紫外分光光度法详解
紫外分光光度法缩写
紫外分光光度法缩写紫外分光光度法（UV-Vis Spectrophotometry）1. 引言紫外分光光度法是一种常用的分析方法，广泛应用于化学、生物、环境等领域。
本文将介绍紫外分光光度法的原理、仪器和应用。
2. 原理紫外分光光度法利用物质对紫外可见光的吸收特性进行分析。
紫外光具有较短的波长，能够使样品中的电子从基态跃迁到激发态，吸收光能。
通过测量样品吸收光的强度，可以确定样品中特定物质的浓度。
3. 仪器紫外分光光度计是进行紫外分光光度法分析的关键仪器。
它由光源、单色器、样品室和探测器等部分组成。
光源发出一束连续的紫外光，经过单色器选择特定波长的光进入样品室，样品吸收部分光能后，剩余的光通过探测器进行检测和记录。
4. 操作步骤（1）准备样品：将待测样品溶解于适当的溶剂中，以获得透明的溶液。
（2）设置仪器：进入紫外分光光度计软件，选择合适的波长范围和检测模式。
（3）调零：用空白溶液（即不含待测物质的溶剂）进行调零，确保仪器在零吸光度状态下进行测量。
（4）测量样品：将样品溶液放入样品室，测量吸光度，并记录结果。
（5）计算浓度：根据吸光度与样品浓度之间的线性关系，计算出待测物质的浓度。
5. 应用紫外分光光度法在许多领域中都有广泛的应用。
（1）药物分析：紫外分光光度法可以用来测定药物的含量和纯度，对药物的质量控制起到重要的作用。
（2）环境监测：紫外分光光度法可以用来检测水体、大气等环境样品中的有害物质，帮助评估环境污染程度。
（3）生物学研究：紫外分光光度法可用于测定蛋白质、核酸等生物大分子的浓度，研究其结构和功能。
（4）食品分析：紫外分光光度法可以用来检测食品中的添加剂、污染物等，保障食品安全。
6. 优势与局限紫外分光光度法具有操作简单、快速、灵敏度高的优点。
然而，该方法对样品的透明度要求较高，不能用于浑浊或有色样品的分析。
7. 结论紫外分光光度法是一种常用的分析方法，通过测量样品对紫外可见光的吸收特性，可以确定样品中特定物质的浓度。
紫外可见分光光度法解析课件
吸光度: 为透光度倒数的对数，用A表示，即 A=lg1/T=lgI0/It
二、朗伯-比尔定律 当一束平行单色光通过含有吸光物质的
稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度、 液层厚度乘积成正比，即
A= E cl 式中比例常数E为吸光系数，与吸光物质 的本性，入射光波长及温度等因素有关。c为 吸光物质浓度，l为透光液层厚度。
2. 使用 仪器自检结束后（7个自检项目均出现
OK字样），按[MAIN MENU]键（主 菜单），屏幕显示如下5个功能项： 1. Phtometry（定量运算）；2. Wavelength Scan（波长扫描模式）；3. Time Scan （时间曲线扫描）；4. System（系统校 正）；5. Data display（光度直接测量 模式）。根据需要测量的实验项目按相
朗伯-比尔定律是紫外-可见分光光度法的理 论基础。
A lg 1 lg I0 ECL TI
式中，A为吸光度，T为透光率，I0、I分别为入射光
和透过光的强度；E为吸光系数，当c用物质的量浓 度表示，L用厘米表示，用ε代替E，称为摩尔吸光 系数，单位为（L·mol-1·cm-1）；当c用百分浓度 （g/100mL），L用厘米表示时，用E1cm1%表示E，称 为比吸光系数。它们的关系如下：
4.4 如果仪器不能初始化，关机重启。
4.5 如果吸收值异常，依次检查：波长设 置是否正确（重新调整波长，并重新调 零）、测量时是否调零（如被误操作，重 新调零）、比色皿是否用错（测定紫外波 段时，要用石英比色皿）、样品准备是否 有误（如有误，重新准备样品）。
2 标准对比法
即将待测溶液与某一标样溶液，在相同 的条件下，测定各自的吸光度，建立朗伯比尔定律，解方程求出未知样浓度与含量。
紫外分光光度法详解
（2）单色器
单色器是将光源辐射的复合光色散成单色光的光学装置。
一般由狭缝、色散元件及透镜系统组成。
最常用的色散元件是光栅和棱镜。
棱镜根据光的折射原理而将复合光色散为不同波长的单 色光，然后再让所需波长的光通过一个很窄的狭缝照射到吸 收池上。 由玻璃或石英制成。玻璃棱镜用于可见光范围，石英棱 镜则在紫外和可见光范围均可使用。
光束分器 光源
比值
单色器
显示 吸收池 检测器
自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵 敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂， 价格较高。
岛津UV-2550紫外可见分光光度计
双波长分光光度计
单色器
光源
单色器
切 光 源
吸 收 池
检 测 器
不需要参比溶液；可以消除背景吸收干扰；适合多组分混 合物、浑浊试样的定量分析，可进行导数光谱分析。价格 昂贵
光电倍增管比普通光电管更灵敏，是利用二次电子发射来
放大光电流。是目前高中档分光光度计中常用的一种检测器。 光电二极管阵列检测器是紫外-可见光度检测器的一个重要 进展。这类检测器用光电二极管阵列作检测元件。通过单色器 的光含有全部的吸收信息，在阵列上同时被检测，并用电子学
方法及计算机技术对二极管阵列快速扫描采集数据，由于扫描
池。 使用比色皿时应注意手持两侧毛边，保持清洁、透明， 避免磨损透光面。盛放液体高度占四分之三。
（4）检测器
将光信号转变成电信号的装置。 要求灵敏度高，响应时间短，噪声水平低且有良好的稳定 性。 常用的检测器有光电管、光电倍增管和光电二极管阵列检
测器。
光电管能将所产生的光电流放大，可用来测量很弱的光。 常用的光电管有蓝敏和红敏光电管两种。前者适用波长范围 210-625nm ；后者适用范围 625-1000nm
紫外分光光度法1详解
E 摩尔吸光系数
M 10
E1% 1cm
>104强吸收 <102弱吸收
C：g / 100 mL
E E11c%m百分吸光系数
比吸光系数
偏离比尔定律的因素
（一）化学因素 浓度变化引起的离解、缔合、与溶剂间作用等。 减免：控制溶液条件。 （二）光学因素 1.非单色光的影响：E1与E2相差越大，引起 的偏离越大。也与杂光的强度和检测器对之的 响应灵敏度有关。 减免：选用较纯的单色光。
选max的光作为入射光。
入射光选择示意图
A
结论：单组份分 析时，一般选择 max的光作为入 射光，测量灵敏 度高，且对比尔 定律的偏离小。
max
2.杂散光（stray light） 减免：优化仪器设计，维护好仪器。 3.反射光和散射光：使A偏高
减免：真溶液用空白对比补偿。胶 体溶液或浑浊溶液较难用空白补偿。 4.非平行光
紫外可见分光光度计的光学性能
狭缝或谱带宽：单色光纯度指标之一，低级仪 器几纳米，中高级仪器0.1~0.5nm 分辨率：260nm处，中等仪器 <0.5nm，高级 仪器 <0.1nm 杂散光:中等仪器 <0.5%,高级仪器<0.001%， 影响仪器测定浓度上限。 光度准确度：±1%~±0.1%
分光光度计的校正
•光电二极管阵列
阴极
真 抽真空 空 光 电 管
光束
e
阳极丝（Ni）
直流放大
R
- 90V DC +
阴极表面可涂渍不同光敏物质：高灵敏(K,Cs,Sb其中二者)、红光敏 (Na/K/Cs/Sb, Ag/Cs,625～1000nm)、紫外光敏(200～625nm)、平坦响应 (Ga/As，响应受波长影响小)。产生的光电流约为硒光电池的1/10。
紫外可见分光光度法(鉴别、检查、含量测定)
紫外-可见分光光度法紫外分光光度：紫外光区特定波长内的吸收度，被测物质或杂质的定性和定量紫外-可见分光光度计的工作波长：190-900nm近紫外区（氘灯）200-400nm 可见光区（碘钨灯）400-850nm定量分析:①最大吸收波长处测出吸收度②对照品或百分吸收系数算出被测物或杂质的含量双光束光栅型紫外-可见分光光度计波长准确度误差±0.5nm一、样品测定：⑴吸收系数测定:①按食品药品监督管理局标准的该药品项下规定的方法配制供试液②在规定的波长测定其吸收度③计算吸收系数，应符合规定范围⑵鉴别与检查：按食品药品监督管理局标准的该药品项下规定测定供试品在有关波长处的最大或最小吸收，或最大吸收峰值或最大或最小吸收的比值，应符合规定⑶含量测定：①对照品比较法㈠按食品药品监督管理局标准的该药品项下规定的方法分别配制对照品和供试品溶液注：对照品中所测成分的量应在供试品中所测成分标示量的(100±100)%以内㈡用同一溶剂，在规定的波长处测定供试品和对照品的吸收度②吸收系数法㈠按食品药品监督管理局标准的该药品项下规定的方法配制供试品溶液㈡在规定波长（±1nm）处测定其吸收度㈢按食品药品监督管理局标准的该药品在规定的条件下给出的吸收系数计算含量具体过程对照品比较法①调节波长测吸光度（吸光度最大波长应在该品种项下规定的波长±2nm以内）②A样品的吸光度:A对照品的吸光度= C样品:C对照品(C为浓度，mg/ml)C样品=A样品的吸光度×C对照品/A对照品的吸光度C样品×A对照品的吸光度= A样品的吸光度×C对照品P﹪（所含物质占标示量的百分比）= C供试品-稀释后的对照品×A对照品的吸光度/ A 样品的吸光度×C对照品×供试品的标示含量例1奥硝唑含量（紫外分光光度计）：⑴对照品①取0.0113g奥硝唑溶于100ml的容量瓶中稀释至100ml②从容量瓶中取出5ml③再用蒸馏水稀释至50 ml在319nm处测得对照品A（吸光度）=0.465⑵供试品①取5ml供试品于100lml的容量瓶中稀释至100ml②从容量瓶中取出5ml③用蒸馏水稀释至25ml319nm处供试品A1=0.413 供试品A2=0.417⑶①P﹪（所含物质占标示量的百分比）=0.413供试品的吸光度ⅹ(0.0113g/100ml)对照品浓度ⅹ(5/50) / 0.465对照品的吸光度ⅹ(5ml/100ml) ⅹ(1/25ml)ⅹ0.5g﹪ml标示含量供试品浓度ⅹ 100﹪=100.36﹪注：0.5﹪（供试品的标示含量）表示100ml 0.5g②P﹪= P1﹪+ P2﹪ /2。
紫外分光光度法
第4节 紫外分光光度法
• （3）紫外吸收光谱常用吸收曲线来描述。
•
即用一束具有连续波长的紫外光照射
一定浓度的样品溶液，分别测量不同波长下
溶液的吸光度，以吸光度对波长作图得到该
化合物的紫外吸收曲线，即紫外吸收光谱。
•
化合物的紫外吸收特征可以用曲线上
最大吸收峰所对应的最大吸收波长λmax 和
该波长下的摩尔吸光系数εmax 来表示。
远紫外区，而在近紫外光区是透明的， 它们的吸收光谱曲线必须在真空中测定。
（一）紫外吸收光谱的产生
2、价电子的种类及电子跃迁类型：
• ②n → σ* 跃迁
• 含有氧、氮、硫、卤素等杂原子的饱和 烃衍生物都可发生 n → σ* 跃迁，它比 σ → σ* 跃迁的能量要低，吸收波长较长， 一般在150～250 nm范围内。如CH3OH
• 1．生色团和助色团 • ①生色团——含不饱和键基团，有π键 • 含有不饱和键，能吸收紫外可见光，产生
n→π* 或π→π*跃迁的基团称为发色团
• 是指在200～1000nm波长范围内产生特征吸收 带的具有一个或多个不饱和键和未共用电子对 的基团。如
•
C O CC NN C C
CO
COOH
（二）紫外吸收光谱中的有关术语
吸收峰波长
吸收强度 极性溶剂
π→π*
n→π*
与组成双键的
有关
原子种类基本无关
强吸收 104~105 弱吸收 ＜102
向长波方向移动 向短波方向移动
2、价电子的种类及电子跃迁类型：
• 由于一般紫外-可见分光光度计只能提供 190～850nm范围的单色光，因此只能测 量n → π* 跃迁和部分 n → σ* 跃迁、π → π* 跃迁的吸收，而对只能产生200 nm以 下吸收的 σ → σ* 跃迁则无法测量。常见 电子跃迁所处的波长范围及强度如图824所示。
第四章紫外-可见分光光度法
（三）有机化合物的紫外、可见光谱
1. 饱和烃及其取代衍生物 σ→σ*、n→σ* 2. 不饱和烃及共轭烯烃 σ→σ*、π→π* 3. 羰基化合物 n→σ*、π→π*和n→π* 4. 苯及其衍生物 E1带、 E2带、 B带 5. 稠环和杂环
当l以cm，c以mol/L为单位时，k称为摩尔吸 光系数，用ε表示，它比a更为常用，ε的单位 为L mol-1 cm-1，即： A = ε c l
当l以cm，c以百分浓度g/100mL为单位时，k 称为比吸光系数，用A1cm1%表示 ε = 0.1 M A1cm1%
用比吸光系数的表示方法特别适用于摩尔质 量未知的化合物。
（二）配位场跃迁
1. f-f跃迁
镧系和铜系元素的离子对紫外和可见光的吸收是 基于内层f电子跃迁而产生的，其吸收光谱是由一些狭 窄的特征吸收峰组成，且这些吸收峰不易受金属离子 所处的配位环境的影响。
2. d-d跃迁
过渡金属离子的d轨道在受到配位体场的作用时 产生分裂。d电子在能级不同的d轨道间跃迁，吸收紫 外或可见光产生吸收光谱。这种光谱的吸收带比较 宽，吸收峰强烈地受配位环境的影响。
光。
3. 吸收池
功能：盛放分析试样（一般是液体）
4. 检测器 功能：检测光信号，测量单色光透过溶
液后光强度变化的一种装置。 5. 信号显示系统
6. 紫外一可见分光光度计的类型
(1) 单波长单光束分光光度计
缺点：测量结果受电源波动的影响较大， 误差较大。
(2) 单波长双光束分光光度计
一个环外双键
5nm
同环二烯 39nm 一个β烷基 12nm 三个γ+烷基 54nm
第11章--紫外可见分光光度法(UV-VIS
解： c(Fe)=1.0 mg/L=1.0×10-3 g/L /55.85g/mol =1.8×10-5mol/L
=
0.38 2 1.8 10-5
= 1.110（4 L mol-1
cm-1）
S=M/ =55.85/1.1×104=0.0051 (g/cm2)
§11.3 紫外—可见分光光度计
紫外-可见分光光度计一般包括光源、单色器、吸 收池和检测显示几部分，基本结构如下：
吸光度的加合性
在多组分体系中如果各吸光物质之间无相互作用这时 体系总的吸光度等于各个吸光物质的吸光度之和。
A＝ Ai
吸光度的测量： 用参比溶液调T=100%（A=0），再测样品溶液 的吸光度，即消除了吸收池对光的吸收、反射， 溶剂、试剂对光的吸收等。
§11.2 光吸收基本定律:
A Kbc Lambert-Beer定律
2b
显示器
0.00
0.10
吸光度与浓度的关系 A = Kbc
检测器
比
光源
尔
参
定
比
律
(1852)
c
0.20
2c
吸光系数(K) c：mol / L
c：g / L c：g / 100 mL
物质的性质 入射光波长 温度
与浓度无关,取值与浓度的单位相关
K 摩尔吸光系数，L ·mol –1 ·cm -1
= c ； 波数 = 1/ = /c
微粒性 光是由光子流组成，光子的能量：
E h
h－普朗克(Planck)常数 6.626×10-34J·s
－频率
E－光量子具有的能量 单位：J(焦耳)，eV(电子伏特) 1eV=1.602×10－19 J
波粒二象性
紫外-分光光度法原理知识讲解
紫外-分光光度法原理紫外分光光度计的使用原理和方法紫外-可见分光光度法(ultraviolet-visible spectrophotometry, UV-VIS)1定义：它是利用物质的分子或离子对某一波长范围的光的吸收作用，对物质进行定性分析、定量分析及结构分析, 所依据的光谱是分子或离子吸收入射光中特定波长的光而产生的吸收光谱。
2分类：按所吸收光的波长区域不同：分为紫外分光光度法和可见分光光度法，合称为紫外-可见分光光度法。
3、紫外-可见分光光度法的特点：（1) 其仪器设备和操作都比较简单，费用少，分析速度快;（与其它光谱分析方法相比）（2）灵敏度高;（3）选择性好;（4）精密度和准确度较高;（5）用途广泛。
§1. 紫外-可见吸收光谱1. 物质对光的选择性吸收物质对光的吸收是选择性的，利用被测物质对某波长的光的吸收来了解物质的特性，这就是光谱法的基础。
通过测定被测物质对不同波长的光的吸收强度（吸光度），以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得出该物质在测定波长范围的吸收曲线。
在吸收曲线中，通常选用最大吸收波长λmax进行物质含量的测定。
2.有机化合物的紫外-可见吸收光谱2.1 有机化合物的电子跃迁与紫外-可见吸收光谱有关的电子有三种，即形成单键的σ电子、形成双键的π电子以及未参与成键的n电子。
跃迁类型有：σ→σ*、n→σ* 、π→π *、 n→π * 四种。
饱合有机化合物的电子跃迁类型为σ→σ*，n→σ*跃迁，吸收峰一般出现在真空紫外区，吸收峰低于200nm，实际应用价值不大。
不饱合机化合物的电子跃迁类型为n→π*，π→π*跃迁，吸收峰一般大于200nm。
生色团：是指分子中可以吸收光子而产生电子跃迁的原子基团。
人们通常将能吸收紫外、可见光的原子团或结构系统定义为生色团。
助色团：是指带有非键电子对的基团，如-OH、-OR、-NHR、-SH、-Cl、-Br、-I等，它们本身不能吸收大于200nm的光，但是当它们与生色团相连时，会使生色团的吸收峰向长波方向移动，并且增加其吸收强度。
中国药典版紫外分光光度法讲义优秀
• 肩峰或吸收谷处的吸光度测定受波长变动影响也较小，有时也可用谷 值、肩峰值与峰值同时作鉴别依据。（比如甲硝唑片的第三个鉴别就 是分别在277 nm和241 nm的波长处分别测最大吸收和最小吸收。）
• 具有不同吸光基团的化合物可有相同的最大吸收波长，但它们的摩尔 吸光系数常有明显的差别，所以摩尔吸光系数常用于分子结构分析中 吸光基团的鉴别。对于分子中含有相同吸光基团的物质，他们的摩尔 吸光系数常很接近，但可因相对分子质量不同，使百分吸光系数的值 差别较大，可以用百分吸光系数作为鉴别的依据。（比如结构相似的 甲基睾丸酮和丙酸睾丸素在无水乙醇中的最大吸收波长λmax都在 240nm，但在该波长处的E1%1cm数值，前者为540，而后者为460， 因而有较大的鉴别意义）。
• 紫外光谱是物质在200～400 nm的近紫外 光区和400～850 nm的可见光区的吸收光 谱。通常使用的紫外－可见分光光度计的 工作波长范围为190～900nm,本法在药品 检验中主要用于药品的鉴别、检查和含量 测定。适用于微量和痕量组分的分析，测 定灵敏度可达到10-4～10-7g/ml或更低范围。
处的吸收度与浓度之间是线性关系。因此 只要选择适宜的波长测定溶液的吸光度， 就可以求出其浓度。通常应选择被测物质 吸收光谱的吸收峰处，以提高灵敏度并减 少测量误差，被测物质如有几个吸收峰， 可选不易有其他物质干扰的较高吸收峰， 一般不选光谱中末端吸收峰。
中国药典版紫外分光光度法讲义优秀
• 单组分物质的含量测定 • 就是物质有单一成份构成，常用的测定法
中国药典版紫外分光光度法讲义优秀
第二节 原理
• 紫外分光光度法之所以能成为一种分析方 法，主要依据两点：
• 一、就是我们常说的吸收度，2005年版药 典已将它改为吸光度，这样说可能更准确 些。就是物质对光的吸收程度。我们首先 说一下电磁波，所有电磁波在性质上都完 全相同的，他们之间的区别仅在于波长或 频率的不同。