cDNA全场扩增解析
PCR基因扩增技术原理及特点
PCR基因扩增技术原理及特点基因扩增技术（PCR）聚合酶链反应（polymerase chain reaction简称PCR）又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是基因扩增技术的一次重点革新。
PCR扩增DNA的原理是：先将含有所需扩增分析序列的靶DNA 双链经热变性处理解开为两个寡聚核苷酸单链，然后加入一对依据已知DNA序列由人工合成的与所扩增的DNA两端邻近序列互补的寡聚核苷酸片段作为引物，即左右引物。
此引物范围就在包含所欲扩增的DNA片段，一般需20—30个碱基对，过少则难保持与DNA单链的结合。
引物与互补DNA结合后，以靶DNA单链为模板，经反链杂交复性（退火），在Taq DNA聚合酶的作用下以4种三磷酸脱氧核苷（dNTP）为原材料按5到3方向将引物延长、自动合成新的DNA 链、使DNA重新复制成双链。
然后又开始第二次循环扩增。
引物在反应中不但起引导作用，而且起着特异性的限制扩增DNA片段范围大小的作用。
新合成的DNA链含有引物的互补序列，并又可作为下一轮聚合反应的模板。
如此重复上述DNA模板加热变性双链解开引物退火复性在DNA聚合酶作用下的引物延长的循环过程，使每次循环延长的模板又加添1倍，亦即扩增DNA产物加添1倍，经反复循环，使靶DNA片段指数性扩增。
PCR的扩增倍数Y=（1+E）n,这里Y是扩增量，n为PCR的循环次数。
E为PCR循环扩增效率。
设PCR扩增效率E为100%、循环次数n=25次，靶DNA将扩增到33554432个拷贝，即扩增3355万倍：若E为80%、n=20、则扩增数量将下降到1408865拷贝，即扩增产物约丢失93%，若E=100%，n=20，则扩增数量减少1048576个拷贝，扩增产物约减少97%。
可见PCR循环扩增效率及循环次数都对扩增数量有很大影响。
PCR扩增属于酶促反应，所以，DNA扩增过程遵从酶促动力学原理。
靶DNA片段的扩增最初表现为直线上升，随着靶DNA片段的渐渐积累，当引物模板/DNA/聚合酶实现肯定比值时，酶的促化反应趋于饱和，此时靶DNA产物的浓度不再加添，即显现所谓平台效应。
全长cDNA酶切和连接体系
用测序时所构建的各片段重组质粒作模板，用新合成的加有连接酶切位点的引物扩增出需要连接的各片段。
LF1在扩增时，由于片段比较长，故分为两步进行扩增，第一步扩增后，连接到pMD-18T载体上，再用此作模板进行第二次扩增。
得到所需的加有酶切位点和启动子序列的目的片段，再将其克隆到pMD-18T载体上。
使用时每次从载体上切取目的片段进行连接。
F5、F6和F7片段的连接，F5(Not I/ Fsp I)、F6(Fsp I/Csp45 I)、F7(Csp45 I/Sal I)分别进行酶切，将载体pGEM5zf同时进行Not I/Sal I双酶切，分别将各酶切产物进行纯化回收。
由于F5片段和载体pMD18-T大小相近，故无法回收酶切后的目的片段，所以F5片段直接采用酶切buffer F5用buffer D、F6用buffer B、F7用buffer DF21和F22的连接，将F21和F22 PCR测序片段分别用Nhe I酶切后，回收目的条带，将二者用T4 DNA酶连接后，克隆到T-easy载体上。
即为连接全长所用的F2片段。
连接时，直接用设计时的两端酶切位点。
LF3和LF4同样用Acc III酶切后，用T4 DNA连接酶连接，再克隆到pMD-18T载体上，用于5’半长的连接。
F21、F22连接酶切体系：Nhe I 1µl；10×M buffer 2µl；DNA 17µl；F3、F4连接酶切体系：Acc III 1µl；10×F buffer 2µl；BSA 0.2µl；DNA 16.8µl。
37℃3h酶切。
纯化回收时，注意各种限制性酶的灭活(65℃,10min)。
连接体系：T4 DNA连接酶buffer 2µl；T-easy(F2) or pMD-18T(F34) 2µl；回收DNA片段15µl；T4 DNA连接酶1µl。
cDNA+末端快速扩增技术(+RACE)+的优化与改良
cDNA末端快速扩增技术(RACE)的优化与改良李关荣1,2,鲁 成2,夏庆友2,向仲怀2(1.西南农业大学农学与生命科学学院,中国重庆 400716;2.西南农业大学蚕学与生物技术学院,中国重庆 400716)摘 要:cDNA末端的快速扩增(RACE)法是延伸已知部分外显子序列和克隆全长cDNA基因的主要方法之一.广泛用于许多已知功能基因片段的进一步延伸和全长cDNA的克隆.但由于其过程复杂、涉及多步连续的酶促过程,如反转录、Td T加尾、第二链合成、RACE-PC R扩增及RACE产物克隆等,在实际应用中有许多问题和相当难度.主要针对RACE各步骤中存在的问题进行了分析,并对其优化和改良进行了综述.关键词:cDNA末端的快速扩增法;优化;改良中图分类号:Q781 文献标识码:A文章编号:1007-7847(2003)03-0189-09The Optimization and Improvement of Rapid Amplificationof cDNA Ends(RACE)LI Guan-rong1,2,LU Cheng2,XIA Qing-you2,XIANG Zhong-huai2(1.College of Agronomy and Li f e Sciences,Southwest Agricultu ral University,Chon gqin g400716,China;2.College o f Sericultu re an d Biotechnology,Southwest Agricultura l Un iversity,Chon gqin g400716,China)Abstract:Rapid amplification of cDNA ends(RAC E)is one of the main methods for extending partially known e xon sequence and cloning of its ful-l length cDNA.It has been widely used in further extending of functional fra gments of genes of interests especially the cloning of the ful-l length cDNAs.RACE involves multiple enzyme-catalyzed processes,such as reverse transcription,TdT tailing,the sec ond-strand cDNA synthesis,RACE-PCR a mplification and the cloning of RACE products,which in practice have many problems and difficulties.These problems are analyzed in depth and the optimiza tions and improvements on each of the processes are revie wed. Key words:RACE;optimization;improve ment(Life Science Research,2003,7(3):189~197)cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)是扩增在mRNA的3 -末端或5 -末端的未知序列和已知部分外显子序列间的核酸序列的方法.此种单边特异性的扩增又称为 单边PC R (One-sided PC R)或锚定PCR(Anchored PC R).通常扩增复杂混合物中相对较少的目标分子的PCR要求扩增序列段的两个序列特异性引物,但为了扩增和鉴定未知序列区域,此种要求就构成了严重的局限.3 -和5 -RACE法提供了解决此问题的可能方法.这两种方法的结合可望获得全长cDNA基因.1 RAC E技术的原理及步骤3 -RACE利用mRNA3 -末端天然存在的Poly第7卷 第3期2003年9月 生命科学研究Life Science ResearchVol.7 No.3Sep.2003收稿日期:2003-04-01;修回日期:2003-08-08基金项目:国家自然科学基金资助项目(30070580)作者简介:李关荣(1963-),男,四川营山人,西南农业大学副教授,博士,主要从事生物化学与功能基因克隆研究,Tel:+86-023-********,E-mail:lgrxn@(A)尾作为PCR扩增的通用引发点.首先用反转录酶和Oligo-dT接头引物对mRNAs进行反转录,使之转换为cDNA.然后,用一个能与已知外显子序列区退火的基因特异引物(GSP)和定位在Poly(A)尾部的接头引物直接进行PCR,扩增特异cDNA.这样,就能捕获位于外显子和Poly(A)尾之间的未知3 -mRNA序列.5 -RACE是一种从低拷贝信息中分离和鉴定5 -末端未知序列的方法.Frohman和Loh都综述过此法[1,2].尽管不同的使用者采用的具体的步骤略异,但策略是一致的.第一链cDNA的合成使用基因特异的反义寡核苷酸(GSP1)引发,使特异的mRNA及其相关家族转换为c DNAs,使完全延伸到5 -末端的潜力达到最大.第一链cDNA产物经纯化,去除未渗入的dNTPs和GSP1,用末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)在cDNA的3 -末端加同聚尾[poly(T)或Poly(C)].最初,加尾后的cDNA用3个引物的混合物(在GSP1的3 -末端退火的基因特异性引物GSP2、互补的含同聚尾的锚定引物和相应的接头引物)进行PC R扩增.这使mRNA的5 -末端和GSP2间的未知序列得以扩增.RACE方法多用于传统cDNA克隆方法不易检测或挑战性极大的稀有mRNA的扩增和克隆. RACE也可用于已有的cDNA文库.随机六聚体引发合成的c DNA也曾用于5 -RACE从单一第一链反应中扩增和克隆了多个基因.RACE产物可直接测序,勿需任何中间克隆步骤;或用于制备探针.3 -RACE和5 -RAC E的产物可以结合得到全长cDNA.RACE法还可与外显子捕获法结合鉴定未知编码区序列.RACE法的重要特征是在PCR中使用一个根据mRNA的已知序列而设计的基因特异引物(GSP)和一个与mRNA的Poly(A)尾互补的 通用引物 (3 -RACE)或与添加在cDNA的3 -末端的同聚尾互补的 通用引物 (5 -RAC E).因同聚物不是良好的PCR引物,为了便于RACE产物的克隆,通用引物的5 -末端常引入一个限制性位点.用于RACE-PCR的cDNA模板可用Oligo-dT引物(3 -和5 -RACE),也可用与mRNA中的已知序列互补的引物(仅5 -RACE).在RACE-PCR产物复杂时,可取一等分的产物用第二个(在第一个引物内)特异的引物和原来的通用引物进行第二轮PC R,此为所谓的Nested PCR.2 RACE步骤的优化和改良2.1 反转录影响RACE结果的最关键步骤是mRNA的反转录合成第一链cDNA.这在克隆全长mRNA的5 -末端时尤其突出,因为不完全的cDNA仍然可以用TdT加尾和其后被PCR扩增.这些不完全分子与全长分子具有相同的末端,它们和全长分子都可以在PCR中扩增.这些不完全cDNA的存在,极大降低甚至不能产生代表全长cDNA的PCR产物,因为在有异质和具相同末端底物的PC R反应液中,较小的DNA分子较易发生扩增[3].因此,应当优化反转录过程,尽可能地避免不完全cDNAs的产生,因而必须使用高质量的、未被降解的mRNA.常用一步分离法[4],从组织或少量组织培养细胞中提取总RNA,对于大量的组织培养细胞,可采用胞质RNA制备方法制备[5].还有人建议用oligo(dT)-cellulose或用试剂盒纯化RNA,去掉非腺苷酸化的RNAs.使用poly(A)-mRNA可以避免含内含子序列的c DNAs的产生和克隆.如果材料足够,可用与RACE等量的RNA样品进行电泳、Northern印迹.用已知cDNA序列做探针检测,以证实目的序列存在且并未明显降解.但是,即使高质量的mRNA,在反转录过程中也会产生许多不完整的cDNAs.通常认为,这种切短的cDNAs的产生是由于反转录酶在有稳定的二级结构的mRNA区不能继续进行聚合反应所致[6]. GC AU比率高的转录本及含有稳定的二级结构区,更有可能产生切略了的cDNAs.在反转录过程中降低mRNAs二级结构稳定性的一个有效方法是在反应前提高反应混合物的温度(37~42 ).嗜常温的反转录酶(AMV-RT和MMLV-RT)只能在低于大约50 的温度下起作用.现已有热稳定的DNA聚合酶,可以在很高的温度下(60~70 )有活性.在此温度下,RNA的二级结构不稳定,反转录可以更容易进行到mRNA分子的5 -末端.在某些条件下,可以反转录mRNA的嗜热DNA聚合酶主要有rTth(PE公司)和TetZ(Amersham).甚至Taq酶也有表现出反转录酶活性的报道.虽然r Tth酶较嗜常温的反转录酶对二级结构不敏感[7],但也有不足.首先,r Tth主要是一个DNA 指导的DNA聚合酶,其最适温度在70 ,与嗜常温的反转录酶的操作温度相比,更有利于DNA的去稳定.因此,更有可能引发污染的基因组DNA发190 生 命 科 学 研 究 2003年生延伸.DNA的污染问题可以通过用RNase-free DNase进行预处理而很容易避免[8].其次,高于15 min的反转录反应,在最适聚合酶活性所要求的高温和二价阳离子(Mn2+)的存在下,由于RNA的快速水解,偏向于产生切略的cDNAs.部分降解的RNAs分子可以引发反转录,产生不完全的cDNAs.此种现象可能会导致rTth产生长于1kb的cDNA 的合成能力下降,因为长的延伸需要长的温育时间,而时间的延长又会增加模板降解(水解).因此,反转录的时间应控制在15min之内,需要反转录的区域应控制在最小长度.因此,在用RACE扩增、克隆5 -末端时,反转录应采用特异引物而不是oligo (dT),且此引物应尽可能定位在远离部分cDNA的5 -末端,以便保留足够的序列以设计两个PCR内引物和第3个检测特异PCR产物的Southern杂交区.另外,因为全长cDNA只有在酶分子和模板分子的比例为1或较高的情况下才能有效产生,在反转录反应中不应使用过量的RNA或cDNA引物.究竟多少量的RNA才会造成模板过剩,只能通过经验确定.有证据表明,对大多数方法中引物浓度可以在数个数量级内变化.2.2 TdT加尾和第二链cDNA的合成标准的RACE要求把第一链cDNA用TdT酶加上一个脱氧核糖核酸同聚尾[1,2,9].然后此同聚尾作为下步与锚多聚连接物杂交的底物.锚多聚连接物有一个3 -末端同聚物锚(N)15,可与cDNA的同聚尾互补,然后由锚(N)15引发第二链cDNA的合成.但此法也可能失败或促进无关产物的形成.为了使同聚加尾成功,反转录后自由的核苷酸和过剩的cDNA引物必须除去.如果自由的核苷酸未除去,它将被TdT加入到3 -末端cDNA尾中去,从而干扰互补同聚物尾与锚引物的杂交.如果不除去过剩的cDNA引物,其3 -末端将与c DNA末端竞争加尾,从而降低cDNA加尾的效率.加尾的cDNA 引物还可以与加尾的锚引物退火,与cDNA发生竞争,从而降低第二链cDNA合成的效率.这些小分子将会在下步用锚引物PCR反应中作为退火和延伸的底物,降低PCR的效率[10].为了去除过剩的自由核苷酸和引物,可采用分子排阻类方法如Centricon microc oncentrator(Amicon)[7].但更简便、更经济有效的方法是使用1 4体积的10mol L醋酸胺和3倍体积的100%的乙醇的两步沉淀法.5 -RACE加尾一个主要问题是所有的cDNAs,无论是不是全长,都被TdT加尾.一旦锚引物加到第二链合成中,这些切略了的cDNAs会在PCR中与全长产物竞争扩增[7].如果切略了的cDNA比全长cDNAs短得多的话,它们就可发生趋向性扩增[3],使得PCR反应不能积累足量的全长cDNA,因而不能检测到目的产物,降低这些切略了的cDNAs产生的唯一方法是优化反转录过程[7].另一个导致切略cDNAs产生的原因可能存在于第二链合成中.如果目标cDNA含有与anchor (N)15同聚尾互补的数个核苷酸构成的同聚物区,第二链合成就可从这个内部序列处引发,而不是从末端同聚区,从而会产生切略的第二链.Anchor(N)15的内部引发可以用许多方法克服.因为A T配对比G C配对的氢键要弱得多,使用A和T同聚物尾趋向于产生较少的内部引发[7,8].但是,对于富含AT的基因组中,anchor(N)15的内部引发率却较高[11].另一种降低非特异性的anchor (N)15引发的方法是在第二链合成中避免使用太多的引物或太低的杂交温度.2.3 加尾的其它替代方法上述加尾策略本身存在许多缺陷,有几个研究组独立地设计了RACE技术的改良方法以绕过cDNA的TdT介导的加尾.所有这些改良方法都使用RNA ligase以共价方式把寡核苷酸锚连在cDNA 的5 -末端[12~15]或直接连接在起始RNA群上[11,16,17].因此这些策略既可消除TdT加尾这一步,又可消除Anchor(N)15引发的第二链cDNA的合成.这样,Anchor(N)15的内部引发可能性就得以完全消除[15].在把Anchor直接连接在RNA上的方法中,从理论上讲,具有3 -末端anchor序列的任何切略cDNAs的产生都得以避免[11].有几个研究组发表了把DNA锚定寡核苷酸连接在cDNA上的方法[12~15].此种RACE变种通常称为锚连接PCR (Ligation-anchored PC R,LA-PCR)[12,13]或称单链cDNA末端的单链连接(Single-strand ligation to ss-cDNA ends,SLIC)[14,15].连接反应是通过T4RNA连接酶催化进行的,此酶具有连接单链脱氧核糖核酸和核糖核酸的能力[18].然后,使用特异的3 -末端引物和锚引物,连接了锚的cDNA可直接用于PCR 扩增,这与标准的RACE法相同.寡核苷酸锚在用于连接反应前,必须作两个修饰改变.首先,必须使其5 -末端磷酸化,才能使其成为T4RNA连接酶的底物[18].这可通过在合成寡核苷酸时或通过T4多核苷酸激酶和ATP的酶学方191第3期 李关荣等:cDNA末端快速扩增技术(RACE)的优化与改良法而完成[12];其次,寡核苷酸锚的3 -末端必须封闭,以避免形成寡核苷酸锚的串联体.这一种修饰也可以在体外合成中通过用已封闭了的氨基核苷酸类似物作为最后的碱基或在寡核苷酸合成后,用TdT介导的方法在其3 -末端加上一个双脱氧核苷酸[14,15]而实现;另一个要求是,c DNA合成使用的寡核苷酸必须具有一个5 -末端羟基,这样cDNA分子的5 -末端才不会成为RNA连接酶的底物[12,14]. cDNA合成后,RNA模板可通过化学方法用NaOH 在高温下处理降解.碱处理把RNA水解为带5 -OH 和3 -P或2 -P的核糖核苷酸,RNA的转化产物不是T4RNA ligase的底物[13].通过上述步骤除去或钝化了连接反应的所有竞争性抑制剂后,连接酶的唯一底物就只有寡核苷酸锚和cDNA分子的3 -OH.然后,连接了锚的c DNA就可用特异的3 -末端引物和锚引物直接进行PC R扩增.尽管LA-PCR避免了在第二链合成中由于第一链cDNA分子的内部同聚物与Anchor(N)15的退火产生的切略cDNAs,但其它产生切略cDNAs的途径仍存在.严格地讲,cDNA合成中产生的任何不完整的第一链cDNAs都将作为T4RNA连接酶的底物,都有寡核苷酸锚连在其3 -末端,PCR仍然可以扩增这些切略了的cDNAs.相反,RNA连接酶介导的RACE(RLM-RACE)[11],也称反转录连接介导PCR(RLPCR),可以避免所有5 -末端切略的产生.在此法中,RNA寡核苷酸锚序列被连接到mRNA的5 -末端.然后,此锚修饰了的mRNA反转录产生第一链cDNA,后者用3 -末端特异引物和一个DNA锚引物进行PCR 扩增[11,16,17,19],因为只有完全延伸为全长的cDNA 才具有3 -末端锚序列,在PCR中切略了的cDNA 将不会被扩增.切略cDNAs产生的唯一途径是在PC R过程中DNA锚引物的非特异性内部退火所致.此类问题可以通过仔细设计引物和调节PCR 参数而避免.在制备用于RLM-RACE的mRNAs时, mRNA必须用酶学或化学方法处理[16,17,19,20],除去共价交联在所有mRNA转录本5 -末端上的7-MeGppp帽子结构.化学方法去帽采用 -消除法: RNA通过用高碘酸钠 SDS和甘油的顺序处理而被氧化.氧化了的mRNAs然后用环己酰胺处理以去除7-Me G帽子.去帽后留在5 -末端的焦磷酸基团用CIP处理除去后,再用T4多核苷酸激酶和ATP 重新加上一个磷酸基团,使其5 -末端成为T4多核苷酸激酶的底物(5 -末端焦磷酸不是T4RNA ligase 的底物)[18].化学去帽的主要缺点是,降解的RNAs 和非mRNAs都可被多核苷酸激酶磷酸化,产生连接反应不需要的底物[11],非mRNAs将竞争RNA 锚引物,这可能导致mRNAs连接效率的降低.但更有害的是可能降解的mRNAs,其5 -末端也连有锚引物,在反转录时,此切略了的mRNAs会产生具3 -末端锚的切略的cDNAs,后者会在PC R中扩增.酶学方法去帽步骤少,避免了化学去帽的不足[11].RNA样品首先用碱性磷酸酶处理,除去所有降解了的RNAs和不具帽的RNAs的5 -末端磷酸基团[16,19],通过热钝化或用酚-氯仿抽提,使碱性磷酸酶失活后[16],其中的mRNAs用烟酸焦磷酸酶(TAP)处理去帽,此酶水解mRNA帽的三磷酸桥上的磷酸苷键[20].这样,TAP处理后,在去帽的mRNAs上留下了一个5 -P,因此只有具帽的mRNA 的5 -末端才转化成T4RNA ligase的底物.切略了的mRNAs却留下了5 -OH,锚引物不能与之连接.这样,只有未降解的mRNAs模板的全长cDNAs延伸产物的3 -末端才有锚引物序列[16].RNA寡核苷酸锚引物既可化学合成[16],也可通过用带有适当启动子(T7、T3和SP6)的线性化质粒模板的体外转录而合成[11,17].在这两种方法中,合成后的RNA寡核苷酸都不需要对其5 -末端进行修饰,因为体外转录产物已经具有了一个5 -末端PPP基团,而化学合成产物有一个5 -OH,它们都不是RNA ligase的底物.因此避免了RNA寡核苷酸锚的串联体的形成.从理论上讲,RNA寡核苷酸锚引物的长度不限,只要有数个核苷酸保证PCR 反应的特异性就行.通常用30nt长,只是要控制其内部二级结构的形成和与mRANs群体中的部分互补序列的退火,因为它们会造成连接反应的效率降低.设计RNA锚引物也应遵循通常的PC R引物设计原则.一旦设计和合成了适合的RNA寡核苷酸锚引物后,就可通过T4RNA ligase将其连接到磷酸化的mRNAs上去.有人曾报道,在连接反应中添加PEG 8000至终浓度25%可以增强连接效率.为了阻止mRNAs的环化,可在去帽前在其3 -末端加pCp[16]或用高碘酸钠处理RNA以除去3 -OH[17].在使用RLM-RACE扩增、克隆转录本的3 -末端的过程中,把DNA或RNA寡核苷酸锚连接到mRNAs分子的3 -末端.尽管DNA寡核苷酸在RNA 连接反应中不是有效的受体,但却是良好的供192 生 命 科 学 研 究 2003年体[18],因此,可采用更易操作的DNA锚替代RNA 锚.如果用DNA锚,则可简单地用T4多核苷酸激酶磷酸化后,然后用T4RNA ligase将之连接在mRNA的3 -末端上.反转录是由另一与连接上的锚完全互补的DNA寡核苷酸引发的,PCR使用锚互补部分作为3 -末端引物和一个与已知cDNA序列互补的5 -末端引物[11,17].因为3 -末端锚是连接在mRNA的尾部的,在整个RACE产物中都保留了完整的mRNA尾.因此,除了能够明确确定克隆的转录本的完整3 -末端外,还可获得转录本3 -末端的有关生化信息.感兴趣的研究者可以根据各个克隆确定Poly(A)尾的长度及其长度的变化.同时还可确定特定转录本中是否具有经典的多腺苷酸化信号[11,17].2.4 PCR扩增关于PCR扩增技术及其参数的优化有很多的文献论述,本部分重点讨论某些简化和增强PCR 重复性的参数以及在PC R中遇到的问题的克服. 2.4.1 PCR的忠实性问题cDNAs的PCR扩增中的一个值得考虑的重要问题是聚合酶的忠实性.因为RACE技术是为确定未知cDNA序列设计的,必须注意使在PCR中引入的突变最少.现已有具3 5 校对核酸外切酶活性的商品嗜热聚合酶可供使用,如pfu(Stratagene)和Vent(Ne w England Biolabs)等.在这两种酶中,p fu的忠实性最高,每掺入一个核苷酸的突变率为1.6 10-6[21].据报道,Taq聚合酶的核苷酸误掺频率为2.5 10-5,比p fu高12倍左右[21].pfu酶还具有特别高的热稳定性,在95 ,60min仍有95%的活性[21].因此,可使用更高变性温度和变性时间的PC R循环而不会明显影响其聚合酶活性.Barnes报道[22],p fu和Klen Taq1(一种遗传修饰了的Taq聚合酶)以1:15混合,其忠实性几乎与pfu本身一样高,扩增时间比两酶单独使用要高得多.因此认为,反应混合物中的少量的pfu足以除去此Taq酶所添加的误配碱基,进而继续推断,PC R扩增通常只限于10kb以内的模板,因为Taq酶过早地终止了引物的延伸.因此,当大于10kb的分子作为PCR 模板时,此种误掺发生频率太高,理想的产物不能有效扩增.p fu聚合酶的校对活性的加入足以克服此种障碍.为了增加PCR反应的产率和特异性,已经设计了一些方法,先把不含模板[23]或模板和聚合酶或活性酶的其它PCR组分混合,只有当混合物预热到引物退火温度以上时,再加入这些组分.有人认为此种 热启动 (hot start)法能防止在室温装配试剂过程中事先变性的模板与引物发生非特异性退火,从而改善引物与模板相互作用的特异性[23]. Taq聚合酶延伸模板的速度较慢,室温下每分钟约15nt[21],因此,非特异性的引物与模板退火或引物与引物配对,在试剂装配和进一步的PCR扩增中都会延伸,从而产生高背景的非特异性产物[23].因为p fu在低温下的聚合酶和外切酶活性低得可以忽略[21],所有PC R的反应组分都可在冰上(或在处于4 的PCR仪)上装配,而不必担心非特异退火的引物或引物与模板被此酶的3 5 校对核酸外切酶活性的降解.由于pfu具有高耐热性,初始变性温度高达98 ,5min,而不会引起酶活性明显降低,尽管长的变性时间可导致PCR模板的损害.因此整个反应混合物都可在严谨的条件下变性,然后立即冷却到适宜温度,使引物退火和延伸.这样,模板的复性和非特异性引物的退火均达到最小化.2.4.2 引物的设计引物设计是另一个对PCR结果有重大影响的参数.PC R技术的使用者有许多经验规则,但却无实验证据[3].但还是有几个基本的规律和计算方法,能使研究者成功地设计出产生理想的PCR产物而无或低背景的引物.引物的正确设计与扩增分子的长度有某种依赖性,200~400bp的长度在PCR中扩增效率最高.许多设计算不上很好的引物,在此大小范围内仍能扩增出理想的产物[3].因理想的全长RACE产物的大小在PCR进行前大都未知,设计的引物应当尽可能符合许多优化参数.首先,应避免使用3 -末端有互补性的引物对,以防止引物二聚体的形成.即使3 -末端仅有几个互补碱基,仍可产生引物二聚体,因为Taq酶延伸引物速度快;同时,还应避免使用3 -末端有自我互补的引物,因此种引物将会以自己为模板而延伸.另外,所有PCR引物的3 -末端应设计为不稳定,以使从非目标部位引发降到最低.在目的位点杂交的稳定性是由引物的5 -末端和中部区域决定的,引物是连续延伸的.相反,如果引物与非目的位点序列有短的互补,不稳定的3 -末端在这个短暂杂合未结束前,不可能非特异性地退火和被延伸.Rychlick根据最近邻核苷酸分析创建了一个DNA双链形成的自由能值表,这些值可用于估算给定序列的DNA双链的稳定193第3期 李关荣等:cDNA末端快速扩增技术(RACE)的优化与改良性.Rychlick建议一个特异引物的3 -末端的5个碱基的稳定性不能超过-9kcal mol,这就是说,3 -末端的5个碱基不能超过两个G或C.他还建议,对于小于500bp的位点的扩增,引物长度应保持较短(16~18nt),而长的位点(5kb)的扩增应用较长的引物(大约20nt).尽管这些原则在使用含有克隆接头引物时,难以达到,但与目的分子互补的引物区应控制在16~18nt范围内.引物的GC AT比率要尽可能接近模板的GC AT比率.虽然RACE目的位点的大多数碱基对组成未知,但其GC AT比率却可以通过已知cDNA序列或目的基因组的GC AT比率而估算.2.4.3 PCR参数PC R参数显著影响特定PCR扩增的成败,特别是目的位点的大小有数千个碱基时[22].变性循环必须有足够高的温度和足够的时间,才能至少使目的分子的小段成功变性.从理论上讲,要实现最佳的PCR效率,只有所有的目的分子在每个变性循环中都变性才可能.但是,特别值得考虑的是, DNA脱嘌呤的速度随温度的升高和pH的降低而升高.在PCR中,在25 ,pH8.3的Tris buffer,当温度达到94 以上时pH将降低(在95 时pH值将降到6.1).当遇到一个脱嘌呤点时,Taq酶就不能继续延伸引物[22].据Barnes计算,PCR扩增目标在kb级或更小范围内脱嘌呤发生明显.因此,变性次数(时间)应当控制在成功PC R的最小要求内.94 ,10s这样短的变性循环曾用于成功扩增20kb以上的目的片段,加入助溶剂如甘油、DMSO 改进了这些实验的产率,这可能是由于降低了解链温度的原因.Cheng等也指出,PCR反应中高温的危害性,可通过使用在变性循环中pH稳定的PCR buffer而减低[27].如果使用一个温度系数比Tris小的buffer(如Tricine,Bicine,EPPS),在变性中就可以采用较高的温度,脱嘌呤的发生就会降低.对一特定PCR引物对,有许多计算理想杂交温度的公式[24,25].据报道,理想的杂交温度的计算也要求采用模板核苷酸的最近邻分析[3].但是,他们认为,如果引物设计适当,使其3 -末端不稳定,引物退火的最适温度范围相当宽.Schaefer发现,即使是最简单的退火温度估算公式:[2 (A T)+4 (G C)]-5=T Hyb对大多数引物都很适用[26].在此公式中,引物退火温度通过赋予每个A或T2 和每个G或C4 来计算.然后杂交温度计为低于退火温度的5 [24].在可能的情况下,最好使用退火温度相当的引物对.Cheng等报道,当使用退火温度为68 的引物时,变性温度为94 、退火 延伸温度都为68 的双温热循环效果都很好[27].在扩增目的片段时,一般每个kb需要延伸1min,尽管对于数个kb的目的片段的扩增,可能要求更长的延伸时间.在目的片段大小不清的RACE扩增中,要求的最大延伸时间可以通过Northern杂交中mRNA 转录本的大小估算.2.4.4 增加特异性除非RAC E克隆的目的c DNA很丰富,一次PC R扩增,通常不能产生足以用于克隆的理想产物.在RACE中,产生的许多非目的cDNAs的5 -末端都有锚定引物序列,这与使用两个特异的引物的PC R相比,RACE-PCR扩增的效率要低些,因为有相当量的锚定引物消耗在与非目的cDNAs序列的退火和后来的延伸中.非目的单链cDNAs的积累,增加了特异3 -末端引物的非特异性退火和聚合酶延伸的可能性,从而产生可在以后的循环中竞争核苷酸、聚合酶分子和两个引物的底物.但是,第一次PCR产物可经过纯化除去残留的引物后,使用锚定引物和另一个与第一次PCR 产物的cDNA序列互补的特异3 -末端引物进行第二次PCR扩增[2,9,19].Frohman报道,如果两次PCR 扩增的循环总数达到60个的话,理想的RAC E产物就会在琼脂糖胶上,经溴乙锭染色表现出特异的带.另一种可以增强特异PCR产物的产率的方法称为亲和捕获(Affinity capture).此种方法有许多变化,但其基本方法涉及到使用特异交联在亲和基质上的一个标签寡核苷酸(Tagged oligo)来捕获理想的产物.如与目标cDNA序列互补的生物素化的oligo在溶液中与变性的cDNA杂交后,杂合体用Streptavidin亲和柱捕获,然后用适当条件洗脱除去非特异退火的杂合体.这样明显富积了的特异目的cDNA序列就从柱上洗脱下来,再用于PCR扩增. 2.4.5 RAC E产物的克隆一旦获得可以检测到的RACE产物,就必须进行纯化、回收和克隆.因为PCR产物在经酚 氯仿抽提和乙醇沉淀的回收过程中,有相当大的损失[28],最好使用专门的试剂盒回收.纯化的产物可用适当的限制酶切割,在低熔点琼脂糖胶上电泳,直接连接到测序载体中.虽然有RAC E产物直接用于测序的报道[9],但由于有替代的转录起始位点[11,16]和反转录酶合成的第一链cDNA的3 -末端有非模板指194 生 命 科 学 研 究 2003年。
cDNA末端快速扩增技术RACE
SMART RACE cDNA synthesis Kit
碱基互补 配对原则
AT之间 之间 形成两个氢键 GC之间 之间 形成三个氢键
poly(C)替代 替代poly(A) 替代 增加5′ 接头与cDNA 第一链的结合牢固性 增加 接头与
增加模板中有效双链丰度
提高目的基因获取几率
SMART RACE cDNA synthesis Kit原理 原理
cDNA末端快速扩增技术 cDNA末端快速扩增技术 (rapid amplification of cDNA en
♥ ♥ ♥ ♥ 技术背景 基本RACE 基本RACE 原理和方法 样品要求 RACE 产物的鉴定和全长 cDNA 的获得
技 术 背 景
RACE流程 流程
（1） ）
RNase H
（2） ）
5′-RACE法 5′-RACE法 原理图
（3） ）
（4） ）
样品要求： 样品要求：
提取Total RNA的材料要新鲜，采样后立即放入 的材料要新鲜， ◇ 提取 的材料要新鲜 液氮中速冻或加入样品稳定剂。 液氮中速冻或加入样品稳定剂。 ◇ Total RNA无降解，OD260/280=1.8 ~ 2.0。 无降解， 无降解 。 提供尽量多的实验材料： ◇ 提供尽量多的实验材料：3′ RACE Total RNA＞ ＞ 15 µg；5′RACE Total RNA＞25 µg。如果基因 ； ＞ 。 的含量较低或者未知序列较长， 的含量较低或者未知序列较长，样品量需相应 增加。 增加。
cdna末端快速扩增实验步骤
cdna末端快速扩增实验步骤英文回答：CDNA末端快速扩增是一种用于从已知序列的cDNA末端扩增未知序列的实验方法。
下面是该实验的步骤：1. RNA提取，首先，需要从细胞或组织中提取RNA。
这可以通过使用RNA提取试剂盒来完成。
将样品与提取试剂混合，然后通过离心将RNA沉淀下来。
最后，用去离子水重悬RNA。
2. 反转录，接下来，需要将RNA转录成cDNA。
这可以通过使用反转录酶和随机引物来完成。
将RNA与反转录试剂混合，然后在适当的温度下进行反应，使RNA转录成cDNA。
3. 末端修复，在cDNA合成的末端通常存在未知序列。
为了扩增这些未知序列，需要进行末端修复。
这可以通过使用DNA聚合酶和dNTPs来完成。
在适当的温度下进行反应，使cDNA末端修复。
4. PCR扩增，接下来，需要进行PCR扩增。
这可以通过使用特定引物和PCR试剂混合来完成。
将cDNA模板与PCR试剂混合，然后在适当的温度下进行PCR反应。
PCR反应会扩增cDNA末端的未知序列。
5. 凝胶电泳，最后，需要对PCR产物进行凝胶电泳分析。
将PCR产物与DNA加载缓冲液混合，然后将混合物加载到琼脂糖凝胶上。
通过电泳将PCR产物分离，并使用DNA染料进行染色。
然后，使用紫外线照射凝胶，以可视化PCR产物。
中文回答：CDNA末端快速扩增是一种用于从已知序列的cDNA末端扩增未知序列的实验方法。
该实验的步骤如下：1. RNA提取，首先，需要从细胞或组织中提取RNA。
可以使用RNA提取试剂盒进行提取。
将样品与提取试剂混合，然后通过离心将RNA沉淀下来。
最后，用去离子水重悬RNA。
2. 反转录，接下来，需要将RNA转录成cDNA。
可以使用反转录酶和随机引物来完成。
将RNA与反转录试剂混合，然后在适当的温度下进行反应，使RNA转录成cDNA。
3. 末端修复，cDNA合成的末端通常存在未知序列。
为了扩增这些未知序列，需要进行末端修复。
可以使用DNA聚合酶和dNTPs 进行修复。
cDNA末端快速扩增技术RACE
具体实验方法
♥ cDNA第一链的合成 ♥ 阳性对照RACE PCR实验 ♥ cDNA末端的快速扩增 ♥ RACE产物鉴定 ♥ 试剂盒试剂
精品PPT
• 比较用GSPs和NGSPs引物获得的 PCR产物
• Southern blot analysis • Nucleo Trap Gel Exraction • 克隆和测序RACE产物
精品PPT
RACE 产物的鉴定和全长 cDNA 的获得
3′或5′双链cDNA
限制性内切酶thern blot 分析
RACE 产物的3′和5′ 末端序列的分析
合成相应引物
PCR获得全长cDNA
精品PPT
♥ SMART RACE cDNA synthesis Kit
精品PPT
RNase H
5′-RACE法 原理图
精品PPT
样品要求：
◇ 提取Total RNA的材料要新鲜，采样后立即放入 液氮中速冻或加入样品稳定剂。
◇ Total RNA无降解，OD260/280=1.8 ~ 2.0。 ◇ 提供尽量多的实验材料：3′ RACE Total RNA＞
15 μg；5′RACE Total RNA＞25 μg。如果基因 的含量较低或者未知序列较长，样品量需相应 增加。
cDNA末端快速扩增技术 (rapid amplification of cDNA
ends, RACE)
精品PPT
基本RACE原理
♥ 技术背景 ♥ 基本RACE 原理和方法 ♥ 样品要求 ♥ RACE 产物的鉴定和全长
cDNA 的获得
精品PPT
技术背景
得到某基因的片段、全长或近全长cDNA的方法：
精品PPT
全基因组扩增技术
全基因组扩增技术 Modified by JACK on the afternoon of December 26, 2020全基因组扩增(whole?gemomeamplification，WGA)是一组对全部基因组序列进行非选择性扩增的技术，其目的是在没有序列倾向性的前提下大幅度增加DNA的总量。
其基本原理为：采用的多重置换扩增（MDA）技术，能对基因组DNA进行稳定的扩增。
利用随机六碱基引物在多个位点与模板DNA退火，接下来在高扩增效率和保真性的Phi29?DNA聚合酶在DNA的多个位点同时起始复制，它沿着DNA模板合成DNA,同时取代模板的互补链。
被置换的互补链又成为新的模板来进行扩增，因此最终我们可以获得大量高分子量的DNA。
全基因扩增中使用独特的Phi29DNA聚合酶，该酶对于模板有很强的模板结合能力，能连续扩增100Kb的DNA模板而不从模板上解离。
同时这种酶具有3’—5’外切酶活性，可以保证扩增的高保真性。
目前市场上普遍采用Qiagen公司的Repli-gMiniKit系列全基因组试剂盒。
本试剂盒的开发对国内用于全基因扩增领域有着广泛的应用前景。
可以从少量样本中稳定扩增全基因组DNA。
该试剂盒的开发过程包括分离和扩增DNA的试剂，适用的样本广泛，包括已纯化的基因组DNA、全血、组织培养细胞、显微切割得到的细胞、速冻的组织切片、血浆血清中的细胞、口腔细胞、血斑。
具有以下特点：1.产物应用途径广阔PCR（包括多重PCR、长片段PCR以及定量PCR）、克隆、文库构建、单倍型确定、测序、基因芯片、遗传分析（片段差异、微卫星差异、单碱基差异、SNP、STR等）。
2、高产量10ng基因组DNA经扩增后可产生〉15ug（20ul反应体系）的DNA反应产物，扩增倍数可达上万倍。
3、扩增产物长度以及覆盖率有保证这是我们公司全基因组扩增技术（多重置换扩增技术），这不是一个PCR过程。
目前这个技术比较流行，之前的技术已经有些过时。
CDNA末端快速扩增技术(RACE)简介
CDNA末端快速扩增技术(RACE)简介CDNA末端快速扩增技术(RACE)是一种利用PCR技术从低丰度的转录本中快速获取CDNA的5’和3’末端序列的方法。
这种方法的优点是简单、快速、廉价，可以用于研究基因的结构和表达。
RACE技术有两种主要类型，分别是3-RACE和5-RACE，分别用于扩增CDNA的3’和5’末端序列。
3-RACE原理和步骤3-RACE原理是利用mRNA的3’末端的poly (A)尾巴作为一个引物结合位点，用一个带有SMART序列的通用接头引物Oligo(dT) 30MN作为锁定引物，反转录合成第一链cDNA。
然后用一个基因特异引物GSP1作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM作为下游引物，以第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因3’末端的DNA片段扩增出来。
3-RACE步骤如下：•从RNA样品中提取mRNA，并用Oligo(dT) 30MN作为锁定引物进行反转录反应，合成第一链cDNA。
•用GSP1和UPM作为引物进行第一轮PCR反应，扩增出包含目的基因3’末端序列和接头序列的片段。
•从第一轮PCR产物中纯化出目标片段，并用UPM和另一个靠近GSP1的内嵌引物GSP2进行第二轮PCR反应，扩增出更精确的目标片段。
•从第二轮PCR产物中纯化出目标片段，并进行克隆、测序和分析。
5-RACE原理和步骤5-RACE原理是先利用mRNA的3’末端的poly (A)尾巴作为一个引物结合位点，用oligo (dT) 30MN作为锁定引物，在反转录酶MMLV作用下，反转录合成第一链cDNA。
利用该反转录酶具有的未端转移酶活性，在反转录达到第一链的5’末端时自动加上3-5个(dC)残基，与含有SMART序列的Oligo (dG)通用接头引物配对后，继续延伸而连上通用接头。
然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM作为上游引物，用一个基因特异引物GSP2作为下游引物，以第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5’末端的cDNA片段扩增出来。
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Ambion（FirstChoice® RLM-RACE Kit） Invitrogen（GeneRacerTM Kit） TaKaRa（3’-Full RACE Core Set Ver.2.0 and 5’Full RACE kit ） Clontech（SMARTer™ RACE cDNA Amplification Kit）
3’RACE的扩增
3’RACE
切胶回收
504bp
克隆转化
挑取单菌落Biblioteka 公司测序菌落PCR检测
3’RACE序列的分析
将测序得到的结果去载体与接头
接下来，将3’RACE结果与中间片段采用DNAMAN软件 进行拼接
点击此图标进 行序列拼接
点击此处输 入需要拼接 的核酸序列
点击此处开 始进行拼接
点击“导出”按钮 输出拼接好的序列
总 R N A 提 取 过 程
安全柜
总RNA的浓度 和纯度检测
总RNA的完整性检测
琼脂糖凝胶电泳检测得到两
28S 18S 条清晰的谱带，分别为28S 和18S。说明提取的总RNA完 整性好，可进行下游实验操 作。
LITAF基因中间片段的克隆
cDNA模版的合成
1）RNA 2）oligodT引物、random引物 3）反转录酶（M-MLV……） 4）Rnase Inhibitor 5）dNTP 6）H2O
Oligo capping 法
碱性磷酸酶
烟草酸性焦 磷酸酶
Oligo capping method方法（又称RLM-RACE）是由日本东 京大学铃木等人开发，可以更精确的定位转录起始位点。 目前基于该方法的试剂盒有TaKaRa（5’-Full RACE kit D315）和Ambion（Firstchoice RLM-RACE kit AM1700）
引物设计
可以根据数据库中已有数据设计特异性引物或基因不同物种 中的保守结构域设计兼并引物 一般引物的长度为18-30bp，常用的长度为20-24bp，过长或 过短都不合适。 引物的GC含量一般为45-55%，过高或过低都不利于引发反 应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 引物所对应模板序列的Tm值最好在50-70℃之间，当然由于 模板序列本身的组成决定其Tm值可能偏低或偏高，可根据 具体情况灵活运用。
RACE的基本概念
cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术是基于PCR技术由已知的部分 cDNA序列来获得完整cDNA序列的一种方法，为 Frohman在1985年首次报道。
3’RACE 和5’RACE
常用的RACE试剂盒
设计引物
RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）技术进行基因cDNA全长扩增
文昌鱼LITAF基因全长的克隆
3’RACE
中间片段
LITAF基 因
5’RACE
Lipopolysaccharide-Induced TNF Factor
总RNA抽提
所有接触总RNA的试剂、器材等（包括配试剂用的H2O）均经0.1% DEPC （焦碳酸二乙酯 ）水处理，玻璃器皿于180℃烘箱烘烤6-8小时。 提取总RNA按mirVana™ miRNA Isolation Kit（Ambion公司）说明书于超净台中 操作（如图），提取的RNA分取部分进行纯度和完整性检测，其余于-80℃保 存。
cDNA Synthesis And Gene Cloning
金萍 南京师范大学生命科学学院 动物遗传资源研究所
cDNA扩增流程
组织样品
浓度（C）和纯度（A260/280）检测
RNA提取
cDNA合成
RNA保护试剂
设计 特异 引物
PCR 扩增
凝胶回收DNA
纯化的DNA
PCR法筛选阳性克隆
Express sequence tag，EST
3’RACE原理示意图
试剂盒中的接头与引物
3’-RACE ：3'-RACE较简单，首先将 mRNA或 总RNA用PolyT引物反转录，根据一般基因具有 polyA尾巴的特点，选用特异引物(根据已知序列设 计)和PolyT引物PCR即可。大多实验者反映一次 PCR可以搞定。
3’RACE引物的设计
介绍常用的5’RACE试剂盒
Ambion（FirstChoice® RLM-RACE Kit） Clontech（SMARTer™ RACE cDNA Amplification Kit）
5’-RACE试剂盒一般基于以下几种技术：SMART、Oligo capping method、self-ligation和anchored PCR。
PCR法进行中间片段的扩增
以反转录好的cDNA作为模板，利用合成好的特异 性引物或兼并引物进行中间片段的扩增。
切胶回收
克隆转化
挑取单菌落
公司测序
菌落PCR检测
测序结果的分析
去载体获得克隆片段
将测序得到的片段与用来设计引物的片段进行比对
进一步验证克隆得到的基因是否为目的基因
根据blast的结果初步确定克隆的基因为自己的目的基因，该基因片段 接下来用于RACE引物的设计
Outer引物 Inner引物
确定读码框的 方向
RACE引物设计的要点
23－28nt 50－70％GC Tm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果 需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE 反应的基因特异性引物（GSP1和 GSP2).由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。
SMART法
该技术是基于以下两个观察发展起来的： a、不同反转录酶包括MMLV合成的cDNA 3’端保真度不高； b、不同的反转录酶具有不同的加尾特性，MMLV特意的在cDNA末端 加上3-4个dCTP。
该方法的突出优点就是操作简便，成功率较高，全长分子的 比例较高。cDNA第一链的合成和加尾一步即完成，避免了 其他方法中对mRNA和cDNA链的反复操作，降低了mRNA 降解和合成产物丢失的风险，使本来就含量甚微的全长分子 得到最大保存，所以这种方法得到了广泛认可，应用最多。 如果加上RNA提取时间，这种技术可以在3个小时内得到加 上接头的cDNA产物，最大限度地降低了mRNA的降解风险。