免疫组化步骤
免疫组化实验步骤流程
免疫组化实验步骤流程1.样品制备：a.组织样品：从动物或人体获得的组织样品首先需要固定在福尔马林中，然后通过蜡包埋技术将组织固定在蜡块中。
之后，将蜡块切成薄片，然后将薄片分别放置于载玻片上。
b.细胞样品：将细胞悬浮液放置在载玻片上，并用福尔马林进行固定。
2.抗原恢复：固定的组织或细胞样品经过脱水和脱脂处理后，需要通过抗原恢复来揭示隐藏的抗原。
抗原恢复的方法可以是热处理、酶切或化学处理等。
3.形成蛋白结合位点：将载玻片上的样品用蛋白结合剂如牛血清白蛋白（BSA）、鱼胶或生物素素蛋白结合剂等进行封闭处理，以防止非特异性结合。
4.孵育抗体：a.主抗体：将特异性的首要抗体加入到样品中，与目标抗原结合形成抗原抗体复合物。
b.辅助抗体：添加荧光素或酶标记的次抗体，与主抗体结合，以扩大信号的产生。
5.洗涤：用缓冲液洗涤载玻片，以去除未结合的抗体和其他无关物质。
6.信号增强：a.酶标记的实验，为了增加信号强度，可以加入荧光素或发光底物。
b.荧光标记的实验，可以直接观察荧光。
7.显色：在酶标记的实验中，加入染色底物以产生可见的颜色，从而定位并显示目标抗原的存在。
8.盖玻片：在涂抹适当封片剂后，将载玻片盖上一片封片玻片，以保护样品并减少光的干扰。
9.显微镜观察：使用显微镜观察载玻片下的样品，并通过图像系统进行图像捕捉和分析。
10.结果评估：评估图像和数据以确定抗原的表达和分布情况。
根据实验目的，可以进行半定量或定量的数据分析。
需要注意的是，免疫组化实验中的条件、试剂和步骤会因实验目的不同而略有差异。
因此，在进行实验前需仔细阅读相关文献和制定适合的实验方案，以确保实验结果的准确性和可靠性。
免疫组化步骤
免疫组化操作方法一、脱蜡1. 将组织切片至于玻片加上，65°C烘箱烘烤2-4小时，是石蜡完全熔融。
2. 将烘烤充分的切片迅速置入二甲苯中，浸泡10min；取出切片沥干，置入第二缸二甲苯中，浸泡10min；取出切片沥干，置入第三缸二甲苯中，浸泡10min。
3. 从二甲苯中取出切片，尽量沥干二甲苯，置入无水乙醇中，浸泡3min；取出，置入第二缸无水乙醇中，浸泡3min；取出切片，再依次置入90%、80%、70%酒精中梯度水化，各浸泡3min。
（切片脱蜡复水目前仪器自动完成）4.，PBS冲洗2-3次，每次3-5min，3% H2O2室温孵育20分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
二、抗原修复（以EDTA(PH 8.0/9.0)为例，常用的还有枸橼酸)1. 用流水冲洗切片1-2min，洗净切片表面的酒精；取出切片，用蒸馏水润洗切片表面2-3次，每次3-5min。
2. 将切片置入已经在电饭煲（沸水浴）中预热充分的EDTA中，持续水浴煮沸20min，再将电饭煲切换至保温档保温10min。
（实际操作：微波炉高火8min*2）3. 取出修复盒，使其自然冷却至室温。
三、封闭1. 取出切片，将切片至于玻片架上，用蒸馏水润洗表面的EDTA 3次，每次3min。
2. 用PH7.2的PBS缓冲液浸泡组织3次，每次3-5min。
3. 将切片从玻片架上取出，用手甩去玻片上PBS缓冲液，并用吸水纸吸取组织外围的缓冲液（注意擦拭方式，以防抹掉玻片上的组织）。
4. 将切片置于湿盒上，滴加5%的BSA，37°C培养箱孵育30-40min（或4°C冰箱孵育过夜）。
四、一抗孵育1. 取出切片，将切片至于玻片架上，用蒸馏水润洗表面的BSA 3次，每次3min。
2. 用PH7.2的PBS缓冲液浸泡组织3次，每次3-5min。
（大多数时候步骤1. 2 不做，可直接擦拭干净BSA 滴加稀释好的一抗）3. 按照一定的稀释比例，用抗体稀释液稀释抗体。
免疫组化主要步骤
免疫组化主要步骤1. 洗载玻片:将载玻片置于重铬酸钾和浓H2SO4混合液中,目的是为了是载玻片上的硅胶等除去,同时使一些肉眼看不见的凹凸不平的表面变平整,便于组织吸附,然后置于清水中清洗,除去残余的重铬酸钾和浓H2SO4(大约冲一个小时左右),再将载玻片浸泡于酒精之中, 然后放到架子上,置于37°C温箱中，将多聚赖氨酸涂布于玻片的表面，由于Lys带正电，而大多数的组织带负电荷，从而产生吸附作用。
2. 包埋组织:先在铁模具中加入一些液态石蜡，先稍微冷却，然后再将待包埋的组织置于石蜡之中，并排列整齐，再将塑料模具盒盖上，最后加入少许液体石蜡，进行冷冻，使石蜡变成固态。
3. 切片：将包埋好的组织从模具上取下来，并置于石蜡切片机上，切片机通过调节上下左右来来使组织和切割方向一致，然后调节切片的厚度，一般为5µm,如果比较难切，则可以适当调整厚度，用毛笔将切割的载玻片向外拉，并用小镊子将包含有完整组织的载玻片置于40°C温水中。
4. 捞组织：当组织载玻片置于40°C温水中之前，要先将水浴中的气泡赶走，以免气泡受热上浮而贴到组织上，组织受热展开，最好是组织不起皱纹，用载玻片捞组织时，一般取载玻片的下1/3或者下1/2一般每种组织捞5-6张，其中2-3张是备用的，每张载玻片上通常捞两份组织，做对照使用，这样形成的误差就比较小了，而且捞载玻片的时候最好方向一致，以便观察，再将捞出来的载玻片置于架子上，放入37°C温箱中烘干。
5. 脱蜡：依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，起脱蜡作用的主要是二甲苯,依据的是相似相溶的原理.一般在每个试剂中放10min,天气热可以少放几分钟,相反,天气较冷的话,就要适当延长脱蜡时间,一般为12-15min.6. 抗原修复：脱蜡后在清水中冲洗一段时间，加入3%H2O2浸泡10min，从而除去内源性的过氧化氢酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中蒸煮3min（中火），一般刚到沸腾即可，冷却至室温，然后再蒸煮一次，冷却至室温，蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。
免疫组化的操作流程
免疫组化的操作流程免疫组化是一种在细胞或组织中检测特定抗原或抗体的方法。
免疫组化广泛应用于医学诊断、生命科学研究和药物研发等领域。
下面是免疫组化的操作流程。
1.样本处理：首先，需要准备待检测的样本。
样本可以是组织片、细胞悬液或液体样本（如血清或尿液）。
对于组织样本，通常需要固定、切片和脱水等处理步骤，以保持细胞和组织的结构和形态。
2.抗原修复：组织样本中的抗原通常会在固定处理过程中被破坏或失活。
为了恢复抗原的免疫反应性，需要进行抗原修复步骤。
常用的抗原修复方法包括加热诱导抗原修复和酶诱导抗原修复。
3.抗原检测：制备好的样本可以用于检测抗原。
抗原检测通常通过选择与目标抗原特异性结合的一组试剂，如特异性抗体或亲和素。
这些试剂将与待检测样本发生特异性结合，从而形成特定的抗原-抗体结合物。
4.一次抗体结合：首先，将样本与一次抗体结合。
一次抗体是与目标抗原结合的特异性抗体。
待检测样本与一次抗体一起孵育，使其与目标抗原发生特异性结合。
5.洗涤：为了去除未结合的一次抗体和其他非特异性结合物，需要进行洗涤步骤。
洗涤可以用缓冲液溶液进行多次重复，以确保样本的纯净性。
6.二次抗体结合：接下来，需要将与检测物发生特异性结合的二次抗体与样本反应。
二次抗体是与一次抗体特异性结合的抗体。
这些二次抗体通常与标记物结合，如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）等。
7.洗涤：与一次抗体结合后，需要再次进行洗涤步骤，以去除未结合的二次抗体和其他非特异性结合物。
8.标记物探测：二次抗体中的标记物将通过检测技术进行可视化。
最常用的检测技术是酶联免疫吸附实验（ELISA），其中酶标记物与底物反应产生可见的颜色变化。
其他常用的标记物包括荧光染料、生物素-链霉亲和素等。
9.观察和分析：最后，需要使用光学显微镜或显微镜等工具观察标记物，并进行结果分析。
可以根据标记物的位置、数量和强度等进行定量和定性的分析。
总之，免疫组化操作流程包括样本处理、抗原修复、抗原检测、一次抗体结合、洗涤、二次抗体结合、洗涤、标记物探测和观察分析等步骤。
免疫组化法实验操作步骤
免疫组化法实验操作步骤以下是免疫组化法的标准实验操作步骤：1.样本准备：a.获取待检样本，例如组织切片或细胞悬液。
b.将样本固定，常用的固定剂包括福尔马林、乙醇和乙酸等。
c.进行脱水和石蜡包埋，以便于后续切片。
2.制备切片：a.用切片机将固定的样本切成薄片，通常为4-6微米。
b.将切片平均分配在载玻片上。
3.制备蜡块：a.将切片放入烘箱中进行去蜡，以去除切片上的石蜡。
b.用乙醇对切片进行脱水然后重新水化。
c.将切片放入热稳定耐热塑料材料中，通常为硝酸纤维素薄膜等。
4.抗原恢复：a.使用高温高压（如压力锅或蒸汽炉）进行抗原恢复，以改善抗体与抗原的结合效率。
b.根据实验需要选择适当的抗原恢复缓冲液，如磷酸盐缓冲液（PBS）、EDTA缓冲液或三氯醋酸缓冲液等。
c.将切片放入抗原恢复缓冲液中进行恢复处理。
5.抗体处理：a. 选择适当的一抗（primary antibody），根据目标蛋白质的性质选择单克隆或多克隆抗体。
b.将一抗稀释至适当浓度，根据抗原的强度调整抗体浓度。
c.将一抗加入样本上共孵育，使抗体与目标蛋白质发生特异性结合。
d.对于一些抗体，可以使用辅助试剂如牛血清蛋白、牛血清、胶原蛋白等增强结合效果。
6.清洗：a.用PBS或其他合适的缓冲液冲洗切片，以去除未结合的一抗。
b.重复冲洗步骤多次，以充分去除未结合的抗体。
7.检测标记：a.选择适当的检测标记，如酶（如辣根过氧化物酶，HRP）、荧光染料或金标记等。
b.将标记物加入到一抗与抗原结合的位置上，以形成可视的标记。
8.染色：a.若使用酶标记物，则使用特定底物进行染色，产生颜色反应。
b.若使用荧光标记物，则观察荧光信号。
9.显微镜观察：a.使用适当的显微镜观察切片，记录和分析结果。
b.对于荧光标记，可以使用特定的荧光染色剂如DAPI进行细胞核染色。
10.结果分析：a.根据实验设计和目的，对结果进行定性或定量分析。
b.可以使用图像分析软件进行影像处理和数据分析。
免疫组化步骤和注意事项
免疫组化步骤和注意事项免疫组化是一种重要的实验技术，用于鉴定细胞、组织或生物样本中特定抗原的分布和表达情况。
它可以通过对特定抗原与抗体的特异性结合来检测目标分子的存在和定位。
下面将介绍免疫组化的步骤和注意事项。
免疫组化的主要步骤包括抗原脱蜡、抗体反应、显色和染色。
1. 抗原脱蜡：免疫组化的第一步是将组织样本或细胞脱脂、脱蜡和重水化，以去除蜡质，并使抗体更容易与目标抗原反应。
2. 抗体反应：将脱蜡的组织样本或细胞块通过抗原修复处理，以恢复抗原的免疫反应性。
然后，将免疫抗体与待检测的抗原反应，形成免疫复合物。
免疫抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，可以与组织或细胞中的特定抗原高度特异性地结合。
3. 显色：免疫复合物形成后，可以使用标记有酶（如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）或荧光标记的二抗来检测免疫复合物。
在酶法中，可添加草酰胺基苯酸（DAB）或硫代硝基羟基苯并啶（NBT/BCIP）等底物以产生可见的色素沉积。
在荧光法中，免疫复合物被激光器或荧光灯激发后，会发出特定颜色的荧光信号。
4. 染色：完成显色后，可以通过核染色（如用伊红、伊红和伊蓝）来观察细胞核的形态特征，以配合免疫标记物的定位。
虽然免疫组化是一种有价值的技术，但在实施过程中也需要注意一些问题：1. 选择合适的抗体：在进行免疫组化实验时，选择特异性高、效价好的一抗抗体非常重要。
一抗抗体的选择应基于抗原的特异性和病变的病理生理特性。
2. 优化抗体浓度：免疫组化实验中，抗体浓度的选择是关键因素。
过高的抗体浓度会导致非特异性的染色，而过低的浓度则无法检测到目标抗原。
3. 优化抗原修复处理：抗原修复处理对于免疫组化的成功非常重要。
选择合适的抗原修复方法可以增强组织或细胞中的抗原的免疫反应性。
4. 阴性对照和阳性对照：为了验证实验的可靠性，每次免疫组化实验都应包括阴性对照和阳性对照。
阴性对照不包含待检测的抗原，而阳性对照则确保抗体和显色试剂的正常工作。
5. 切片质量：免疫组化实验的结果直接受到切片质量的影响。
免疫组化相关步骤
免疫组化相关步骤免疫组化（immunohistochemistry，IHC）是一种基于抗原抗体反应的方法，用于检测组织或细胞中其中一种特定蛋白质的表达。
下面将详细介绍免疫组化的相关步骤。
免疫组化的步骤包括样品制备、抗原修复、阻断、一抗反应、二抗反应和染色，具体如下：1.样品制备：首先，需要获取组织标本。
通过活体组织切片、细胞涂片或冷冻切片等方法制备标本。
制备好的标本需要保持完整和有代表性，通常要求切片不超过5μm厚。
2.抗原修复：组织切片在固定过程中会损害抗原的完整性，因此需要进行抗原修复，以恢复抗原的表达。
常用的抗原修复方法包括热解修复（如加热、压力煮等）和酶解修复（如胰蛋白酶消化等）。
3.阻断：组织切片会与非特异抗体结合，影响免疫反应的特异性，因此需要进行阻断。
常用的阻断方法包括用牛血清白蛋白（BSA）或奶粉进行阻断，以防止非特异性背景信号的产生。
4.一抗反应：将含有特异性抗体的试剂加到组织切片上，使其与目标抗原结合。
特异性抗体可针对不同的抗原进行选择，如研究一些蛋白质的表达，可以选择该蛋白的特异性抗体。
5.二抗反应：一抗与抗原结合后，需要加入与该一抗来自不同物种的二抗。
二抗通常是免疫出来的，其与一抗结合后，可形成复合物，具有荧光或酶标记。
6.染色：最后，通过染色方法来显示抗原的表达。
染色可以是荧光染色或酶标染色。
荧光染色利用特定颜料对特异性标记的抗体进行荧光标记，并在荧光显微镜下观察。
酶标染色则使用酶标记的二抗，再加入相应的底物进行染色。
除了以上的基本步骤1.控制组：为了验证实验是否准确，通常需要设置阴性和阳性对照组。
阴性对照组通常是替代一抗的种属、浓度和机制抗体；阳性对照组是已知具有目标蛋白表达的组织切片。
2.负载密度和反应时间：一抗的负载密度和反应时间需要优化，以确保对目标蛋白的增强标识，同时最大限度地减少背景信号。
3.显微镜观察和图像分析：观察染色结果时，要选择合适的显微镜，以获得清晰的图像。
免疫组化详细步骤
免疫组化步骤取组织、固定、制片（脱水、透明、浸蜡、包埋）、切片、烤片、抗原修复、滴加抗体一、取组织二、固定三、制片1、脱水透明的酒精梯度和时间70%酒精20min 80%酒精1h90%酒精1h 95%酒精Ⅰ2h95%酒精Ⅱ2h 无水乙醇Ⅰ15min无水乙醇Ⅱ15min 无水乙醇Ⅲ15min二甲苯酒精1:1 15min 二甲苯Ⅰ25min二甲苯Ⅱ25min 二甲苯Ⅲ15min2、浸蜡：石蜡融化后，在石蜡Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各浸蜡1h3、包埋四、切片烤片用切片机切片，取完整组织切片放于37℃温水中展片，取完整组织于载玻片上，并放入到60℃的烤箱中烤6个小时五、脱蜡至水六、抗原修复配置柠檬酸抗原修复液于微波中煮沸，在高压锅内放入自来水煮沸（不盖锅盖），将装有煮沸的抗原修复液的烧杯置于高压锅内，将水化后的玻片放入煮沸的抗原修复液中，盖上锅盖，待其压力达到最大时维持三分钟七、取出玻片，水浴逐渐降温直至完全冷却八、将玻片放置于塑料板上，滴加3%的过氧化氢室温孵育10min，以阻断内源性过氧化氢酶，10min过后PBS冲洗2次×3分钟九、除去PBS（甩干或者吸水纸吸干），每张切片滴加第一抗体（稀释相应倍数），4℃过夜十、PBS冲洗3次×2分钟，除去PBS液，每张切片滴加聚合物增强剂，室温孵育10min十一、PBS冲洗2分钟×3次，除去PBS，每张切片滴加酶标抗兔聚合物，室温孵育10min十二、PBS冲洗2分钟×3次，除去PBS，每张切片滴加新配制的DAB（二氨基联苯胺），室温孵育2~10分钟，显微镜观察十三、苏木精复染：苏木精复染5min，水洗3min，0.1%HCl浸提两次，水洗3min，反蓝液数秒，水洗十四、脱水透明：70%酒精3min、80%酒精3min、90%酒精3min、无水乙醇3min、二甲苯Ⅰ3min、二甲苯Ⅱ3min十五、封片。
免疫组化法实验操作步骤
免疫组化法实验操作步骤步骤一：取材固定1.将需要处理的组织或细胞样本，如切片或离心沉淀等，放置在含有适当浓度的固定试剂（如4%的中性缓冲甲醛）中，使其固定。
2.这一步的目的是保持蛋白质的结构和形态，使其对后续步骤的抗体反应更加稳定。
步骤二：脱水和包埋1.将样本从固定试剂中洗涤，并逐渐转移到乙醇溶液中，以脱水。
2.将样本转移到适当浓度的透明剂（如甲基丙烯酸甲酯）中，使其透明化。
3.最后，将样本包埋在合适的固化剂（如尼龙、蜡、树脂等）中，以便后续的切片操作。
步骤三：切片和烘干1.使用组织切片机将样本以适当的厚度切成切片。
2.将切片放置在加热平台上，烘干以去除切片中的水分。
步骤四：抗体处理1.使用适当的抗体稀释液将抗体与切片接触。
抗体可为一抗或二抗，具体选择取决于实验需求。
2.将切片放置在含有抗体的湿润孵育盒中，使其与抗体反应。
孵育温度和时间取决于抗体的要求，一般在4℃下孵育过夜。
步骤五：洗涤1.将切片取出，并置于洗涤缓冲液中，用于去除未结合的抗体。
2.反复洗涤3-4次，每次至少5分钟，确保切片完全清洗。
步骤六：标记1.添加适当浓度的二抗，如辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，与已经结合的一抗反应。
2.孵育切片与二抗共反应，孵育温度和时间根据试剂的要求进行。
步骤七：显色和染色1.使用合适的显色剂将切片进行显色。
常见的显色剂有DAB（二氨基联苯氧化物）和VIP（有机磷染料）等。
2.彩色染色可根据实验需求进行，可以使用核染料如伊红、快速伊红等对细胞核进行染色。
步骤八：石蜡去除和封片1.将切片浸入去石蜡溶液中，去除石蜡。
2.使用适当稀释的巴豆胶溶液将切片封闭，确保切片在显微镜下观察时保持湿润。
步骤九：显微镜观察1.将封片放置在显微镜载物台上，使用适当放大倍率的显微镜观察切片。
2.观察切片的染色情况、抗体标记的结果等，记录并进行分析。
这些是一般的免疫组化法实验操作步骤，根据具体实验需求和试剂要求，可能会有一些细微的差异和额外的步骤。
免疫组化超详细步骤
免疫组化超详细步骤免疫组化是一种常用的实验方法，用于检测细胞或者组织中特定的分子，如蛋白质、核酸和糖等。
下面是免疫组化的详细步骤：1.样本准备：a.细胞或组织准备：首先需要获取细胞或组织样本，可以通过培养细胞或直接取得组织切片。
b.保存和处理：细胞或组织样本需要保存在合适的液体中，如福尔马林或液氮，以保证样本的完整性和保存时间。
c.切片：对于组织样本，需要将其切割成薄片，常用的方法是冰冻切片或石蜡包埋切片。
2.抗原的暴露：a.反应原位：对于固定的细胞或组织样本，可以直接进行免疫组化实验。
b.透化处理：对于未固定的细胞或组织样本，需要进行透化处理，以使抗体能够穿透细胞膜或组织间隙。
3.抗原检测步骤：a.抗原恢复：有时，抗原可能会受到固定或透化处理的损伤，需要进行抗原恢复步骤。
常见的方法有热处理、酶消化和抗体消除等。
b.阻断非特异性结合：为了减少非特异性结合，需要对样本进行阻断处理，可以使用一些蛋白质，如牛血清白蛋白（BSA）或鱼胶。
4.抗体标记检测：a.一抗：选择特异对应抗原的一抗（原抗体），将其加入到样本中，与样本中的特定抗原结合。
b.二抗：将含有特异对一抗的二抗（辅助抗体）标记的溶液加入到样本中，与一抗结合。
二抗通常会与荧光染料、酶或金颗粒等标记结合。
5.洗涤：a.用缓冲液洗涤样本，以去除未结合的抗体和其他非特异性的结合物。
6.反应可视化：a.荧光标记：对于荧光染料标记的样本，可以通过荧光显微镜观察到标记物的信号。
b.酶标记：对于酶标记的样本，需要使用合适的基质使酶产生染色反应，并通过显微镜观察到染色的结果。
7.整理和分析：a.包装：用透明性的封片将样本封装，以便保存并观察。
b.分析：使用显微镜分析样本的结果，例如观察染色的细胞或组织的形态、信号定位等。
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免疫组化：链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法
1)将石蜡切片置于烤片机烘烤２－３h,{因为做石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，所以应烤片2-3h,除非组织的抗原性较稳定，则时间可长一点}后可把烤好的组织切片，放在60℃烤箱中过夜，最佳时间控制在14-18h{乳腺病理处省略此步骤}。
取组织切片于切片架，用吹风机吹至产生蜡液，不可靠太近，以免使组织切片局部温度过高，破坏组织切片。
2）常规脱蜡 ({二甲苯脱蜡，在夏天，室温较高，脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5分钟就已足够。
如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较陈旧，则脱蜡时间需要延长，10-20分钟或更长}二甲苯I 20min →二甲苯II 20min→二甲苯Ⅲ20min →无水乙醇10min（清洗二甲苯）→无水乙醇10min→95%乙醇5min→80%乙醇5min) {梯度酒精用无水酒精与蒸馏水配置}
目的：把水渗入组织切片中，给细胞创造一个水溶性环境
<以下步骤是为细胞染色做准备>
3）捞出，放入铁缸内，用凉清水冲洗3次{如果组织容易脱片，就尽量泡一下，这样脱片可以减少很多}；
4）将配好的柠檬酸盐抗原修复液（抗原修复液的量为稍高于横向放倒的切片架的高度）{EDTA配制方法：EDTA修复液使用比例：EDTA:蒸馏水=1:49,每次最好配制1000ml。
EDTA修复液重复使用最好不要超过5次，并且3次之后要测PH值，测PH是否为9.0，如偏离太大则弃用。
枸橼酸修复液只能用一次。
修复的原因：因为常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得抗原性物质形成醛键，羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇。
另外，蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
在染色时，要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态}{用EDTA修复比柠檬酸容易脱片，但是你要用到EDTA的时候也可，因其抗原修复效果比柠檬酸盐的好，可从另外的问题上着手}灌入高压锅中，不旋紧，盖上即可，210℃烧至沸腾后，把切片架放入横向放倒，旋紧锅盖，待喷气时，开始计时2min-2min30s,如果组织不易染色，可延长修复时间，但一般不超过3min，否则容易掉片。
5）到时间后，把高压锅放入水池中用凉水冲至气体放出完，旋下锅盖，自然冷却至室温，大于30min。
6）冷却后取出切片架用凉清水冲洗3次，放入3% H2O2 罐中10min，目的：封闭过氧化物酶。
【每天用前新放入10ml H2O2 】【配制方法：1000ml 3%的过氧化氢=100ml 30%过氧化氢+900ml蒸馏水，（H2O2保存需避光）】
7）捞出后用凉清水冲洗多次，应注意H2O2 有腐蚀性，最后一次用PBS（磷酸盐缓冲液），PBS 暂不倒掉，泡片子，拿去加血清封闭。
8）拿切片架，取出切片擦拭组织周围水分{防止标本染色过程中出现干片，这容易增强非特异性着色}，山羊血清{封闭血清一般是和二抗同一来源的，但不能与一抗来源一致，非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果}封闭10min，一张片约50ul，盖过组织，到时后去血清，加一抗，盖过组织，可用枪头划匀抗体至组织边缘以外，防止边缘效应。
抗体稀释液（绿色）与抗体配比量（1:50或1:100）{需要预实验摸浓度}，一般要多配取几张片子的量，以免不够。
9）放入37℃孵箱2h{一抗孵育温度一般37度2h }或者4℃冰箱过夜。
放入4℃冰箱过夜效果更好，过夜时间最好为14-16h。
{注意：防止组织干片}
9-1）从37℃孵箱中拿出，用PBS冲洗3次，每次约3－５min。
9-2）从4℃冰箱取出后放在室温下复温30min{一抗4度过夜和从冰箱拿出后37度复温
45min，使抗原抗体结合更稳定。
一般不需要，但对表达较弱的抗原可能有用}，到时后用PBS冲洗3次，每次约3－５min。
{应先倒去罐中之前的PBS，用新PBS清洗。
防止之前其他抗体洗过后，与自身的抗体产生交叉污染}
10)用吸水纸把切片组织周围的水擦去，直接加入二抗（黄色），盖过组织，放入37℃孵箱{二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索}，孵育2５min.
11) 从37℃孵箱中拿出，用PBS冲洗3次，每次约3－５min。
12）用吸水纸把切片组织周围的水擦去，直接加入辣根过氧化物酶（红色），盖过组织，放入37℃孵箱，孵育20min.
12）从37℃孵箱中拿出，用PBS冲洗3次，每次约3min。
13）取空管，配DAB液。
{DAB显色液配制：1mlDAB底物液加一滴浓缩DAB液,如本次做20张组织切片，共需DAB底物液为:20×50ul=1000ul=1ml,再加一滴浓缩DAB液）}用吸水纸把切片组织周围的水擦去，用移液管，滴DAB显色剂{①DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，若为阳性，在加入DAB液后很快显出浅棕色，显色时间﹤10min。
若不呈阳性，显色时间不能超过10min。
②DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间③此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间④DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4度过夜）；另一方面就是封闭时间过长}，盖过组织,待显色后立即装入切片架入放入盛水的缸中，用凉清水冲洗多次。
14）放入苏木精罐复染{染色深则分化时间稍长些即可；染色浅则再置于苏木素中染色即可}>3min,实际约５－10分钟
15）再用凉水冲洗组织切片
16）放入1%盐酸酒精{分化作用，置于盐酸酒精中数秒（一定动作要快，防止染色不深；分化的颜色过浅，可以复置于苏木素中染色）}中涮一下，立即捞出，用凉水冲洗{1%的盐酸
酒精分化液配制：浓盐酸（即36%-38%盐酸）：1ml, 75%乙醇：99ml}
17）再放入氨水罐涮一下，目的：返蓝，立即捞出，用凉清水冲洗。
{0.2%氨水（PH值在7.5-8之间）配制：氨水（质量百分浓度25%-28%）：0.2ml, 自来水:100ml}
18）脱去细胞中的水分
（80%乙醇10min→95%乙醇10min→无水乙醇10min）→
（二甲苯10min →甲苯10min）目的：使组织切片变透明，便于镜下观察
19）捞出，用树脂封片，一滴/张,在其上盖上小玻片
20）封好的组织切片，放入超净台中，打开抽风，冲一段时间，最后把切片放在窗台上凉2-3天，就可收起来。
免疫组化的试剂：主要由100％二甲苯，梯度酒精（100、95、80％）、PBS/TBS、3%双氧水、抗体封闭剂、酶底物(DAB常用)、苏木素、盐酸酒精、中性树胶、蒸馏水、柠檬酸修复液等。
酶底物DAB:DAB是HRP组化敏感底物，有致癌性，味苦涩。
ＡＱＰ１：一抗是兔抗人抗体
二抗是羊抗兔抗体
β-catenin：一抗是鼠抗人β-连接素单克隆抗体，Ig分类是IgG1
血清：羊血清
器材：铁磁缸、切片架、滴管、加样枪、枪头、切片架、镊子、高压锅。