质粒转化细胞转染步骤
双荧光素酶报告实验质粒转染详细步骤及说明
双荧光素酶报告实验质粒转染详细步骤及说明
1. 待测细胞在10 cm dish 中培养至80-90% 融合时，倾去培养液，用2ml PBS 洗涤细胞两次；
2. 加1ml Trypsin-EDTA solution, 混匀后，小心吸去胰酶溶液，37ºC 放置1-5分钟；
3. 加入2 ml 完全培养基，吹打使细胞形成单细胞悬液；
4. 血球计数板计数，将细胞稀释至1×10 6 细胞/ml；
5. 取100 μl 上述细胞稀释液加入96 孔板，使细胞密度达到1×10 5 个细胞/孔，混匀后于37ºC 5% CO 2 培养24 小时；
6. 在3 个1.5 ml EP 管中各加入50 μl 无血清培养基，分别加入0.2 μg，0.4 μg，0.8 μgpEX-1 质粒，混匀；取另一1.5 ml EP 管，加入150 μl 无血清DMEM，加入1.5 μl 转染试剂，充分混匀，室温放置5 分钟后将150 μl 平均3 等份对应加入含有质粒的3个EP 管，充分混合，室温放置20 分钟；
7. 吸去96 孔板中的培养液，将转染混合物逐滴加入96 孔板中，混匀后，在培养箱中
温育5 小时；
8. 吸弃转染液，加入100 μl 完全培养液。
37ºC 5% CO 2 继续培养, 24h 和48h 观察并拍照质粒转染效果图片。
细胞转染的原理操作步骤以及小技巧
细胞转染的原理操作步骤以及小技巧细胞转染是一种将外源DNA、RNA、蛋白质等分子导入到细胞内的实验技术。
这种技术可以用来研究基因功能、发现新的信号通路和治疗基因疾病等。
下面将介绍细胞转染的原理、操作步骤以及一些小技巧。
一、细胞转染的原理：细胞转染主要通过三种方法实现：物理法、化学法和生物学法。
1.物理法：通过高压、电穿孔、微射流等方式，使细胞膜发生瞬时破裂，从而使DNA、RNA等外源分子进入细胞。
常用的物理法有电穿孔法和基因枪法。
2.化学法：通过化学物质，如聚吡咯、脂质体等，使外源分子与细胞膜结合，从而实现转染。
常用的化学法有聚乙烯亚胺（PEI）法、磷酸钙共沉淀法等。
3.生物学法：通过利用病毒载体将外源基因导入目标细胞，实现基因的转移。
常用的生物学法有腺相关病毒（AAV）转染、逆转录病毒（RETRO）转染等。
二、细胞转染的操作步骤：1.细胞的预处理：根据细胞类型和实验要求，将细胞培养至合适的状态。
通常细胞应处于快速生长期，但还未达到接触抑制的阶段。
对于一些特定的细胞，如悬浮细胞，可能需要将其转接至适当的培养基中。
2.外源分子的准备：将外源DNA、RNA等转染载体制备好。
如将DNA克隆并纯化至高质量的质粒DNA，或将RNA合成或纯化。
根据实验要求选择合适的转染载体。
3.转染方法的选择：根据实验要求选择合适的转染方法，如物理法、化学法或生物学法。
一般情况下，物理法适用于悬浮细胞，化学法适用于贴壁细胞，而生物学法适用于大多数细胞类型。
4.细胞转染操作：a.物理法：i.电穿孔法：将细胞悬浮于含有外源分子的缓冲液中，然后通过电穿孔仪的电极或电穿孔板进行电穿孔。
ii. 基因枪法：使用基因枪将外源分子直接“枪”入目标细胞中。
b.化学法：i.PEI法：将PEI与外源DNA或RNA按一定比例混合，在适当条件下形成复合物，然后添加至目标细胞中。
ii. 磷酸钙共沉淀法：将外源DNA与磷酸钙按比例混合，并静置形成磷酸钙- DNA沉淀，然后加入至目标细胞中。
转染详细步骤大攻略
转染详细步骤大攻略范例----真核重组表达质粒pDsRed-N1-NS1在A549细胞中表达按上海索莱宝生物科技有限公司去内毒素质粒小提试剂盒说明书方法进行质粒抽提，测得质粒浓度为410.32ng/µl。
将培养的A549细胞铺板，待细胞密度长到90%左右时，按lipo2000说明书转染A549细胞，36h后于荧光显微镜下观察DsRed-NS1融合蛋白的表达情况。
具体操作步骤如下：1）质粒准备按上海索莱宝生物科技有限公司去内毒素质粒小提试剂盒说明书方法进行质粒抽提，具体步骤如下：(1) 取1-5ml细菌培养物，12000rpm离心1 min,尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。
(2) 向留有菌体沉淀的离心管中加入200µl溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA）,使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
（注：如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低）(3)向离心管中加入200µl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
（注：混匀一定要温和，以免污染基因组DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏）(4)向离心管中加入250µl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。
12000rpm 离心10min，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。
（注：溶液P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。
如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清）(5)加入1/5体积冰预冷的去内毒素清除剂，振荡混匀，溶液变浑浊，冰浴2min 至溶液变清亮。
(6)37℃水浴5 min，不时振荡，溶液又变浑浊。
12000rpm室温离心5min，溶液应分为两相，上层水相含质粒DNA，下层油状相含内毒素。
(7)将质粒DNA上层水相转移至新管，弃下层油状相，注意不要吸入油状相，重复抽提三次，即重复步骤5-7三次。
pei质粒转染的原理
pei质粒转染的原理
PEI（聚乙烯亚胺）质粒转染的原理主要包括以下几个步骤：
1. PEI与质粒DNA的结合：PEI是一种阳离子聚合物，通过
静电相互作用，可以与质粒DNA形成PEI/DNA复合物。
PEI
的阳离子部分与DNA的阴离子部分结合，形成稳定的复合物。
2. 复合物与细胞的结合：PEI/DNA复合物通过静电相互作用
与细胞表面的负电荷结合。
复合物的阳离子部分与细胞表面的阴离子部分相互吸引，从而使质粒DNA能够与细胞紧密结合。
3. 质粒DNA进入细胞：由于PEI/DNA复合物与细胞膜结合，并且细胞膜是由磷脂双层组成，磷脂双层中的磷脂分子有一部分是带负电荷的。
PEI/DNA复合物与细胞膜结合后，可以引
发细胞膜的变性和破裂，从而使质粒DNA能够进入细胞质。
4. 质粒DNA的释放：一旦质粒DNA进入细胞质，PEI的作用就会逐渐减弱，质粒DNA会被释放出来。
质粒DNA可以进
入细胞核，与细胞的核酸进行相互作用，从而实现外源基因的表达和功能。
需要注意的是，PEI质粒转染虽然简单易行，但由于PEI会引
发细胞毒性反应，因此在实验过程中需要控制PEI的浓度和转染时间，以最小化对细胞的伤害。
此外，PEI转染的转染效率
一般较低，因此在许多情况下，需要通过如改变PEI与DNA
的比例、优化细胞培养条件等方法来提高转染效率。
质粒转化、细胞转染步骤
质粒转化、细胞转染步骤
转化是指将外源DNA（常以质粒作为载体）导入受体细
胞（如大肠杆菌），从而使其获得新的遗传特性。
具体步骤如下：首先将12ul的质粒DNA加入50ul感受态cell中，轻柔混合后进行冰浴30min。
接着向管中加入培养基，混匀后使细菌
恢复正常生长状态。
然后在42℃下热激90s，迅速冰浴2min，最后在37℃下震荡培养（﹤225rpm）1h，使细菌获得新的遗
传特性。
转染（n）是将含有目的基因的载体转移到真核细胞内的
过程。
在进行质粒转染时，需要先将6-well-plate中的每个孔
培养至60-70%的状态。
然后在接种时每个孔加入2.5×105个
/ml的细胞。
接下来，将2.5ug质粒DNA和200ul的opti-
MEM混合，再加入6ul的转染液进行混匀，并在室温下静置
15min。
待转染细胞换成1.3ml的opti-MEM培养基后，将转
染复合物（200ul）轻轻均匀滴入细胞培养基中，并十字形摇
晃6-well-plate以混匀转染复合物。
最后将6-well-plate放入37℃、CO2培养箱中进行培养。
质粒转染技术
质粒转染技术质粒转染技术是现代生命科学研究中常用的实验手段之一，广泛应用于基因工程、细胞生物学、分子生物学等领域。
本文将从质粒转染技术的原理、方法和应用等方面进行介绍。
一、质粒转染技术的原理质粒转染技术是指将外源质粒DNA导入到细胞内的一种方法。
质粒是一种环状DNA分子，具有自主复制和表达基因的能力。
质粒转染技术通过将质粒DNA导入到细胞内，使其在细胞内复制和表达，从而实现对目标基因的研究和应用。
1. 化学法转染：化学法转染是最常用的质粒转染方法之一。
其基本原理是利用化学物质（如聚合物、脂质体等）与质粒DNA结合，形成复合物后与细胞膜发生相互作用，使质粒DNA进入细胞内。
这种方法操作简单、成本低廉，适用于大多数细胞类型。
2. 电穿孔法转染：电穿孔法利用高压电脉冲的作用，瞬时破坏细胞膜，使质粒DNA能够进入细胞内。
这种方法适用于多种细胞类型，转染效率较高，但操作较为复杂。
3. 粒子轰击法转染：粒子轰击法利用高速粒子（如金属微粒）的撞击作用，将质粒DNA导入细胞内。
这种方法适用于质粒DNA较大、难以通过其他转染方法的细胞。
三、质粒转染技术的应用1. 基因表达研究：质粒转染技术可用于将外源基因导入细胞，使其在细胞内表达，从而研究基因的结构、功能和调控机制。
2. 基因敲除研究：质粒转染技术结合CRISPR/Cas9等基因编辑技术，可以实现对特定基因的敲除，从而研究该基因的功能。
3. 基因治疗：质粒转染技术可用于将治疗基因导入患者的细胞，修复或替代异常基因，实现基因治疗的目的。
4. 细胞药物递送：质粒转染技术可用于将药物敏感基因导入细胞，使其在细胞内表达，从而增强对药物的敏感性，提高治疗效果。
四、质粒转染技术的进展与挑战随着生命科学研究的不断发展，质粒转染技术也在不断改进和完善。
目前，研究人员正在努力提高转染效率、降低细胞毒性和改善转染的特异性等方面。
同时，也面临着一些挑战，如如何选择合适的转染方法、如何提高质粒的稳定性等问题。
一般转染操作步骤
一般转染操作步骤
1、稀释转染试剂
将6ul转染试剂FuGENE加到装有90-98ul预热到室温培养基的无菌聚丙乙烯管中，立即混匀，室温放置5min。
注：勿将未稀释的转染试剂FuGENE碰到管壁，造成稀释不充分。
2、制备转染物
加2ug的质粒DNA至稀释的转染试剂中，立即混匀，室温放置15min。
注：勿超过45min，否则影响转染效率。
3、添加转染物至细胞培养液
将2-10ul的转染物加到含有100ul细胞培养液的96孔板中，轻轻吸打或者左右摇晃10-30S以充分混匀。
推荐：5ul作为起始点
4、孵育培养
置于CO2培养箱中，培养24-48h检测。
转染试剂FuGENE：DNA=3:1
质粒DNA浓度：0.2-1 ug/ul
96孔板每孔2-10ul转染物成分：0.15-0.6ul的转染试剂+0.04-0.2ug的质粒DNA。
质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序
质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序一、感受态细菌制备（CaCl2法）1. 从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌单菌落，接种于5ml不加Amp的LB培养基中，37℃振荡培养过夜（200r/min，至OD=1.5左右）。
2. 取0.5ml上述振荡过夜的菌液，转入含50ml的LB的三角烧瓶（1%）中，37℃条件下振荡培养2~2.5小时左右（200r/min），使OD600达到0.2~0.4左右（100μl 测600nm时OD值）。
3. 将培养液50ml分装到4个10ml的离心管中，每管10ml，冰上放置10min，4. 4℃条件下，4000r/min离心10分钟，弃上清。
将离心管倒扣在吸水纸上，尽量倒尽管中的培养基。
5. 每管加入预冷的0.1mol/l CaCl2溶液2ml，用枪轻轻吹打，重悬沉淀。
转移到一个离心管中，共8ml。
6. 冰上放置10min后，4℃条件下，4000r/min离心10min。
7. 沉淀用预冷的1.6ml 含有15%甘油的0.1mol/l的CaCl2溶液悬浮。
分装成200μl 的小份，共8管（40ml变为1.6ml浓缩25倍），-70℃保存备用。
二、溶液的配置1. LB培养基：1%蛋白胨（typtone）、0.5%酵母提取物（yeast extract）、1%NaCl，即10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠溶解在950ml水中，用1mol/LNaOH 调PH至7.0，在补足水至1L。
高压灭菌20分钟备用。
2. 0.1mol/l的CaCl2溶液：1.1g/100ml，称取1.1g CaCl2，加入双蒸水定容至100ml，滤膜过滤或高压灭菌，分装成10ml/小份，4℃保存。
另取8.5ml+1.5ml已灭菌甘油，甘油含量为15%甘油，分装成1ml/小份（10份）4℃保存。
3. 配置液体培养基时，高压灭菌20min备用；4. 配置固体培养基时+（1.5g/100ml）琼脂糖，然后高压灭菌20min。
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转化：将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内使之获得新的遗传特性。
转染（transfection）:将含有目的gene的载体转到真核cell内
转导：指以噬菌体为载体，在细菌之间转移DNA的过程。
有时也指在真核cell之间通过逆转录病毒转移和获得cellDNA的过程。
1.质粒转染（transfection）
6-well-plate每well60-70%时transfection
接种时2.5×105个/ml/well
质粒DNA转染液优化培养基opti-MEM
步骤：2.5ug质粒DNA+200ulopti-MEM+6ul转染液混匀室温静置15min 待转染cell换优化培养基opti-MEM1.3ml，切记要轻轻加培养基，勿冲起cell
把transfectioncomplex(200ul)轻轻均匀滴入cell培养基中，十字形摇晃plate,混匀
37℃，CO2培养箱培养
2.
转化：外源DNA(质粒作为载体)导入受体细胞（大肠杆菌感受态cell）步骤：
50ul感受态cell（一管）加入12ul质粒DNA→轻柔混合
↓
冰浴30min
↓
42℃热激90s
↓
迅速冰浴2min
↓
向管中加入培养基，混匀后37℃震荡培养（﹤225rpm）1h,使细菌恢复正常生长状态
↓
涂板正培1h后，倒培过夜。