G418筛选稳定转染步骤
G418原理及筛选方法
G418原理及筛选方法原理分析转化得功能与表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。
外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内,根据细胞类型，至多80%得进入核内得外源DNA得到瞬时表达。
极少数情况下，进入细胞得外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接，最终整合进细胞染色体。
细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一左意味着表达，只有整合到表达区得基因才会表达,而且整合到不同得染色体区段得外源基因得表达得量也就是不同得。
由于摄取、整合、表达外源基因就是小概率事件，通常根据新表型筛选軽軽体。
一般情况下这种新表型由共转染得编码抗生素抗性基因提供。
细菌Tn5转座子序列（ne。
抗性基因）携带得氨基糖昔磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。
G418就是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大靈素、卡那靈素相似，它通过影响80S 核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核与真核等细胞都有毒性，包括细菌、酵母、植物与哺乳动物细胞，也包括原生动物与蠕虫。
就是稳定转染最常用得选择试剂。
当neo基因被整合进真核细胞基因组合适得地方后，则能启动neo基因编码得序列转录为niRNA,从而获得抗性产物氨基糖昔磷酸转移酶得高效表达,使细胞获得抗性而能在含有G418得选择性培养基中生长。
G418得这一选择特性，已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上0418有杀菌作用, 所以有人主张转染时不加英它抗生素。
英实G418本身有很好得杀菌效果，在用G418进行筛选得过程中很少会发生污染。
但有一点，其实我觉得问题也不就是很大，那就就是:在老外得一本实验手册中提到，在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。
我想她得想法可能就是脂质体对细胞膜有影响,可能此时加抗生素对细胞损伤较大。
因为庆大离素、链鑫素.0418 均就是氨基糖貳类药物，其药理作用完全一样。
稳转株：G418浓度确定到单克隆化鉴定教程文件
稳转株：G418浓度确定到单克隆化鉴定稳定转染攻略：从G418浓度确定到单克隆化鉴定摘要 : 一、筛选之前确定G418浓度： 1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和一、筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3′磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%。
4、G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3*106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
G418筛选TZMBL
建立细胞系所用G418 浓度的确定将TZM-bl细胞以1×103个细胞/孔的密度接种到96孔板中。
24 h后，分别用含有100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL……1 000 μg/mL G418的DMEM培养细胞。
2~3天更换新鲜培养基，培养2周，选择细胞全部死亡的最低G418浓度作为细胞筛选的浓度。
最终确定筛选用G418浓度为800 μg/mL。
在做稳定克隆筛选之前，一定要做细胞的梯度敏感实验。
通常用100、200、300、400、500、800 ug/ml六种梯度筛选之前确定G418浓度：1，由于每种细胞对G418 的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2，G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3，汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3*106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h 后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
稳转株：G418浓度确定到单克隆化鉴定
稳定转染攻略：从G418浓度确定到单克隆化鉴定摘要: 一、筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和一、筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3′磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%。
4、G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3*106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
二、加药时间和维持浓度：1、由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
G筛选稳定表达细胞系经验总结图文稿
G筛选稳定表达细胞系经验总结Company number【1089WT-1898YT-1W8CB-9UUT-92108】G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单化鉴定。
有自己的体会也有其他战友遇到的情况,和大家分享.没有总结好的地方，大家补充。
筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3x106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个，按比例1/300孔内应该有几十个，事实上，它们几乎全死光了，只有几个。
加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
G418筛选稳定表达细胞株精要总结
G418筛选稳定表达细胞株精要总结G418筛选稳定表达细胞系总结⼀分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染⾄宿主细胞染⾊体。
外源基因进⼊细胞后，部分能够通过细胞质进⼊细胞核内，根据细胞类型，⾄多80％的进⼊核内的外源DNA得到瞬时表达。
极少数情况下，进⼊细胞的外源DNA通过系列⾮同源性分⼦间重组核连接，形成巨⼤的***结构最终整合进细胞染⾊体。
细胞基因组⾃由部分表达，所以整合并不⼀定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，⽽且整合到不同的染⾊体区段的外源基因的表达的量也是不同的。
由于摄取、整合、表达外源基因是⼩概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。
⼀般情况下这种新表型由共转染的编码抗⽣素抗性基因提供。
细菌Tn5转座⼦序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成⽆毒形式。
G418是⼀种氨基糖类抗⽣素，其结构与新霉素、庆⼤霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能⽽阻断蛋⽩质合成,对原核和真核等细胞都有毒性 ,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞 ,也包括原⽣动物和蠕⾍。
是稳定转染最常⽤的选择试剂。
当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地⽅后 ,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从⽽获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的⾼效表达 ,使细胞获得抗性⽽能在含有Ｇ418的选择性培养基中⽣长。
Ｇ418的这⼀选择特性 ,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等⽅⾯得以⼴泛应⽤。
在进⾏转染时细胞膜受到影响，抗⽣素可能对细胞产⽣较⼤影响，加上G418有杀菌作⽤，所以有⼈主张转让时不加其它抗⽣素。
其实G418本⾝有很好的杀菌效果，在⽤G418进⾏筛选的过程中很少会发⽣污染。
但有⼀点，其实我觉得问题也不是很⼤，那就是：在⽼外的⼀本实验⼿册中提到，在脂质体转染时所⽤培养基中最好不加任何抗⽣素。
我想他的想法可能是脂质体对细胞膜有影响，可能此时加抗⽣素对细胞损伤较⼤。
因为庆⼤霉素、链霉素、G418均是氨基糖甙类药物，其药理作⽤完全⼀样。
G418原理及筛选方法
G418原理及筛选方法原理分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。
外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内，根据细胞类型，至多80%的进入核内的外源DNA得到瞬时表达。
极少数情况下，进入细胞的外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接，最终整合进细胞染色体。
细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的。
由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。
一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供。
细菌Tn5 转座子序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。
G418 是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞都有毒性，包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞，也包括原生动物和蠕虫。
是稳定转染最常用的选择试剂。
当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。
G418的这一选择特性，已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转染时不加其它抗生素。
其实G418本身有很好的杀菌效果，在用G418进行筛选的过程中很少会发生污染。
但有一点，其实我觉得问题也不是很大，那就是：在老外的一本实验手册中提到，在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。
我想他的想法可能是脂质体对细胞膜有影响，可能此时加抗生素对细胞损伤较大。
因为庆大霉素、链霉素、G418均是氨基糖甙类药物，其药理作用完全一样。
所以没有必要再用，而且由于另外抗生素的添加实际增加氨基糖甙类药物的浓度，剂量有误差，不利于各实验室之间的交流，在实际操作中，培养液中有抗生素对细胞培养与筛选影响不大。
G418筛选
从G418筛选，转染到xx化的总结筛选之前确定G418浓度：1.由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2.G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3.汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4.G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3*106个细胞电转后，分别接种，，细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时细胞孔内大约50%汇合度。
理论上孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察孔内有两三个克隆，按比例孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
加药时间和维持浓度1.由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。
这时药物浓度可以降至200ug/ml。
2.加抗生素的时机，主要是考虑插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表达。
一般是转染48小时后加入抗生素。
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1.G418的配制：
方案一：300mgG418加入3ml PBS溶液，浓度为100mg/ml，完全溶解后，0.22um
过滤，-20℃保存。
方案二：（1）配制1M HEPES：23.8g HEPES（缓冲能力更强）粉末溶于100ml ddH2O，10N NaOH（加量较多）调节pH至7.3，过滤除菌（较难过滤），4℃保存，终浓度为1mol/L。
（2）5g G418溶于10ml 1M HEPES（pH7.3），终浓度为500mg/ml，-20℃保存。
注：实验中采用方案二时效果较好。
2.制备筛选培养基：用培养基将G418稀释为0 ug/ml 、200 ug/ml 、300 ug/ml 、400 ug/ml、500 ug/ml 、600 ug/ml 、700 ug/ml 、800 ug/ml、900ug/ml、1000ug/ml、1100ug/ml、1200ug/ml 24孔板，每孔1ml培养基（含有G418的完全培养基），每个浓度4个重复，则每次换液需各个浓度培养基4ml，现用现配。
200 ug/ml 300 ug/ml 400 ug/ml 500 ug/ml 600 ug/ml 700 ug/ml 800 ug/ml 900 ug/ml 1000 ug/ml 1100 ug/ml 1200 ug/ml
3ml完全培养基998.4 997.6 996.8 996 995.2 994.4 993.6 992.8 992 991.2 990.4
G418(500mg/ml) 1.6ul 2.4ul 3.2ul 4.0ul 4.8ul 5.6ul 6.4ul 7.2ul 8.0ul 8.8ul 9.6ul
3.细胞培养：将冻存的细胞复苏培养，，传代3至4次使细胞达到良好的生长状态,铺24孔板（20000/孔），12h换液，加筛选培养基培养。
4.确定G418最佳筛选浓度：将培养孔中培养基吸除，PBS洗涤一次，每孔加入不同浓度筛选培养基，隔天更换一次筛选培养基，培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准。
注：实验中所确定的最佳筛选浓度为1200ug/ml。
5.铺6孔板（20万/孔），第二天转染，6小时后换新鲜正常培养基。
转染24小时后加最佳筛选浓度培养基，隔天换液。
注意：细胞数量不能太多，否则将会影响筛选效果（G418很难发挥作用）。
6.在换液一两次后（换液后培养过夜），细胞达50%-80%时，吸出所有培养液，离心3000-4000rpm，吸上清0.22um过滤，加入2倍体积新鲜最佳筛选浓度培养液，混匀4℃备用。
7.培养6天左右细胞大量死亡时，可以换用适应性培养基，即6中所配制。
或者可以增加血清浓度培养，例如原来用10%血清，此时则可以采用20%血清。
8.培养10天后将G418浓度减半，维持筛选压力。
9.筛选约14天后可见有抗性克隆出现。
10.挑单克隆：高倍镜下标记阳性克隆，套环法或刮除法结合有限稀释法筛选阳性克隆，将其转入多孔板培养。
●套环法：用套环套住阳性克隆，在套环内加胰酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一个新的培养孔中培养。
●刮除法：刮除隐性克隆，消化阳性克隆后继续筛选培养。
11.单克隆鉴定：细胞大量扩增后，①提取总RNA，RT-PCR检测目的基因的表达②western 检测目的基因。
注意：转染时压系时细胞不能铺的太满，不然当细胞连接紧密后，压系时不具G418抗性的细胞死亡时极易将具有抗性的细胞一起从壁上脱落下来。