生物化学-生化知识点_蛋白质分离和纯化(7章)
生物蛋白质分离知识点归纳总结
生物蛋白质分离知识点归纳总结蛋白质分离是生物化学和分子生物学研究中的重要技术。
它涉及到从复杂的生物样本中提取、纯化和分析蛋白质。
以下是对蛋白质分离技术的一些关键知识点的归纳总结：1. 蛋白质分离的原理：- 分子大小：利用不同蛋白质的分子量差异，通过凝胶过滤层析进行分离。
- 电荷差异：通过离子交换层析，根据蛋白质在不同pH值下的电荷差异进行分离。
- 疏水性：利用疏水相互作用层析，根据蛋白质的疏水性强弱进行分离。
- 亲和力：通过亲和层析，利用特定配体与目标蛋白质的亲和力进行分离。
2. 常用的蛋白质分离技术：- 凝胶过滤层析（Size Exclusion Chromatography, SEC）：根据蛋白质的大小进行分离，大分子先流出，小分子后流出。
- 离子交换层析（Ion Exchange Chromatography, IEC）：根据蛋白质的电荷差异进行分离，正电荷的蛋白质在低pH下吸附，负电荷的蛋白质在高pH下吸附。
- 疏水相互作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC）：根据蛋白质的疏水性进行分离，疏水性较强的蛋白质先被吸附。
- 亲和层析（Affinity Chromatography）：利用特定的配体与目标蛋白质的高亲和力进行特异性分离。
- 电泳技术：如SDS-PAGE，根据蛋白质的分子量进行分离。
3. 蛋白质分离的策略：- 预处理：包括细胞破碎、蛋白质提取和初步纯化。
- 多步骤纯化：通常需要通过多种层析技术组合，逐步提高蛋白质的纯度。
- 分析与鉴定：利用质谱等技术对纯化后的蛋白质进行鉴定和定量分析。
4. 蛋白质分离的影响因素：- 蛋白质的稳定性：在分离过程中需要考虑蛋白质的稳定性，避免变性或降解。
- 缓冲液的选择：缓冲液的pH值、离子强度和组成都会影响蛋白质的分离效果。
- 温度和压力：温度和压力的变化会影响蛋白质的折叠状态和相互作用，进而影响分离效果。
蛋白质的性质及分离和纯化课件
利用这个性质，可以对蛋白质进行定性 鉴定和定量测定。
蛋白质的性质及分离和纯化课件
蛋白质的呈色反应
蛋白质分子中肽键可与某些试剂发生显色反 应，且产生的有色物质与蛋白质浓度相关， 氨基酸则不出现此反应。此特性可用于蛋白 质定性、定量检测，如双缩脲反应。
蛋白质的性质及分离和纯化课件
5.生物碱试剂沉淀反应
生物碱试剂是一些酸，如苦味酸等 蛋白质在pH小于其等电点时带正电荷，
可以与生物碱试剂结合，形成不溶性蛋 白质沉淀。 应用：血液样品分析中无蛋白滤液的制 备
蛋白质的性质及分离和纯化课件
变性和沉淀的关系
两者既有联系，又有区别：
变性蛋白质通常都是沉淀，但也有的不沉 淀。
蛋白质的沉淀作用
蛋白质沉淀的概念：蛋白质分子 聚集而从溶液中析出的现象。
蛋白质的性质及分离和纯化课件
蛋白质的沉淀作用
等电点沉淀法 中性盐析沉淀反应 有机溶剂沉淀反应 加热沉淀反应 重金属盐沉淀反应 生物碱试剂沉淀反应
蛋白质的性质及分离和纯化课件
1.中性盐析沉淀反应
盐析作用：高盐时，因破坏蛋白质的水化层并中 和其电荷，促使蛋白质颗粒相互聚集而沉淀，这 种现象称盐析作用。 机理：破坏蛋白质的水化层并中和其电荷，因 而促使蛋白质颗粒相互凝聚而沉淀。
实验只要测得几种标准蛋白质的洗脱体积，以 它们的分子质量的对数对Ve作图得一直线，再 测得样品的Ve ，即可从图中确定蛋白质的相对 分子质量
优点：待测样品可以不纯。
蛋白质的性质及分离和纯化课件
蛋白质的性质及分离和纯化课件
蛋白质的性质及分离和纯化课件
③ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
生化——蛋白质分离纯化技术.
二、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀法
丙酮沉淀：在0~4℃时，用10倍于蛋白质溶 液体积的丙酮加入到蛋白质溶液中，形成 沉淀后，立即分离，防止蛋白质变性 盐析：在溶液中加入中性盐使生物大分子 沉淀析出的过程称为“盐析”，它属于沉 淀法，目的是将所需要的蛋白质转入固相 沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分 离 免疫沉淀法：利用特异抗体识别相应抗原 蛋白质，以形成复合物从而分离蛋白质
上某种电荷基团形成的。
-+ -+
+
高分子聚合物基质
-
电荷基团
平衡离子
(2) 凝胶过滤（gel filtration chromatography）
凝胶层析是按照蛋白质分子量大小 进行分离的技术，又称之凝胶过滤、 分子筛层析或排阻层析
Gel filtration. This method separates proteins according to size.
蛋白质的分离、纯化和结构分 析
2401120102 黄嵩
蛋白质分离指利用其理化性质，
采取透析、盐析、电泳、层析以 及超速离心等不损伤蛋白质空间 构象的物理方法，以满足研究蛋 白质结构域功能的需要
一、透析和超滤法可除去蛋白质溶液中的小分 子化合物
利用透析袋分离蛋白质的方法叫透析发，透析袋是 具有超小微孔的膜，一般只允许分子量为10kD以下 的化合物通过，高分子蛋白则留在袋内
外水体积、内水体积、基质体积、柱床体积、洗脱体积 柱床体积为Vt 外水体积为Vo 内水体积为Vi 基质体积为Vg， 则有： Vt＝Vo＋Vi＋Vg 由于Vg相对很小，可以 忽略不计，则有： Vt＝Vo＋Vi
五、超速离心分离
超速离心法即可以用来分离纯化蛋白质也可 以用来测定蛋白质的分子量 蛋白质在高达50万g(g为gravity)的重力作用 下，在溶液中逐渐沉降，直至其浮力等于离 心力时，沉降停止 蛋白质在离心场中的行为用沉降系数表示
(精选)蛋白质分分离纯化和表征
五、蛋白质分离纯化的一般原则
根据分子量：如沉降速度法离心 根据密度：沉降平衡法离心 根据电荷和分子量：聚丙烯酰胺凝胶电泳 根据分子量和分子形状：凝胶过滤 根据溶解度：硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级沉淀 根据电荷：等电点沉淀
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六、蛋白质的分离纯化方法
（一）根据分子大小不同的分离纯化方法
沉降系数（Ｓ20,w）：单位离心场强度时的
沉降速度。定义1Ｓ＝10-13秒（斯维得贝格单
位）。
其中:
Mr = RTS÷D(1－Vρ)
S:是沉降系数 D:是扩散系数 ρ:是溶剂的密度
v:是蛋白质的偏微分比容。
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• 沉降平衡法
将纯的分析样品放于离心池中，进行 低速度长时间 离心，样品颗粒沉降形成浓度差， 而扩散又使样品 颗粒由高浓度区向低浓度区扩散, 最终达到沉降与扩 散的平衡状态。
凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分 离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大 的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之 间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来； 比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝 胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速 度较慢，最后被洗脱出来。
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（二）利用溶解度差别的纯化方法
影响蛋白质溶解度的外部因素很多，其中主要 有：溶液的pH、离子强度、介电常数和温度。溶 解度归根结底取决于他们本身的分子结构。
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1. 双缩脲法
双缩脲法是基于蛋白质分子中的肽键，凡具 两个以上肽键的物质均会发生双缩脲反应。
在碱性溶液中蛋白质可以与Gu2＋形成紫红色 络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正
比，而与蛋白质的分子量和氨基酸组成无关。
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2. 福林－酚法
福林－酚法主要基于蛋白质在碱性溶液中能与铜 形成复合物，此复合物以及芳香族氛基酸残基可 以还原酚试剂而产生蓝色，再与标准蛋白质(通常 采用牛血清白蛋内)比色定量。
(生物化学)蛋白质分离纯化技术
蛋白质分离纯化技术摘要：蛋白质分离纯化是蛋白质产品工业化生产的关键之一。
本文分析了蛋白质分离纯化的特点及一般原则；综述了蛋白质分离纯化的传统技术：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、疏水作用层析、高效液相色谱层析(HPLC)、电泳法等及新型技术：亲和超滤、内含肽介导的蛋白质亲和纯化。
关键词：蛋白质分离纯化蛋白质是生命的物质基础,是生命活动的最终控制者和直接执行者,它参与生物体内几乎所有的生命活动过程,如生长、发育、遗传、代谢、应激、能量转换、信号传导等。
以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向。
对蛋白质进行纯化，得到高纯度的"高活性的蛋白质是生物学科研人员经常要面对的问题。
蛋白质的分离纯化主要包括4个步骤：预处理、蛋白质的抽提、蛋白质的粗分级和蛋白质的分离纯化[1]。
本文针对近年来有关蛋白质的分离纯化技术所取得的进展进行了综述,为今后的理论和应用研究提供依据。
1 蛋白质分离纯化的特点及一般原则1.1蛋白质分离纯化的特点1）大多数蛋白质产品是生物活性物质,在分离纯化过程中,有机溶剂、溶液pH值、离子强度的变化均可使蛋白质变性失活。
2）蛋白质产品在物料中含量很低,且物料组成非常复杂。
例如,利用基因工程菌发酵生产蛋白质,物料中含有大量组成复杂的培养基、菌体生产代谢物等,目标蛋白质的含量常常不到蛋白质总量的1%。
有些目标蛋白质存在于细胞内或在胞内形成包含体,为获取蛋白质,还需进行细胞破碎,结果物料中含有大量的细胞碎片和胞内产物。
3）含蛋白质产品的物料不稳定,蛋白质产品易受料液中蛋白水解酶降解。
4）很多蛋白质产品作为医药、食品被人类利用,因而要求蛋白质产品必须是高度纯化的,产品无菌、无致热源等[2]。
1.2蛋白纯化的一般原则1）蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。
蛋白质的分离纯化.ppt
logMr
三、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 法测定相对分子质量
聚丙烯酰胺凝胶电泳，（简称PAGE），也称 圆盘电泳，它以聚丙烯酰胺凝胶（单体丙烯 酰胺Arc和交联剂甲叉双丙烯酰胺Bis共聚而 成）为支持物 。
蛋白质颗粒在各种介质中电泳时，它的迁移率
决定于它所带的电荷以及分子大小和形状(电 荷效应、分子筛效应)。
v =沉降速度（dx/dt）
s
=
—ω—v2x——
ω=离心机转子角速度（弧度/s） x =蛋白质界面中点与转子中心的
距离（cm）
沉降系数的单位常用S，1S=1×10-13（s）
蛋白质分子量（M）与沉降系数（s）的关系
M = —D—（—1R－—TsV—ρ）—
R—气体常数（8.314×107ergs·mol -1 ·度-1） T—绝对温度 D—扩散常数（蛋白质分子量很大，离心机 转速很快，则忽略不计） V—蛋白质的微分比容（m3·g-1） ρ—溶剂密度（20℃，g·ml-1） s—沉降系数
二、凝胶过滤法测定相对分子质量
凝胶过滤原理
分子筛色谱 （凝胶过滤）
利用Andrews的实验经验式：
logMr = a/b—Ve/bVo
Ve（elution volume）为某一溶质组分的洗脱 体积。它是自加样品开始到该组分的洗脱峰 （峰顶）出现时所流出的体积。
V0 (outer volume)为外水体积，即存在于柱床 中凝胶珠外孔隙的水相体积。测定出不能被 凝胶滞留的大分子溶质如蓝色葡聚糖—2000 的洗脱体积可以决定V0。
在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质 胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白 质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不 可能再重新溶解于水。
由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性 质的变化，所以又称为变性沉淀。
生物化学课件-蛋白质及其分离纯化共15页文档
21、静念园林好，人间良可辞。 22、步步寻往迹，有处特依依。 23、望云惭高鸟，临木愧游鱼。 24、结庐在人境，而无车马喧；问君 何能尔 ？心远 地自偏 。 25、人生归有道，衣食固其端。
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
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《蛋白质分离、纯化》PPT课件
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带网孔的 葡聚糖珠
小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层整析理ppt过程示意图
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凝胶的前处理
溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸 泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上 层悬浮物及蒸馏水。
碱洗：用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然 后用蒸馏水洗至中性。
a 是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不能 相差太大（小数点后2位）；最常用为3.0-10.0范围，还有3.0-7.0、5.010.0。 b 混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列； c 混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、 多羧基的脂肪族化合物； d 要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。
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蛋白质鉴定
蛋白质鉴定主要包括以下几个方面：
➢蛋白质纯度鉴定 ➢蛋白质分子量及等电点测定 ➢蛋白质氨基酸组成及顺序分析 ➢蛋白质结晶与结构分析 ➢蛋白质免疫印迹（Western-blotting）鉴
定 ➢蛋白质生物活性及功能测定
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• （一）蛋白质纯度鉴定：
目前最常用的蛋白质纯度鉴定为电泳法， 电泳后的凝胶经过染色脱色后，用目标蛋 白质条带占整个泳道蛋白质条带的百分比 来表示目标蛋白的纯度。
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一、凝胶层析
• 又叫分子筛层析。
分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天 然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不 同规格。
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凝胶层析
• 原理： 1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱 液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物 质迁移速度快； 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部， 所以小分子物质迁移速度慢。
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1.10 蛋白质分离和纯化 P290 7章
①①①蛋白质分子量测定：
①1①根据化学组成测最低分子量：
1.肌红蛋白、血红蛋白均含铁0.335%，分别求它们的最低分子量：
肌红蛋白为55.8（Fe原子量）÷0.335×100=16700，与其他方法测分子量相符。
血红蛋白含铁也是0.335%，最低分子量也为16700，但用其他方法测分子量为68000，即每一个血红蛋白含有4个铁原子，由此计算更为准确分子量为：16700×4=66800。
2.由氨基酸含量计算：
如牛血清清蛋白含Trp0.58%，蛋白质最低分子量为35200；每一牛血清蛋白含有2个Trp，所以分子量为70400，比其他方法测出的准（69000）。
①2①沉降系数和沉降系数单位：
蛋白质分子在溶液中受强大离心力作用时，蛋白质分子沉降，沉降速度与蛋白质分子大小和密度、分子形状等有关，可用于测分子量。
沉降系数：蛋白质颗粒在单位离心场的沉降速度是个定值，称为沉降系数或沉降常数用s表示。
s常用来近似描述生物大分子的大小，蛋白质、核酸、核糖体和病毒的沉降系数介于1×10-13到200×10-13sec范围，见293 表7-4。
为方便起见，把10-
13sec作为一个单位,称为svedberg（斯维得贝格）单位或沉降系数单位，用S表示，如人的Hb沉降系数为4.46S，即为4.46×10-13sec。
①①①蛋白质胶体性质与蛋白质的沉淀：
蛋白质溶液属胶体系统，分散相质点大小1~100nm。
蛋白质可用盐析，有机溶剂沉淀，生成重金属盐、加生物碱和某些酸类（如三氯乙酸）进行沉淀；蛋白质加热变性也会沉淀。
①①①蛋白质的分离纯化：
①1①前处理：将蛋白质从动、植物或细菌的组织或细胞中以溶解状态释
放出来，并保持天然状态，不丢失生物活性，如用适当缓冲液提取蛋白质
，离心除去杂质。
①2①粗分离：将蛋白质提取液中所需要的蛋白分出，除去其他杂蛋白、
核酸和多糖等。
1.等电点沉淀和pH控制：
等电点沉淀：改变蛋白质溶液pH，使蛋白质净电荷为零处于等电点，相邻蛋白分子间无静电斥力，溶解度最低，蛋白保持天然构象聚集沉淀。
P305 图7-10 pH和离子强度对β-
乳球蛋白溶解度的影响，等电点为pH5.2~5.3，溶解度最低。
由于不同蛋白有不同等电点，也可将一些蛋白质混合物分开。
2.盐溶和盐析：
盐析：当溶液中盐浓度增大，离子强度达一定数值时，蛋白质溶解度下降并进一步析出。
盐析蛋白保持天然构象，能再溶解。
一般用硫酸铵盐析，硫酸铵在水中溶解度高，且溶解度的温度系数较低。
盐溶：当加入低浓度中性盐时，蛋白质溶解度增加。
①3①细分级分离：
一般用层析法和电泳法。
1.电泳：在外电场作用下，不处于等电状态的带电颗粒（如蛋白质分子）
将向着与其电性相反的电极移动的现象称为电泳。
电泳迁移率或泳动度（μ）：为单位电场强度下，蛋白质分子在溶液中的移动速度。
μ = υ/E υ：颗粒泳动速度，E：电场强度
常用的电泳种类：
①区带电泳：在支持物上电泳时，蛋白质混合物被分离成若干区带。
①薄膜电泳：使用醋酸纤维薄膜和聚酰胺薄膜。
①凝胶电泳：凝胶有分子筛效应，可更好分离。
如常用的聚丙烯酰胺
凝胶电泳（PAGE）。
①毛细管电泳（HPCE）：毛细管散热好，有助于消除热引起的对流和
区带变宽；系统高分辨力，进样量少，可分离手性化合物。
①等电聚焦电泳：具有不同等电点的两性电解质载体在电场中自动形
成pH梯度，使被分离物移动至各自等电点的pH处，聚集成很窄的区带。
分辨率高，适于分离分子量相同而电荷不同的两性分子。
pH梯度制作：可利用两性电解质，已有商品出售。
2.亲和层析：是利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法，可一步
提纯。
根据生物分子与特定固相化配体（Ligand）之间的亲和力不同，而使生物分子在一种特制的具有专一吸附能力的吸附剂上进行层析。
例如将酶的底物或抑制剂接到固体支持物上（如琼脂糖），制成专一吸附剂，并装在层析柱中。
当含有这种酶的溶液通过层析柱时，酶就会被吸附，而其他蛋白质则不被吸附先流出；然后再用适当缓冲液将吸附在柱上的酶洗脱下来。
①4①结晶：
结晶为蛋白质纯度一个标志，也是判断制品处于天然状态指标。
蛋白质纯，则易结晶，为分离提纯最后步骤。