隐甲藻_Crypthecodiumcohnii_悬浮培养生产DHA
寇氏隐甲藻不同破壁方法的研究
１．１试验材料
酶（酶活：１０—１４０万ｕ／ｇ）、中性蛋白酶（酶活：２０万
Ｕ／ｇ）、碱性蛋白酶（酶活：２０万Ｕ／ｇ）、木瓜蛋白酶 （酶活：２０万Ｕ／ｇ）和糖化酶（酶活：２０万Ｕ／ｇ）：南宁 庞博生物工程有限公司。
验通过对各种破壁方法的研究，找到了一种较为理 想的破壁方法。
属ｎ一３系列长链多不饱和脂肪酸¨－２．１。ＤＨＡ是一 种功能性脂肪酸，它是人体大脑细胞的重要组成成 分，占大脑脂肪酸的２５％一３３％，在胎儿及婴幼儿大 脑和视觉系统发育过程中占有十分重要的地位，还 能有效防止老年痴呆症，被称为“高智商因子”、“脑 黄金”【３－ｓ］。此外，ＤＨＡ还具有加速骨骼增长，防止 骨质疏松；减少神经衰弱及抑郁症的发生；降低心肌 梗塞、动脉硬化、高血压等心血管疾病发生的概率的 功能；甚至具有抗癌作用，可促进成年人外周血液单 核细胞的增殖，提高机体免疫力，抑制肿瘤细胞的增 生。因此，ＤＨＡ在婴幼儿配方乳粉和配方食品、功能 性饮料、食用油脂及其它方面都有着广泛的应
Ｃ Ｄ Ｅ
口３ ｈ
口６ ｈ
［２】王永华．隐甲藻高密度发酵培养和油脂改性研究［Ｄ］．广 州：华南理工大学，２００２ ［３］胡爱军，丘泰球．梁汉华．海藻ＥＰＡ、ＤＨＡ古量及分离浓缩 方法［Ｊ］．海洋通报，２００２，２１（２）：８４—９ｌ
Ｆ
复合酶种 田４复合酶对寇氏隐甲藻的破壁率的影响
［４］吴忠兴，庄惠如，陈坚，等．利用微藻培养生产ＤＨＡ的研 究进展［Ｊ］．江西农业大学学报：自然科学版，２００１，２４ （５）：７３７—７４０ ［５］温少红，李叙风，鞠宝，等．微藻高度不饱和脂肪酸的研究 ［Ｊ］海洋通报，２０００，１９（４）：８６—９１ ［６］高亚辉．海洋微藻分类生态及生物活性物质研究［Ｊ］．厦 门大学学报．２００１．４０（２）：５６６—５７２
利用寇氏隐甲藻发酵生产二十二碳六烯酸DHA
利用寇氏隐甲藻发酵生产二十二碳六烯酸(DHA)二十二碳六烯酸 (Docosahexaenoic acid，简称DHA) 是多不饱和脂肪酸的一种，因其在人体和动物体内的重要生理功能而倍受人们的青睐。
研究表明，DHA是人体某些组织中细胞膜的基本组分；对婴幼儿视觉系统和神经系统的发育起着重要作用；还具有降低胆固醇作用，抗凝血功效以及抑制癌功效，防止老年性痴呆症等，并且它是幼儿生长所必需的一种脂肪酸。
可广泛应用于乳制品、保健食品、生物医药等领域。
DHA属ω-3系列。
DHA是人体的重要组成部分，对婴幼儿的生长发育起着非常重要的作用。
二十二碳六烯酸：属ω-3长链不饱和脂肪酸，简记为C22：6（n-3）化学名：二十二碳-4，7，10，13，16，19-六烯酸（全顺）油脂分子式：C22H32O2,分子量：328.5性状：产品呈浅棕黄色的油状液体（25℃）易溶于丙酮、乙醚、石油醚、正己烷等有机溶剂，不溶于水。
具有本产品特有的滋味和气味，无焦臭、酸败及其他异味。
功能及用途：DHA(二十二碳六烯酸)是人体必需的ω-3型脂肪酸。
综合国内外研究资料和文献，主要具有下列生理功能：① 健脑作用。
促进胎儿脑发育，提高儿童智力；② 降血脂作用。
主要降低血浆甘油三脂、总胆固醇和极低密度脂蛋白含量；③ 抑制血小板聚集，减少血栓的形成；④ 抗动脉粥样硬化，预防心肌梗塞；⑤ 预防老年性痴呆，延缓衰老；⑥ 防止癌症。
当前国际营养学界将DHA 誉为功能性食品中最富开发前景的跨世纪的“智慧食品”和“营养保健食品”。
主要应用于：★ 用于孕妇营养补剂和乳幼儿特殊奶粉；★ 作为食品添加剂（营养增补剂）和饲料添加剂。
美国马泰克公司是最著名的生产DHA藻油的生产厂商，该公司生产的DHA是美国唯一允许使用于美国销售的婴儿配方奶粉，著名品牌的配方奶粉（如进口的雅培、惠氏、国产的多美滋、伊利等）添加的DHA来自于美国的马泰克公司。
国内主要生产企业：润科生物工程有限公司与长沙佳格生物技术有限公司技术水平：生物量：35 g/LDHA: ≤ 14 g/L发酵时间：5天发酵类型：分批+间歇补料装料系数：70 %生产菌：寇氏隐甲藻〔Crypthecodinium cohnii〕。
利用代谢组学研究隐甲藻葡萄糖耐受及DHA生物合成机制
利用代谢组学研究隐甲藻葡萄糖耐受及DHA生物合成机制Metabolomics Analyses of Glucose Tolerance and DHA Accumulationin in Crypthecodinium cohnii一级学科：化学工程与技术学科专业：生物化工作者姓名：李兴锐指导教师：张卫文天津大学化工学院二零一七年四月摘要寇氏隐甲藻是海洋微藻生产DHA研究领域关注的热点，因其油脂及DHA 含量高，且其他多不饱和脂肪酸在总脂肪酸中的百分含量不超过1%。
然而在隐甲藻生产DHA过程中葡萄糖抑制作用明显，因此选育耐受葡萄糖的隐甲藻对于改善DHA发酵能力具有重要的意义。
本文首次通过定向驯化获得了一株高耐受葡萄糖的隐甲藻驯化株。
驯化过程经历650天，驯化株在葡萄糖耐受性及油脂积累方面显著提高。
在45 g/L葡萄糖浓度条件下，比生长速率提高了2.8倍，平均倍增时间缩短了31.9%，葡萄糖消耗速率提高了2.6倍，油脂含量提高了15.5%。
代谢组分析结果表明驯化株相对于出发株，21个代谢物明显上调，甘油、谷氨酸、丙二酸及琥珀酸作为核心化合物和驯化株耐受性提高有关联。
研究从全局水平理解并探索适应性机制，可为隐甲藻的育种提供重要的依据。
另一方面，从代谢角度研究隐甲藻生长及DHA生物合成特性，对隐甲藻发酵生产DHA产业的发展具有重要意义。
本文首先建立了隐甲藻间歇补料培养体系，所收获的生物量、DHA产量及DHA产率都分别达到42.9 g/L，5.7 g/L及47.5 mg/L/h。
从48 h到72 h油脂积累显著，提高了27.5%，从72 h到96 h DHA积累显著，DHA在总脂肪酸的百分含量提高了17.8%。
继而利用热图分析代谢组数据，结果显示G6P、GAP、AKG、OXA、DHAP可能和隐甲藻不同生长时期的表型相关。
此外，氧气供应在工业微生物发酵中起着着举足轻重的作用，为了研究氧气供应对隐甲藻DHA生产的影响，本文考察了不同溶氧条件下隐甲藻DHA生产能力的变化。
一种提高隐甲藻DHA产量的方法[发明专利]
![一种提高隐甲藻DHA产量的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/fe2059c5bcd126fff6050b93.png)
专利名称：一种提高隐甲藻DHA产量的方法 申请号：CN20181108034 0.4 申请日：20180917 公开号：CN109022509A 公开日：20181218
摘要：本发明属于藻类技术领域，公开了一种提高隐甲藻DHA产量的方法，其包括如下步骤：步 骤1）种子培养：将隐甲藻活化，然后接入装有摇瓶种子培养基的培养瓶中进行摇瓶种子培养，然后 接种到种子罐培养基中进行培养，得到隐甲藻种子液；步骤2）发酵：将隐甲藻种子液接种到含有发 酵培养液的反应池中，培养至72h时，往发酵培养液中添加花生四烯酸和没食子酸丙酯，继续培养 4 8‑72h，然后收集藻细胞，用于提取DH A。本发明方法简单可行，隐甲藻生物量和DH A产量均大幅 提高，能够实现工业化生产。
申请人：杭州园泰生物科技有限公司 地址：311400 浙江省杭州市富阳区场口镇工业园区上庄路3号第6幢 国籍：CN 更多信息请下载全文后查看
隐甲藻发酵产DHA最佳无机盐浓度的确定
学 惠赠 。 １２ 茵种保 藏 和种子 培 养基 （ ） ． Ｌ
对海 洋 藻类 而言 ， 细胞 生长需 要一 定 的渗透 压 ，
一
定浓 度 的 Ｎ Ｃ 可 以 维 持 细胞 内 渗 透 压 的平 衡 。 ａ１
葡 萄糖 ５ｇ酵母粉 １ｇ胰蛋 白胨 １ ， 造 海 水 ， ， 人 ｇ ０５Ｌ 土壤水 ０ １Ｌ蒸 馏水 ０４Ｌ ， ． ， ． 。 １３ 发酵培 养基 （ ） ． Ｌ 葡萄糖 ２ ， ５ｇ酵母 膏 ２ｇ 人造 海 水 Ｏ５Ｌ 土 壤 ， ． ，
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２ （ 年第 ２ ０２ １ ７卷第 ２ 期
文章编号：０３ ９９２ｏ ） ｌ０—７ ６ （ ２Ｏ ０
２ ０ ＿３
中图分类号 ：Ｑ ４ Ｔ６１
文献标识码 ： Ａ
隐 甲藻 发 酵 产 Ｄ Ａ最 佳 无 机盐 浓 度 的确 定 Ｈ
王永华 ， 梁世 中， 杨 博， 吴海珍
１４ １ 摇瓶 发 酵培 养 ： ５０ｍ 的摇 瓶 中 ， ．． 在 ０ １ 加入 ８ ０ 盯 培养 基 ， 种量 １％ ， ２℃ ，４ ／ ｌ ｄ 接 ０ 于 ６ １０￣ｍｎ培养 。 １４２ 生物 量 测定 ： ，． 干重 法。
收稿 日期 ：∞１ ８ ２ ２ —ｏ —０ 基金项 目： 广东省 自然科学基金项 目（７４６ ９Ｏ８ ）
（ 南理 工大学食品与生物 工程 学院，１６０广 州市五 山） 华 ５０４
摘 要 ： 讨 了在 摇瓶 备件 下 ，ａＩＭ 、Ｏ 对 隐 甲藻 生 长 、 探 Ｎ Ｃ、 Ｐ ４ 油脂 和 Ｄ ＨＡ积 累的 影响 ， 定 了 确
它们 的最 适农度 。Ｎ Ｃ 的 最适 浓度为 ｏ ９ｇ Ｌ Ｋ ２ ０ 的 最适 浓度 为 ｏ ８ｇ Ｌ Ｍ 的 最适 浓 度 为 ａｌ ． ／ ， Ｈ Ｐ ４ ． ／，
DHA的来源及寇氏隐甲藻生产DHA的研究
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＤＨ Ａ ｉｓ ａ ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｔｈａｔ ｂｅｌｏｎｇｓ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏ－３ ｇｒｏｕｐ．Ｉｎ ｒｅｃｅｎｔ ｙｅａｒｓ，ＤＨＡ ｈａｓ ａｔｔｒａｃｔｅｄ ｍｕｃｈ ａｔｔｅｎｔｉｏｎ ｂｅｃａｕｓｅ ｉｔ ｐｌａｙｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅａｌｔｈ．Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ ｃｏｈｎｉｉ ｉｓ ｅｘｔｒａｏｒｄｉｎａｒｙ ｉｎ ＤＨＡ ａｎｄ ｉｔ Ｃａ ｎ ｂｅ ｇｒｏｗｎ ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｅａ ｌｌｙ ｏｎ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｌｉｇｈｔ．Ｉｔ ｉｓ ａ ｐｒｏｌｉｆ ｉｃ ｐｒｏｄｕｃｅｒ ｏｆ ＤＨＡ．Ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ ｒｅｖｉｅｗｓ ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＨＡ ｂｙ Ｃ．ｃｏｈｎｉｉ．
油 加 工产 品 、海 洋 微 藻类 及 某 些 真 菌类 等 。
控 作 用 。游 动 细 胞 自然 条 件 下能 以每 年 ｌｋｍ 的 速度 移 动 。孢 囊
２．Ｉ 鱼 油
形 式 的细 胞 是 卵 球形 的 ．可用 在 环 境 条件 恶 劣 时 通 过休 眠存 活
鱼油 是 ＤＨＡ 的传 统来 源 ．鱼 油 是 指从 鱼 或 鱼 加工 的下 脚 料 下 来 ．孢 囊 形 式 的寇 氏隐 甲藻 比游 动 形式 的具 有 更 高 的油 脂 含
间 ．如 果 ＤＨＡ 摄 人 量 不 足 ．会 导 致 胎 儿 的脑 细胞 生 长 和 发 育 不 一 些 ，且 他 们 比 普 通 儿 童 的 视 觉 灵 敏 ；长 期 缺 乏 ＤＨＡ，则 视 力
正 常 ，严 重 的会 产 生 弱 智 。在 婴 幼 儿 时 期 。大 脑 处 于生 长 发 育 阶 会 降 低 ．这 主 要 由 于 ＤＨＡ 能 促 进 视 神 经 膜 延 伸 和 维 持 视 觉 正
利用隐甲藻生产多不饱和脂肪酸和蛋白饲料添加剂的方法[发明专利]
![利用隐甲藻生产多不饱和脂肪酸和蛋白饲料添加剂的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/939898de0b4c2e3f5627636a.png)
专利名称：利用隐甲藻生产多不饱和脂肪酸和蛋白饲料添加剂的方法
专利类型：发明专利
发明人：朱明军,王菊芳,郭星,梁世中
申请号：CN200910193736.4
申请日：20091106
公开号：CN101717800A
公开日：
20100602
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种利用隐甲藻生产多不饱和脂肪酸和蛋白饲料添加剂的方法。
本发明利用隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)在气升式生物反应器中发酵同时生产多不饱和脂肪酸和蛋白饲料添加剂，包括微藻种子液制备、发酵、藻体收集和干燥、多不饱和脂肪酸的提取几个步骤。
本发明方法得到的精炼油中DHA含量达36.5％，提取多不饱和脂肪酸后微藻渣(干)蛋白质含量达到46.3％，本发明方法不仅可以生产多不饱和脂肪酸以及DHA，而且可以充分利用提取脂肪酸的藻渣，具有经济可行性，而且可以变藻渣为宝，实现多不饱和脂肪酸的清洁生产。
申请人：华南理工大学,江西泰成生物科技有限公司
地址：510640 广东省广州市天河区五山路381号
国籍：CN
代理机构：广州粤高专利商标代理有限公司
代理人：何淑珍
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寇氏隐甲藻生产DHA的研究进展
第49卷第12期2020年12月应用化工Applied Chemical IndustryVol.49No.12Dec.2020寇氏隐甲藻生产DHA的研究进展杨晓辉，贾晓强(天津大学化工学院系统生物工程教育部重点实验室，天津300354)摘要:介绍了当前国内外二十二碳六烯酸(DHA)的生产和研究现状,寇氏隐甲藻是有较高DHA生产能力的优势菌株。
由于当前我国DHA产能较低,需依赖进口满足需求，因此通过对优势生产菌株进行分析和改造来进一步提高DHA的产量迫在眉睫。
同时详细介绍了高产菌株隐甲藻的胞内生产机理，以及通过各种理性优化和分子改造手段提高隐甲藻产DHA能力的研究。
最后,针对利用隐甲藻生产DHA领域目前尚存在的问题进行总结并对应提出建议，为DHA生产相关研究进行了展望。
关键词:寇氏隐甲藻;二十二碳六烯酸;生产中图分类号:TQ95；Q81文献标识码:A文章编号：1671-3206(2020)12-3126-06Progress in production of docosahexaenoicacid by Crypthecodinium cohniiYANG Xiao-hui9JIA Xiao-qiang(Key Laboratory of Systems Bioengineering of Ministry of Education,School of Chemical Engineering andTechnology,Tianjin University,Tianjin300354,China)Abstract:The production and research status of docosahexaenoic acid(DHA)at home and abroad are introduced.Crypthecodinium cohnii is a dominant strain with high DHA production capacity.Due to the current low capacity of DHA in China and the need to rely on imports to meet demand,it is urgent to further improve the production of DHA through analysis and transformation of dominant production strains.At the same time,the mechanism of intracellular production of the high-yielding strain and the research of improving the DHA production ability of C.cohnii by various rational optimization and molecular transformation methods are introduced in detail.Finally,some problems in the production of DHA by C・cohnii are summarized and corresponding suggestions are put forward, and the research on DHA production is prospected.Key words:Crypthecodinium cohnii；docosahexaenoic acid；production脂肪酸是由桂链和竣基组成的有机化合物，多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid,PUFA)是其中的一类⑴。
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第21卷第4期2002年7月无锡轻工大学学报Journal of Wuxi University of Light IndustryVol.21 No.4Jul. 2002文章编号:1009-038X(2002)04-0344-03收稿日期:2001-12-24; 修订日期:2002-04-28. 基金项目:广东省自然科学基金项目资助课题(970486).作者简介:王菊芳(1973-),女,湖北松滋人,工学博士,讲师.隐甲藻(Cryp thecodium cohnii )悬浮培养生产DHA王菊芳1, 梁世中1, 陈峰2(1.华南理工大学食品与生物工程学院,广东广州510640;2.香港大学植物学系,香港薄扶林道)摘 要:研究了培养温度、初始pH 、碳源及氮源等对隐甲藻(Cryp thecodinium cohnii ATCC30556)悬浮培养生产DHA 影响.通过正交试验得到的优化培养基组成为(g/L):葡萄糖20,甘油20,蛋白胨5,KNO 35,NaCl 6,M gSO 41.6,KH 2PO 41.0,VH 0.006,VB 120.001,另外添加1mL/L 橄榄油,6mL/L 丙酮酸.优化培养条件为:5%接种量,初始pH 7.0.黑暗条件培养,装液量为500mL 三角瓶装50mL 培养基,30e 培养32h 后转到20e 培养直至收获.在优化培养基配方和培养条件下,隐甲藻悬浮培养64h 后,生物量和DHA 产量分别为10.78g/L 和1.21g/L.关键词:隐甲藻;悬浮培养;二十二碳六烯酸(DHA)中图分类号:Q 949.241文献标识码:AStudies on Docosahexaenoic Acid Production by Suspension Culture ofCrypthecodinium cohnii ATCC 30556WANG Ju -Fang 1, LIANG Sh-i Zhong 1, CHEN Feng2(1.College of Food and Bio engineering ,South China U niversity of T echnolog y,G uang zhou 510640,China; 2.Depart -ment of Botany,HongK ong University,Hongko ng,China)Abstract:The effects of the culture temperature,initial pH of medium,carbon source and nitrogensource on the production of docosahexaenoic acid by Cryp thecodinium cohnii ATCC30556w ere stud -ied.T hrough orthogonal experim ents,the optim um culuture medium w as obtained(g/L ):g lucose,20;glycerol,20;peptone,5;KNO 3,5;NaCl,6;Mg SO 4,1.6;KH 2PO 4,1.0;vitamin H,0.006;vitamin B 12,0.001as w ell as 1ml/L olive oil and 6m l/L pyruv ic acid.Optimum culture conditions were follow ing s:5%inoculum ,initial pH 7.0,culture in dark,50m L medium in 500mL flask,after culturing at 30e for 32h,then shifting into 20e until harvesting.Under the optimal conditions,dry biomass and DHA yields w ere 10.78g /L and 1.21g/L respectively after 64hours .suspension culture in flask.Key words:Cryp thecodinium cohnii ;suspension culture;docosahex aenoic acid微藻能生产多种多不饱和脂肪酸[1,2],其中的二十二碳六烯酸(Docosahex aenoic acid,简称DHA)对智力发育、治疗心血管疾病、抗肿瘤、防治老年痴呆以及抑制癌变等方面有着重要的生理调节功能和保健作用,在疾病预防及治疗方面已引起了广泛的兴趣[3].由于化学方法无法合成DHA,目前DHA主要来源于深海鱼油,但存在着产量不稳定、分离提纯困难以及产品有鱼腥味等缺点.利用微藻培养生产DHA 可克服以上不足,不仅可全年进行生产,还可通过控制培养环境及营养方式控制脂质产量和组成,而且脂质组成简单,DHA 含量高,分离提纯简便.目前,我国在利用海洋微生物生产DHA 方面的研究工作刚刚起步.经过多年研究,作者筛选得到的一株隐甲藻(Cry p the -codinium cohnii ATCC30556)异氧培养具有较高的产DHA 能力[4],其脂肪酸组成的30%以上是DHA,而其他的多不饱和脂肪酸不超过1%,是生产DHA 的良好藻种.1 材料与方法1.1 藻种隐甲藻(Cryp thecodinium cohnii ATCC30556)由香港大学植物学系陈峰博士筛选,作者所在实验室保存.1.2 培养基组成采用Porphy ridium[5]培养基,每升基础培养基含:人造海水500mL,蒸馏水400mL,泥土浸出液100mL,胰蛋白胨1g,酵母抽提物1g,葡萄糖5g.1.3 藻种细胞干重的测定100mL 藻种细胞装入预先称重的离心管中,4000r/m in 离心10min,沉淀后用蒸馏水清洗3次,50e 下真空干燥,定期取出,在干燥器内冷却后称重,直至恒重(DC).1.4 脂质提取改进的Bligh 和Dyer 法提取脂质[6].1.5 DHA 含量测定脂质成分加入一定量内标物(十七烷酸),用甲醇钠/甲醇溶液甲酯化,用正己烷多次萃取,收集后用氮气吹干,重新定容后用毛细管气相色谱法分析.色谱条件:热导池检测器,DB -5毛细管柱(0.35mm @15m).载气为氦气,体积流量20mL/min,初温170e ,保留2m in,升温速率8e /min,终温235e ,保留8min,汽化室温度及检测器温度均为265e .2 结果与分析2.1 培养温度对隐甲藻产生DHA 的影响对微藻体内脂肪酸的代谢途径而言,培养温度较高有利于细胞生长,培养温度较低则有利于脂肪酸的累积[7].实验设计5种培养温度:15,20,25,30,35e 及3种温度转换处理:30e (24h )y 20e ,30e (32h)y 20e 和30e (40h)y 20e ,从培养0h 开始,每8h 取样1次,摇瓶测定培养温度、隐甲藻生长和DHA 产量的影响,结果见表1.隐甲藻体内DHA 积累的温度低于生长的最适温度,15,20,25e 3种培养温度时DHA 产量接近,30e (32h)y 20e 处理可获得最大的DHA 产量(0.29g/L).温度转换处理的最佳时间为培养32h,太早或太晚进行温度转换,最终获得的DHA 产量都偏低.表1 培养温度对隐甲藻生产DHA 的影响Tab.1 Effect of culture temperature on the production ofDHA by Crypthecodinium cohnii ATC C30556培养温度/e细胞干重/(g/L)DHA 产量/(g/L )15 2.290.2620 2.480.2625 2.800.2630 2.810.17351.700.01830(24h)y 202.210.2030(32h)y 20 2.740.2930(40h)y 202.810.192.2 初始pH 对隐甲藻产生DHA 的影响研究了6种初始pH 值对隐甲藻产生DHA 的影响,结果见表2.初始pH 为7.0时,生长最快,DHA 产量也最高.表2 初始pH 值对隐甲藻生产D HA 的影响Tab.2 Effect of initial pH on the production of DHA byCrypthecodinium cohnii A TC C30556初始pH 细胞干重/(g/L)DHA 产量/(g/L)5.00.410.00895.5 1.650.0566.0 1.900.0986.5 2.700.247.0 3.060.29345第4期王菊芳等:隐甲藻(Cryp thecodium cohnii )悬浮培养生产DHA2.3碳源对隐甲藻产生DHA的影响在基础培养基中,以相同的含碳量选用4种单一氮源:葡萄糖、甘油、糖蜜、乙酸钠,4种复合碳源(1B1):葡萄糖/甘油,葡萄糖/乙酸钠,葡萄糖/糖蜜,糖蜜/甘油.摇瓶培养测定隐甲藻生物量和DHA 产量,结果见表3.对隐甲藻生长最有利的单一碳源是葡萄糖,最大生物量为3.06g/L,以甘油为单一碳源培养DHA产量最高为0.33g/L.隐甲藻培养最佳复合碳源为1B1的葡萄糖/甘油,DHA产量为0.54g/L.表3碳源对隐甲藻生产DHA的影响Tab.3Effect of carbon source on the production of DHA by Crypthecodinium cohnii A TC C30556碳源细胞干重/(g/L)DHA产量/(g/L)葡萄糖 3.060.28甘油 1.490.33糖蜜 1.670.21乙酸钠 1.240.14葡萄糖/甘油 3.060.54葡萄糖/乙酸钠 2.800.20葡萄糖/糖蜜 3.160.25糖蜜/甘油 3.470.502.4氮源对隐甲藻产生DHA的影响在基础培养基中,保持总含氮量为0.34g/L,选用6种单一氮源:胰蛋白胨、蛋白胨、硝酸钾、硝酸钠、硝酸铵、尿素及5种蛋白胨/硝酸钾比例复合氮源:蛋白胨-氮与NO3--N分别为3B1,2B1,1B1, 1B2,1B3,摇瓶培养结果见表4.当复合氮源中蛋白胨-氮与NO3--N为1B2时,隐甲藻有着最大的生物量和DHA产量,分别为2.98g/L和0.53g/L.表4氮源对隐甲藻产生DHA的影响Tab.4Effect of nitrogen source on the production of DHA by Crypthecodinium cohnii ATC C30556氮源细胞干重/(g/L)DHA产量/(g/L)胰蛋白胨 2.780.31蛋白胨 2.700.33硝酸钾 2.500.29硝酸钠 1.820.28硝酸铵 1.420.13尿素 1.800.19蛋白胨-氮B硝酸根-氮=3B1 2.770.37蛋白胨-氮B硝酸根-氮=2B1 2.850.40蛋白胨-氮B硝酸根-氮=1B1 2.880.46蛋白胨-氮B硝酸根-氮=1B2 2.980.53蛋白胨-氮B硝酸根-氮=1B3 2.800.45 2.5最适培养基组成及培养条件的确定利用正交试验考察了培养基中碳源、氮源、无机盐以及培养条件等对隐甲藻产生DHA的影响,其最适培养基组成为(g/L):葡萄糖20,甘油20,蛋白胨5,KNO35,NaCl6,M gSO41.6,KH2PO41.0, VH0.006,VB120.001.另外每升培养基添加橄榄油1mL,丙酮酸6mL.优化培养条件为:采用5%接种量,初始pH7.0,黑暗条件培养,装液量为500 mL三角瓶装培养基50mL,30e培养32h后转到20e培养直至收获.在优化培养基配方和培养条件下,隐甲藻悬浮培养64h后生物量和DHA产量分别为10.78g/L和1.21g/L,DHA产率和底物转化系数分别为0.489g/(L#d)和0.359g/g.DHA产量同优化前相比有大幅度的提高,DHA产量仅次于Martek公司产品[4].参考文献:[1]COHEN Z.Production potential of eicosapentano ic acid by M onodus subterr aneus[J].JA OC S,1994,71(9):941-945.[2]BEHR EN S P W,HOEKSEM A S D,ARN ET T K L,et al.Nov el micr obial products fo r medicine and agr icultur e[M].A m-stedam:Elsevier Science Publishers,1989.253-259.[3]GIL L I,V AL IV ET Y R.Po lyunsatur ated fatty acids,P ar t I:Occurrence,biolo gical act ivities and applications[J].TITEC H,1997,15:401-409.[4]JIA NG Y,CHEN F,L IAN G S Z.P roduction potential of docosahex aenoic acid by the hetero trophic mar ine dinoflag ellateCr yp thecodinium cohnii[J].Process Biochemistry,1999,34:633-637.[5]STA RR R C,ZEIK U SI J A.U T EX-t he cultur e collection of alg ae at the university of T ex as Austin[J].J Phycol,1993,29(suppl):94.[6]王菊芳,梁世中,陈峰.碳源对隐甲藻(Cry p thecodinium cohnii)生长及DHA产量的影响[J].中国油脂,2000,25(6):209-211.[7]SU U T ARI M,PRIHA P,L AAK SO S.T emper ature shifts in regulatio n of lipids accumulated by L ip omy ces star key i[J].JAOCS,1993,70(9):891-894.(责任编辑:李春丽) 346无锡轻工大学学报第21卷。