细胞总RNA提取及逆转录
单细胞测序 逆转录
单细胞测序逆转录
单细胞测序（Single-cell sequencing）是一种用于研究单个细胞的基因组学、转录组学和表观基因组学的技术。
在单细胞测序中，逆转录（Reverse Transcription）是其中一个关键步骤，主要用于将细胞中的RNA转录成相应的cDNA，以便后续的测序和分析。
逆转录的步骤通常包括以下几个方面：
1.RNA提取：从单个细胞中提取总RNA。
这可以通过不同的方
法实现，如细胞裂解、酶解或使用特定的细胞捕获技术。
2.逆转录反应：使用逆转录酶（reverse transcriptase）对RNA进
行逆转录，将RNA转录成相应的cDNA。
逆转录酶能够合成cDNA链，其方向是与RNA模板相反的。
3.RNA降解：通过加入RNase（核酸酶）等酶来降解RNA模板，
使得只有cDNA链得以保留。
4.二次合成：对得到的cDNA进行二次合成，以增加cDNA的数
量。
在单细胞测序中，逆转录的效率和准确性对后续的数据分析至关重要。
由于单细胞样本的RNA量非常有限，逆转录过程的优化是确保从单个细胞获取高质量数据的关键步骤之一。
单细胞测序技术的不断发展使得研究者能够更全面地理解单个细胞的基因表达和功能，为理解生物学的复杂性提供了强大的工具。
总RNA的提取及相关实验方法
总RNA的提取（Trizol法提取）在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。
若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。
在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。
1.提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10 ╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；2.将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟；3.在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟；4.取上层水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟；5.弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清；6.让沉淀的RNA在室温下自然干燥；7.用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。
PCR实验室常用DNA聚合酶有三种：TaKaRa Taq TM，TaKaRa E X Taq TM和Pyrobest TM DNA Polymerase。
TaKaRa Taq TM是一般的DNA聚合酶，保真性较差，但价钱便宜，一般用于基因表达的检测等。
TaKaRa E X Taq TM是具有Proof reading 活性的耐热性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR产物3’端附有一个“A”碱基，如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。
Pyrobest TM DNA Polymerase也是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的PCR产物为平滑末端。
Trizol法提取细胞中RNA及逆转录合成cDNA
Trizol法提RNA试剂及材料：Trizol（3号冰箱 4℃ 3层）、三氯甲烷、异丙醇（以上二者在有机厨）、75%乙醇（按DEPC水:无水乙醇=1：3配制）、DEPC水（以上二者在3号冰箱—20℃3层）、肺动脉平滑肌细胞仪器：4℃离心机、移液枪、Nano drip 2000(微量紫外分光光度仪)、管、200μl EP管、EP管插板、冰盒准备：1、配制DEPC水：取一个500ml蓝盖瓶，用去离子水洗涤，加入超纯水500ml,想瓶中加入DEPC母液,震荡摇匀，在通风厨内常温过夜，灭活RNA酶，第二天将瓶子盖拧松，高温高压消毒灭菌（121℃，30min）,消毒后分装在管中，4℃保存。
2、新鲜标本的保存（备用于RNA提取）：取新鲜标本，先放入液氮中，然后冻存于-80℃。
3、动物组织提RNA前处理：用PBS冲洗干净后，按50-100mg加入1ml Trizol，用电动匀浆器或者一次性研磨杵充分匀浆，最好在冰上进行。
注：均质50-100 毫克组织样本需要 1 毫升的TRIzol 试剂，使用特富龙玻璃®或强力均质机（Polytron, or Tekmar's TISSUMIZER® TISSUMIZER ®或相当的仪器）。
均质时样本体积不应超过TRIzol 试剂体积的10％。
b. 单层细胞直接在培养皿中裂解细胞，厘米直径的皿中加入TRIzol 试剂1 毫升，并通过抽吸几次促进细胞裂解。
TRIzol 试剂的添加量基于培养的面积而不是细胞的数目（每10 平方厘米加入1 毫升）。
TRIzol 试剂量不足可能会导致分离出的RNA 有DNA 的污染。
步骤：1.将处理完的35mm细胞皿从细胞培养箱中取出，用预冷的 PBS 清洗 1-2 次，迅速加入已经预冷的Trizol液1ml，室温孵5分钟。
2.收集标本悬浮于 EP管内，加入200ul三氯甲烷，用手上下震荡15秒，使之充分混匀成乳状，室温孵育3分钟。
外周血单个核细胞总RNA的分离纯化及其逆转录
4. 加10ul DEPC(焦磷酸二乙酯）水溶解RNA。
逆转录-PCR的原理
提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作 为模板，采用Oligo(dT)或随机引物，利用逆转录 酶特异性地反转录成cDNA，再以cDNA为模板进 行PCR扩增，而获得目的基因。转录产物具有连 续的氨基酸编码区，不需要进行剪接，可在原核 细胞中表达。
RNA极易降解，因其RNA酶分布广、活性强、 且难以失活，痕量的RNA酶就能够造成严重的 RNA降解，实验中采用多种措施抑制RNA酶的 活性，减少RNA的降解。
抑制RNA酶活性的试剂
1. 焦磷酸二乙酯（DEPC)，一种强烈的烷化剂，能 够和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而以 抑制外源RNA酶。 2. 异硫氰酸胍，一种强蛋白变性剂，可使包括 RNA酶在内的所有酶活性丧失，抑制外源性RNA 酶活性。
实验步骤—— PCR扩增
反应体系：
10×Buffer 2 ml
Mg2+
1.5 ml
dNTP
2 ml
cDNA
5 ml
Taq
0.2 ml
primer
2 ml
ddH2O 总体积
17.3 ml 30 ml
反应条件： 94℃ 5min 94 ℃ 45s 56 ℃ 30s ×30c 72 ℃ 30s 72 ℃ 5min 4 ℃ 保存
结果与分析
PCR产物进行琼脂糖电泳鉴定，标明目的条 带，非目的条带。
具体实验结果分析，如果实验失败，请分析 原因，按实际实验出发。
注意事项——预防RNase污染
Trizol法提取细胞中RNA及逆转录合成cDNA
Trizol法提RNA试剂及材料：Trizol（3号冰箱4℃3层）、三氯甲烷、异丙醇（以上二者在有机厨）、75%乙醇（按DEPC水:无水乙醇=1：3配制）、DEPC水（以上二者在3号冰箱—20℃3层）、肺动脉平滑肌细胞仪器：4℃离心机、移液枪、Nano drip 2000(微量紫外分光光度仪)、1.5mlEP 管、200μl EP管、EP管插板、冰盒准备：1、配制DEPC水：取一个500ml蓝盖瓶，用去离子水洗涤，加入超纯水500ml,想瓶中加入DEPC母液0.5ml,震荡摇匀，在通风厨内常温过夜，灭活RNA酶，第二天将瓶子盖拧松，高温高压消毒灭菌（121℃，30min）,消毒后分装在1.5mlEP 管中，4℃保存。
2、新鲜标本的保存（备用于RNA提取）：取新鲜标本，先放入液氮中，然后冻存于-80℃。
3、动物组织提RNA前处理：用PBS冲洗干净后，按50-100mg加入1ml Trizol，用电动匀浆器或者一次性研磨杵充分匀浆，最好在冰上进行。
注：均质50-100 毫克组织样本需要 1 毫升的TRIzol 试剂，使用特富龙玻璃®或强力均质机（Polytron, or Tekmar's TISSUMIZER® TISSUMIZER ®或相当的仪器）。
均质时样本体积不应超过TRIzol 试剂体积的10％。
b. 单层细胞直接在培养皿中裂解细胞，3.5 厘米直径的皿中加入TRIzol 试剂1 毫升，并通过抽吸几次促进细胞裂解。
TRIzol 试剂的添加量基于培养的面积而不是细胞的数目（每10 平方厘米加入1 毫升）。
TRIzol 试剂量不足可能会导致分离出的RNA 有DNA 的污染。
步骤：1.将处理完的35mm细胞皿从细胞培养箱中取出，用预冷的PBS 清洗1-2 次，迅速加入已经预冷的Trizol液1ml，室温孵5分钟。
2.收集标本悬浮于1.5ml EP管内，加入200ul三氯甲烷，用手上下震荡15秒，使之充分混匀成乳状，室温孵育3分钟。
RNA 提取及逆转录
4℃，7500g离心5min，尽可能彻底地吸走上清（用1ml枪头轻吸取），防止RNA沉淀丢失。
↓
干燥5-10min（使乙醇完全挥发）
↓
加入20-50uLRNAse-free的水溶解（若沉淀难溶，可55-60℃保温10-15分钟）
本次用20ul溶解，以保证测浓，并记录浓度和A260/280
淋巴细胞总RNA提取
外周血分离的LC，室温孵育5min，每管加入Trizol各500ul
↓
将加过Trizol的LC从-80℃取出，室温平衡；
↓
按每1mL trizol加入0.2mL氯仿，本次每管加100ul氯仿
↓
剧烈震荡15秒，呈粉红
即“萃取”，使有机相与LC混匀，分离DNA、RNA和蛋白；
↓
室温静置2-3min；
目的使其分层，肉眼观大致分三层，上层无色水相为RNA，中层云雾状为DNA（若提DNA，可留取待用），下层粉红为蛋白；
↓
4℃，12000g离心15min，取出时应动作轻柔、避免震荡；
↓
小心吸取上层水相（大约总体积的50%），不要吸取任何中间层物质。
↓
按每1mL trizol加入0.5mL异丙醇（本次250ul），把异丙醇加入吸取的水相中，颠倒混匀
即沉淀RNA
↓
室温孵育10min，使充分沉淀；
↓
4℃，12000g离心10min
↓
弃上清（用1ml枪头小心吸取），防止RNA沉淀丢失
↓
按每1mL trizol加入1mL75%乙醇的量（本次0.5ml），加入75%乙醇洗涤沉淀，颠倒混匀，可稍弹EP管（75%乙醇可去除共沉淀的盐类，此时RNA不溶解等）
（A260/280，以评价RNA纯度，为1.8-2.0）
rna提取 逆转录 步骤及原理
rna提取逆转录步骤及原理以RNA提取逆转录步骤及原理为标题，本文将详细介绍RNA提取逆转录的步骤和原理。
一、RNA提取的步骤RNA提取是从细胞或组织中分离RNA分子的过程，常用于研究RNA的功能和表达水平。
RNA提取的步骤通常包括以下几个主要步骤：1. 细胞或组织的收集：首先，需要选择目标细胞或组织，并将其收集到离心管或离心管中。
收集的细胞或组织应该是新鲜的，并且要避免RNA的降解。
2. 细胞破碎：为了释放RNA，需要将细胞或组织破碎。
可以使用机械方法（如研钵研磨）或化学方法（如细胞裂解缓冲液）来破碎细胞膜。
破碎后的细胞溶液中包含了RNA分子。
3. RNA的纯化：为了纯化RNA，需要将其他的细胞组分（如蛋白质和DNA）去除。
这可以通过加入酚/氯仿混合液和异丙醇来实现。
酚/氯仿混合液可以将DNA和蛋白质从RNA中分离出来，而异丙醇可以用来沉淀RNA。
4. RNA的沉淀和洗涤：将异丙醇沉淀的RNA沉淀物用无水乙醇洗涤，以去除杂质。
然后，使用适当的缓冲液来溶解RNA，使其溶于水中。
5. RNA的定量和质量检测：使用光谱法（如比色法或荧光法）对RNA进行定量，以确定其浓度。
此外，还可以使用凝胶电泳或聚合酶链反应（PCR）等方法对RNA的质量进行检测。
二、RNA提取逆转录的原理逆转录是将RNA转录成相应的DNA分子的过程。
逆转录酶是逆转录过程中的关键酶。
其原理如下：1. 逆转录酶的作用：逆转录酶是一种RNA依赖的DNA聚合酶，能够将RNA作为模板合成相应的DNA分子。
逆转录酶能够识别RNA中的反义链，并以该反义链为模板合成DNA链。
2. 逆转录酶的特点：逆转录酶具有RNA依赖性，意味着它只能在RNA分子上进行反应。
逆转录酶还具有RNA酶活性，可以在RNA 分子上剪切和连接。
3. 逆转录酶的机制：逆转录酶首先与RNA结合形成复合物，然后通过酶活性，将RNA分子上的核苷酸逐个反向转录成DNA链上的互补核苷酸。
RNA提取-反转录-半定量PCR
RNA提取原理及每个步骤的原理一、实验目的：提取组织中RNA,作为逆转录cDNA的原料二、实验原理：（异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法）a） TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂，它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。
试剂主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。
加入氯仿后离心，样品分成水样层（无色）和有机层（黄色）。
RNA存在于水样层中。
收集上面的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。
在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。
乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。
三、实验材料：氯仿，异丙醇，Rnase-free ddH2O，75%乙醇（用Rnase-free水配制）四、实验步骤：（TIANGEN：Phase lock Gel TM Henny 配合Trizol A+提总RNA 操作）实验流程图细胞细胞选择冷贴壁细胞斗悬浮细胞pHS.71.匀浆处理（*打开离心机，降温）a） -80℃冻存组织，转移至普通2ml管中，每30mg组织加1ml Trizol A+。
用匀浆仪匀浆，样品体积不超过Trizol A+体积的10% （注：先加7003 Trizol A+,再加3003，防止外溢；一般匀浆1.5~2min,可设Timer）裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中2.将匀浆样品在20℃左右放置5min使RNA充分释放到溶液中3. 将Phase lock Gel TM（PLG）置于离心机中，15000Xg 离心30s离心到底部，不让贴壁4.将第2步中的匀浆样品全部转移至离心后的PLG中，每1ml Trizol A+加入0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s分层，PLG可在在水相和有机相之间形成一层致密的固体，将中间层的蛋白杂质和下层有机相完全锁在固体之下，这样，全部水相样品可轻松吸出，完全不用担心混入杂质，也不用担心酚氯仿会不小心流出来。