白表达的组织切片。
2.负载密度和反应时间：一抗的负载密度和反应时间需要优化，以确保对目标蛋白的增强标识，同时最大限度地减少背景信号。
3.显微镜观察和图像分析：观察染色结果时，要选择合适的显微镜，以获得清晰的图像。
免疫组化流程
免疫组化流程免疫组化是一种利用抗体与特定抗原结合的技术，用于检测细胞或组织中特定分子的存在和分布。
其流程包括标本制备、脱脂、抗原修复、抗体处理、染色和显微镜观察等步骤。
本文将以免疫组化的流程为主线，介绍各个步骤的具体操作方法和注意事项。
第一步是标本制备。
要制备免疫组化的标本，可以使用细胞悬液、细胞刮片、冰冻切片或石蜡切片等。
标本制备的关键是保持细胞和组织的完整性和形态。
对于固定的细胞和组织，需要将其处理成适合免疫组化的形式，例如通过冰冻切片或石蜡切片的方法。
第二步是脱脂。
脱脂是将细胞或组织中的脂肪和非脂肪物质去除的过程，以便更好地显示目标分子的分布。
通常可以使用乙醇、醚或甲醇等有机溶剂进行脱脂处理。
需要注意的是，脱脂时间不宜过长，否则可能导致抗原失活。
第三步是抗原修复。
抗原修复是为了使被固定的细胞或组织中的抗原恢复或暴露出来，以便与相应的抗体结合。
常用的抗原修复方法包括煮沸法、酶解法和酸碱解法等。
不同的抗原修复方法适用于不同的标本类型和抗原性质。
第四步是抗体处理。
在免疫组化中，需要使用一种与目标分子特异性结合的抗体。
通常可以使用一抗和二抗的结合用于检测。
一抗是与目标分子特异性结合的主抗体，而二抗则与一抗结合，用于产生荧光或酶标信号。
在抗体处理过程中，需要进行固定、洗涤和孵育等步骤。
第五步是染色。
染色是将经过抗体处理的样本显色或标记的过程，以便更好地观察目标分子的分布。
染色的方法可以根据需要选择，常用的有免疫荧光染色、酶标染色和银染等。
在染色过程中，需要根据实验要求和标本特点进行适当的控制，以获得准确的染色结果。
最后一步是显微镜观察。
经过以上的操作，样本已经准备好进行显微镜观察和分析。
观察时需要注意光线的调节和对焦的正确，以获得清晰和准确的图像。
同时，还需要根据实验要求和预定的结果指标进行分析和解读。
总结起来，免疫组化的流程包括标本制备、脱脂、抗原修复、抗体处理、染色和显微镜观察等步骤。
每个步骤都需要精确控制和注意细节，以确保实验结果的准确性和可靠性。
免疫组化原理步骤及试剂
免疫组化原理步骤及试剂免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种广泛应用于生物医学领域的实验技术，用于检测组织切片中特定抗原的分布和表达水平。
它结合了免疫学和组织学的原理，能够在组织切片上定位和检测抗原，并通过染色方法将抗原可视化，从而实现对抗原的定性和定量分析。
免疫组化实验的步骤通常包括固定、脱脂、抗原修复、抗体和检测步骤。
下面将详细介绍每个步骤的操作和常用试剂。
1.组织固定：组织固定的目的是保持组织结构完整并固定细胞的抗原。
常用的固定试剂包括10%中性缓冲福尔马林（10% neutral buffered formalin，NBF）和乙醇等。
2.脱脂：脱脂是将组织切片中的脂质去除，以提高抗体对抗原的结合效率。
常用的脱脂试剂包括二甲苯、甲醛和乙醚等。
3.抗原修复：抗原修复是为了使被固定的组织恢复原样，增强抗原的可检测性。
抗原修复的方法包括热处理、酶解法和pH调整等。
常用的抗原修复试剂包括热解剂例如EDTA缓冲液、Tris-EDTA缓冲液，酶解剂例如胰蛋白酶和蛋白酶K，以及甲酸、盐酸等酸性溶液。
4.抗体：5.检测：检测步骤用于将抗原-抗体复合物可视化。
这通常通过染色方法完成。
常用的染色方法包括免疫酶标记、免疫荧光和免疫金标记等。
免疫组化实验所需的试剂种类繁多，下面列举一些常用的试剂：1. NBF（10% neutral buffered formalin）：用于组织固定，保持组织形态完整。
2.二甲苯：用于脱脂步骤，去除组织中的脂质。
3.甲醛：用于脱脂步骤。
4.乙醚：用于脱脂步骤。
5.EDTA缓冲液：用于抗原修复的热解剂。
6. Tris-EDTA缓冲液：用于抗原修复的热解剂。
7.胰蛋白酶：用于抗原修复的酶解剂。
8.蛋白酶K：用于抗原修复的酶解剂。
9.盐酸：用于抗原修复的酸性溶液。
10.一抗：选择特异性良好的一抗抗体，常用的有多克隆和单克隆抗体。
11.二抗：用于检测一抗结合的抗体，常用的二抗有反兔、反小鼠或反人的多克隆抗体。
免疫组化操作规程及操作流程
免疫组化操作规程及操作流程免疫组化技术是一种常用的细胞和组织学研究方法，广泛应用于病理学、生物学、药理学等领域。
下面将详细介绍免疫组化操作规程及操作流程。
一、实验前准备1.准备实验所需的试剂和试验设备，包括抗体、缓冲液、加标物、显色剂等。
2.检查免疫组化试剂的有效期，确保试剂的质量。
二、标本处理1.收集组织标本，如活检样本或动物组织。
2.快速处理标本，迅速取出，并选择适当的处理方法，如固定、包埋等。
3.处理过程中要避免标本的冻融、干燥等。
三、抗原回复1.对于经过固定的组织标本，使用抗原回复方法来恢复组织标本中的抗原活性。
2.选择适当的抗原回复方法，如热处理、酶解等。
四、非特异性结合阻断1.使用非特异性抗血清或蛋白质来阻断非特异性结合位点。
2.使非特异结合抗体活性降低，减少假阳性结果。
五、抗体处理2.优化抗体浓度，确保抗体与标本中的抗原结合。
3.对于特定抗体，可以进行荧光标记或酶标记等。
六、免疫组织染色1.用适当的缓冲液稀释抗体，并将其应用于组织标本上。
2.根据实验需求选择适当的孵育时间和温度。
3.利用显色剂或荧光显像剂对标本进行染色。
七、显微镜观察与分析1.将染色后的标本放置在显微镜下观察，并选择适当的增强荧光信号方法。
2.结合相关的正对照和负对照进行结果分析，确定一些蛋白质在组织中的表达情况。
3.分析结果并记录数据。
八、结果分析与报告1.根据观察结果，分析样本中目标抗原的表达情况。
2.比较不同样本之间的差异，得出结论并撰写实验报告。
九、实验后处理1.清洗使用过的实验工具和材料，避免交叉污染。
2.妥善处理废弃物和化学品，根据实验室内相应的安全操作规范进行处理。
免疫组化操作方法步骤原理
免疫组化操作方法步骤原理
免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种通过检测组织或细胞中的蛋白质表达来判断其状态的方法。
该技术被广泛应用于医学和生物学领域，用于诊断、研究和治疗疾病。
下面是免疫组化操作的步骤：
1. 标本采集和固定：对于组织样本，需要在切除后尽快固定，以保持其形态和蛋白质表达。
常用的固定剂包括福尔马林、乙醛和酒精等。
对于细胞样本，需要将其附着在载玻片上，使其保持完整。
2. 抗原修复：固定后的样本会导致抗原的变性和失活，需要进行抗原修复来恢复抗原的活性和可识别性。
常用的抗原修复方法包括热水浴、微波炉和酶处理等。
3. 阻断非特异性结合：在进行免疫染色前，需要阻断非特异性的结合，以避免假阳性的结果。
常用的阻断剂包括牛血清白蛋白、鱼肝油和酵母提取物等。
4. 抗体染色：将待测蛋白质与特异性抗体结合，形成免疫复合物。
常用的标记物包括酶标记、荧光标记和金标记等。
5. 信号放大：为了提高检测灵敏度，常使用信号放大剂来增加信号强度。
常用的信号放大剂包括多聚物和酶促反应等。
6. 显色：最后将样品显色，以显示出目标蛋白质在组织或细胞中的分布和表达情况。
常用的显色剂包括DAB、AP和HRP等。
免疫组化的原理是利用特异性抗体与待测蛋白质结合，形成免疫复合物。
该技术可以检测细胞和组织中的蛋白质表达，以研究它们在生理和病理过程中的作用和变化。
免疫组化技术的应用范围广泛，包括肿瘤诊断、药物研发和疾病机制研究等。
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免疫组化操作步骤（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2. 水浴锅（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L.2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。
3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH调至ph8.0,加水至1000ml.4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至ph8.0, 加水1000ml。
5. 酶消化液：a. 0.1%胰蛋白酶：用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。
b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制7.风裱剂：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（ph9.0–9.5）等量混合b 油和TBS(PBS)配制8．TBS/PBS PH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟b 无水乙醇中浸泡五分钟c 95%乙醇中浸泡五分钟d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：A 抗原热修复a 高压热修复在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。
将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。
10分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。
此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
b 沸热修复电炉或水浴锅加热0.01枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10-15分钟。
c 微波炉加热在微波炉里加热0.01枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。
适用的抗原Bcl-2. Bax. AR. PR. C-fos. x-jum. z-kit. c-myc. E-cadherin. ChromograninA. Cyclin. ER. Heatshock. Protein.HPV.Ki-67.MDMZ.P53.P34.P15.P-glycoprotein.PKC.PCNA.ras.Rb.等B 酶消化方法常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。
胰蛋白酶使用前预热37℃，消化时间约为5-30分钟。
适用于被固定遮蔽的抗原：包括Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.C-erB-2.LCA.LN.等3、免疫组化染色SP法（1）脱蜡、水化（2）PBS洗2-3次各5分钟（3）3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上，室温静置10分钟（4）PBS洗2-3次各5分钟（5）抗原修复（6）PBS洗2-3次各5分钟（7）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体（8）滴加Ι抗50μl,室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时（9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟（10）PBS洗3次每次2分钟（11）滴加Ⅱ抗45-50μl,室温静置或37℃1小时（12）Ⅱ抗中可加入0.05%的tween-20.（13）PBS洗3次各5分钟（14）DAB显色5-10分钟，在显微镜下掌握染色程度（15）PBS或自来水冲洗10分钟（16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化（17）自来水冲洗10-15分钟（18）脱水、透明、封片、镜检。
4、SABC法（1）脱蜡、水化（2）PBS洗2次各5分钟（3）用蒸馏水或PBS配制新鲜的3%H2O2，室温封闭5-10分钟，用蒸馏水洗3次（4）抗原修复（5）PBS洗5分钟（6）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体（7）滴加Ι抗50μl,室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时（8）PBS洗3次各2分钟（9）滴加生物素化Ⅱ抗，20℃-37℃ 20分钟（10）PBS洗3次各2分钟（11）滴加试剂SABC 20℃-30℃ 20分钟（12）PBS洗4次各5分钟（13）DAB显色：试剂盒或自配显色剂显色（14）脱水、透明、封片、镜检。
免疫组化问题解答1、染色过强a 抗体浓度过高或孵育时间过长降低抗体滴度、抗体孵育时间：室温1小时或4度过夜b 孵育温度过高超过37度一般在室温20-28度c DAB显色时间过长或浓度过高显色时间不超过5-12分钟，以显微镜下观察为准2、非特异性背景染色a 操作过程中冲洗不充分每步冲洗3次每次5分钟b 组织中含过氧化物酶未阻断可再配置新鲜3%H2O2封闭孵育时间延长c 组织中含内原性生物素正常非免疫动物血清再封闭d 血清蛋白封闭不充分延长血清蛋白封闭时间3、染色弱a 抗体浓度过低、孵育时间过短提高抗体浓度、孵育时间不能少于60分钟b 试剂超过有效使用时间应更换试剂c 操作中添加试剂时缓冲液未沥干每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液使试剂稀释（应防止切片干燥）d 室温太低低于15度要改放在37度孵育箱孵育30-60分钟或4 度冰箱过夜e 蛋白封闭过度封闭不要超过12分钟4、染色阴性a 操作步骤错误应重试设阳性对照b 组织中无抗原设阳性对照以验证试验结果c 一抗与二抗种属连接错误仔细确定一抗二抗种属无误免疫组化操作要点及技巧（1）固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。
对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。
有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。
Bouin S固定液：饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。
PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。
适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
（2）组织脱水，透明：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。
（3）切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。
（4）烤片：60℃ 30分钟或37℃过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。
（5）蜡块及切片的保存：最好在4℃保存（6）脱片问题：Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml 的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。
如不行，可用双重处理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。
在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。
（7）灭活内源性酶：HRP系统：3%双氧水灭活；AP系统：3%HAc灭活。
（8）暴露抗原：对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度(不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书)。
对于不同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。
胶原还可以用胃蛋白酶消化等。
（9）封闭：在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时间或用浓缩血清封闭（10）抗体稀释：应遵循“现用现配”的原则，对于PBS稀释的抗体一定要当天使用。
（11）背景高：在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下，如果背景依旧高，可采用含1‰ Tween20的PBS洗，特别是在显色之前要多洗。
（12）返蓝：在苏木素复染后，可用碱性缓冲液（如PBS）或Na2HPO4的饱和溶液返蓝。
（13）显色：一定要在显微镜下观察，注意控制背景。
（14）在整个操作过程中，切片千万不能干燥，否则会有非特异性染色。
（15）拍照1)更换样品时，除了调整焦距和视野外，显微镜上的其他部件都不能动！所有的样品必须一次拍摄完全。
特别是在拍摄过程中，不要一会用高倍镜，一会用低倍镜，来回切换物镜。
2)数码相机必须设置为手动曝光，并且保持每张照片用同样的曝光条件，同样的曝光时间，同样的光圈。
特别要注意的是，一定要将数码相机的自动白平衡功能给关掉3)免疫组化切片一般染色不太深，因此拍摄出的照片颜色较浅，就让它浅。
拍摄出的照片中空白部位应尽可能呈现纯白色。
测量其灰度应在250左右。
如果呈现淡蓝色，一般是相机自动白平衡在起作用。
另外一个因素是显微镜灯光电压不正确。
要使灯光本身的色温正确。
既不偏黄，也不偏蓝。
免疫组化技术的关键问题1.组织处理恰当的组织处理是做好免疫组化染色的先决条件，也是决定染色成败的内部因素，在组织细胞材料准备的过程中，不仅要求保持组织细胞形态完整，更要保持组织细胞的抗原性不受损或弥漫，防止组织自溶。
如果出现自溶坏死的组织，抗原已经丢失，即使用很灵敏的检测抗体和高超的技术，也很难检出所需的抗原，反而往往由于组织的坏死或制片时的刀痕挤压，在上述区域易出现假阳性结果。
1) 组织及时取材和固定组织标本及时的取材和固定是做好免疫组化染色的关键第一步，是有效防止组织自溶坏死，抗原丢失的开始，离体组织应尽快的进行取材，最好2h内，取材时所用的刀应锐利，要一刀下去切开组织，不可反复切拉组织，造成组织的挤压，组织块大小要适中，一般在2.5cm×2.5cm×0.2cm，切记取材时组织块宁可面积大，千万不能厚的原则，(也就是说组织块的面积可以大到3cm ×5cm，但组织块的厚度千万不能超过0.2cm，否则将不利于组织的均匀固定)。
固定液快速渗透到组织内部使组织蛋白能在一定时间内迅速凝固。
从而完好的保存抗原和组织细胞形态。
对于固定液的选择，原则上讲，应根据抗原的耐受性来选择相应的固定液，但除非是专项科研项目，在病理常规工作很难做到这一点，因为病理的诊断和鉴别诊断都是在常规HE病理诊断的基础上决定是否进行免疫组化的染色，而HE染色的常规组织处理是采用10%的中性缓冲福尔马林或4%缓冲多聚甲醛4倍于组织体积进行组织固定，利用其渗透性强，对组织的作用均匀进行固定，但组织固定时间最好在l2h内，一般固定时间不应超过24小时。
随着固定时间的延长对组织抗原的检出强度将逐渐降低。
2) 组织脱水、透明、浸蜡组织经固定后进行脱水、透明、浸蜡和包埋。