开发灵敏度高、重复性好的侧流检验产品---第一部分_中译文

开发灵敏度高开发灵敏度高、、重复性好的重复性好的侧流侧流侧流检验检验检验产产品------第一部第一部分：解决解决老问题的新老问题的新老问题的新途径途径途径译者按：在某些网站发表的中译本似乎是机器翻译输出的，原文的翻译存在一些错误。

因此业为基生物科技有限公司从更专业的角度对原文进行了翻译选择选择材料进行和材料进行和材料进行和采用新方法采用新方法采用新方法的的生产工艺改善生产工艺改善检验检验检验性能性能性能侧流检验是适合在多种POC 场合 或者现场使用的稳定实用技术。

然而，该技术在要求非常灵敏、重复性好或者需要获得定量结果的情况尚未广泛适用。

近年，在各种非传统市场领域对该技术的兴趣与日俱增。

驱动侧流检验技术复兴的综合因素包括：现有技术面临专利压力，其他拥有更好灵敏度、可重复性和定量性的新技术，或者结果的客观记录性；市场需要投入周期短且投资合理的POC 或现场使用的分析技术。

图1 侧流免疫检测技术作为POC 或现场应用的优点侧流免疫检测(lateral-flow immunoassay ，LFIA)系统的优势众所周知(见图1)。

其决定性的优点在于该技术适合POC 或者现场使用，具有投资小、入市快的特点，且应用范围广。

这些优点是其他当前正在开发的推定POC 技术(包括传感器和基于阵列的技术)无法相比的。

侧流检验技术已经在一些子市场内得到引入和发展(见图2)。

然而，生产适合这些子市场需要的侧流检验产品一直面临挑战。

随着应用扩展，增加了对技术的灵敏度、重复性和生产性的要求。

例如，要求定量和客观的读取/记录技术，能与实验室信息系统对接。

除了改进材料、分析技术、读取仪技术和生产工艺外，侧流检验开发也需要更多的学科交叉途径。

图2 在POC 和现场应用的侧流检验免疫检测技术的子市场。

近年，涌现出一批生产侧流检验产品的新途径以适合这些需求。

每种新途径都会促使我们用刷新视角审视IVD 公司如何生产这类产品的基本原理。

这是两部系列中的第一篇文章，阐述了开发和生产高灵敏、重复性好的LFIAs 产品存在的挑战性问题，对克服传统技术局限的革新进行了概述。

本文审视传统生产技术和材料，不仅讨论每个环节的局限，而且讨论克服这些局限的具体步骤。

硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜图3 侧流检验生产工艺路线梗概图3描绘了侧流测试条的传统常规生产流程。

IVD 行业内用于该系统的物料和工艺流程基本保持不变。

硝酸纤维素膜(Nitrocellulose , NC)材料被大多数侧流检验产品系统选用。

市场对其他材料的尝试(例如：尼龙膜和PVDF 膜)仅获得有限成功。

究其原因包括成本、使用局限、新的化学和工艺的知识要求和使用NC 膜现有巨大经验积累库的惯性。

虽然NC 膜也不是LFIAs 中分析用膜的理想材料，但它的确具备某些在该应用领域的有用特性。

这些特性包括成本低、真毛细管流动、高蛋白结合容量、上手操作相对容易(有聚酯背衬)，具备不同的芯吸速率和表面活性组分的产品唾手可得。

虽有这些积极的特性，NC 膜也有许多的缺点。

后者包括批内批间性能重复性差、保质期问题、易燃性和易损性(无背衬膜)，以及随环境条件易变特性，例如湿度。

对于NC 膜的这些问题，检验开发者和IVD 生产商要花费相当多的时间和精力优化化学配方以克服材料内在问题。

他们也优化生产工艺以保证产品在整个保质期内性能合格。

仔细控制关键步骤如分液、浸渍和烘干过程，注意对膜的化学和生物处理，以防在终产品中引入额外变量，这些环节对产品成功至关重要。

膜的试剂分液膜的试剂分液 (划膜划膜))对于标准的LFIAs 产品，NC 膜上至少有一条测试线和一条控制线。

该过程使用分液器在单位长度膜上分配恒量液体。

IVD 生产商使用两种分液方法：接触式和非接触式。

接触分液系统中，喷头拖划膜表面，同时试剂泵驱动从喷头处释放一定量液体到表面上。

该系统简易价廉，然而，该过程喷头与膜表面接触会导致划痕。

另外，由于液体进入膜的过程不仅依靠膜表面与喷头的接触，而且与膜的吸液能力的一致性有关，线条宽度可发生变化。

该变化可成为读条器分析检测的主要问题，因为读取仪输出的结果与线的宽度相关。

该问题可导致检测结果不一致且完全不能定量。

图4 BioDot公司的XYZ 3050分液平台配有 BioJet Quanti 3000 和AirJet Quanti 3000喷头图5 使用接触式和非接触式分液方法对比，分液到膜上的蛋白线条宽度。

另一种选择是非接触式分液系统，例如BioDot Inc.(Irvine, CA)的BioJetQuanti 3000系统(见图4)。

BioJet使用微电磁阀连接高精度步进泵，液体微滴喷到膜上，紧密交迭的液滴点构成连续线条。

试剂在液滴接触处被吸收入膜内，排除了膜表面与喷头的接触影响因素。

因而，非接触喷点的线条宽度比接触喷点更均一。

使用接触和非接触式喷头喷点的线条宽度进行比较如图5所示。

图6 BioDot 公司的RTR 4500连续喷点系统中的连续生产成像与坏段标识系统实时流线处理方式更易控制，因为分液过程与成像系统偶联，能检查分液线条的质量同时标记任何坏的部分(见图6)。

实时在线分液设备能分配出一致的线条宽度，同时成像系统能实时评估线条质量。

膜封闭膜封闭((封膜封膜))在侧流系统中，膜封闭具有多种功能，包括防止和减少样品或配合物对捕获线和整个膜的非特异性吸附。

封闭也被用于控制层析速率和稳定测试、对照线蛋白。

封闭过程包括将制作试纸用膜浸泡在由蛋白、表面活性剂和聚合物组成的水溶液中。

然后将膜取出、划膜、干燥。

封闭处理可采用批处理或连续处理两种模式，使用连续处理流线工艺，可使浸泡和烘干获得最佳一致性。

这两个步骤对合格的产品性能和可重复性都至关重要。

烘炉批次间干燥不均一所造成产品性能的差异可通过使用连续干燥系统得以克服。

例如，干燥塔以相同的方式处理每个部分，容易对比验证烘制批次，不受温度和湿度的差异影响，并可提高效率。

图7 在RTR 4500中质量控制成像系统输出数据。

分液在NC 膜上运行：50 m 分液长度，50 mm/sec，人 IgG，1 mg/ml，0.8 ul/cm。

实时流线式浸泡和干燥可使处理材料更加均一，原因如下：在浸渍槽内单位长度材料的沉湎时间一致；干燥塔中单位长度垫的干燥时间一致；减少了槽内批次溶质拖拽不均的影响，因实时流线式浸泡槽连续地补液并混合，使得溶液浓度保持一致。

很不幸，若使用NC 膜，必然要封闭。

封闭工艺防止产品在保质期内发生变异是必须的，但这会增加成本和生产复杂性。

图8a 和8b 展示了封闭对产品初期和随时间推移性能的影响。

该图对比了浸泡和非浸泡封闭金标产品的定量性能、视觉读条情况。

首先，验证封闭过的试纸，结果显示出更低的信号灵敏度和更高的变异系数(CV)，可得出封闭不适合应用在该检测试纸的结论。

然而，当检查移除封闭步骤对系统稳定性的影响时，非封闭的膜对检测产品的重大影响非常明确，原因在于干燥包装储藏后检测时间不同。

IVD 制造商应该细心评估封闭的这些效应。

图8 (a)封闭和未封闭膜在变异系数和线强度方面的比较。

(b)封闭对膜层析速率稳定性的影响。

柱条表示检测试剂流动通过25mm 膜的时间。

DB=浸泡封闭，UB=未封闭。

配合配合垫垫/偶合垫偶合垫((标记垫标记垫))：玻纤、聚酯纤和人造丝在典型的检测系统中，配合垫承载配合物，保证配合物在产品保质期内的稳定性、释放的有效性和重复性。

事实上，配合物分液、干燥和从材料上释放的差异是检测试纸性能差异的主要来源，表现为批内和批间的CVs 值。

配合物混合不均以及配合垫释放均对检测灵敏度产生不利影响。

根据具体系统，尽管配合物的释放快慢可能更重要，但释放必须保持一致性。

由于所使用物料的性质，配合垫应预处理，确保合适的释放和稳定性能。

垫的处理是浸泡在由蛋白、表面活性剂和聚合物构成的水溶液中，然后干燥。

类似膜的浸泡和干燥处理，该工序可应用在手动批次操作模式或连续化流线操作模式，后者能使整个批次材料更加均一。

表I 检测条不同配合物垫上顺磁粒子回收百分率。

(n=10)将配合物添加到已处理垫上的方法要根据测试条的最终性能来评估。

以下两个方法被用来添加配合物：浸泡，将已处理垫浸泡到配合物溶液中；使用定量的非接触分液器，例如使用BioDot 的AirJet Quanti 3000 (见图4)。

配合物定量分液到配合垫上比浸泡工艺有更好的配合物吸附均一性。

配合物分液也影响了配合物从垫上释放的均一性和效率。

另外，配合物分液降低了预处理试剂的洗落，后者在浸泡时出现。

表 I数据展示了在两种不同配合垫上使用配合物浸泡和分液的差异比较。

在该实验中，一定规格的顺磁性颗粒被用于每个垫并使其标准化，因此无论是浸泡法还是分液法，每个垫含有总量相等的颗粒。

干燥过的垫装配到LFIA试纸，使用150 ul缓冲液测试。

配合物释放回收率通过电感耦合等离子体质谱法总铁离子测定总数进行。

图9 (a)样品释放垫上分析物释放比较。

(b)两种样品释放垫材料释放比较。

使用浸泡和分液系统两种不同配合物处理方式，配合物从垫上释放回收情况有显著差异。

分液法处理的配合物与通过浸泡法处理的配合物相比，集中于一个更小区域内，与配合垫的材料接触有限，从而改善粒子从材料上释放。

实验数据进一步证明配合物定量分液能改善测试条的CVs值(见表II)。

该实验用免疫夹心法测试血清中标志物。

比较了饱和法与使用BioDot的AirJet Quanti 3000分液法使用乳胶粒子配合物的情况。

通过标准化使配合物在每个测试条都有同样的量。

结果通过光学读取仪测定。

在重要临床应用范围内应用分液的配合垫，该分析物的CVs值得以改善。

表II 使用不同配合物分液方法在血清配合物测定中的数据比较。

除了配合物体系，标签选择和偶合方法也很重要。

与被动吸附法相比，由于在配体和粒子间具有更稳固的键，共价耦联对于定量分析能力可以是重要的。

新的标签和读取方法将在本系列的第二篇文章中进一步讨论。

样品垫样品垫：：纤维素纤维素、、玻璃纤维玻璃纤维、、聚酯膜和其他的过滤介质聚酯膜和其他的过滤介质在LFIAs 中，样品垫承接样品并处理样品使之与检测兼容。

该过程必须在不能对分析物稳定性产生影响的情况下完成，并高效和高重复性地释放到检测的后续部分。

由于多种可用材料的不均一性和材料中包含的粘合剂不同类型，物料选择可影响分析性能。

如果需要，垫预处理方法必须仔细设计，避免缓冲液浓度梯度和干燥中的边缘效应。

流线法对于垫的均一化处理是最好的方式。

通过检测孕酮竞争定量检测中的 CV 值和线性关系展示了选择合适样品垫材料的重要性，证明了改变材料对检测试性能的影响(如图9和9b 所示)。

该系统评估了两种不同的样品垫材料。

两种垫分别是纤维素材料和其他不能判别的材料。