稳定转染步骤
细胞转染的原理操作步骤以及小技巧
细胞转染的原理操作步骤以及小技巧细胞转染是一种将外源DNA、RNA、蛋白质等分子导入到细胞内的实验技术。
这种技术可以用来研究基因功能、发现新的信号通路和治疗基因疾病等。
下面将介绍细胞转染的原理、操作步骤以及一些小技巧。
一、细胞转染的原理：细胞转染主要通过三种方法实现：物理法、化学法和生物学法。
1.物理法：通过高压、电穿孔、微射流等方式，使细胞膜发生瞬时破裂，从而使DNA、RNA等外源分子进入细胞。
常用的物理法有电穿孔法和基因枪法。
2.化学法：通过化学物质，如聚吡咯、脂质体等，使外源分子与细胞膜结合，从而实现转染。
常用的化学法有聚乙烯亚胺（PEI）法、磷酸钙共沉淀法等。
3.生物学法：通过利用病毒载体将外源基因导入目标细胞，实现基因的转移。
常用的生物学法有腺相关病毒（AAV）转染、逆转录病毒（RETRO）转染等。
二、细胞转染的操作步骤：1.细胞的预处理：根据细胞类型和实验要求，将细胞培养至合适的状态。
通常细胞应处于快速生长期，但还未达到接触抑制的阶段。
对于一些特定的细胞，如悬浮细胞，可能需要将其转接至适当的培养基中。
2.外源分子的准备：将外源DNA、RNA等转染载体制备好。
如将DNA克隆并纯化至高质量的质粒DNA，或将RNA合成或纯化。
根据实验要求选择合适的转染载体。
3.转染方法的选择：根据实验要求选择合适的转染方法，如物理法、化学法或生物学法。
一般情况下，物理法适用于悬浮细胞，化学法适用于贴壁细胞，而生物学法适用于大多数细胞类型。
4.细胞转染操作：a.物理法：i.电穿孔法：将细胞悬浮于含有外源分子的缓冲液中，然后通过电穿孔仪的电极或电穿孔板进行电穿孔。
ii. 基因枪法：使用基因枪将外源分子直接“枪”入目标细胞中。
b.化学法：i.PEI法：将PEI与外源DNA或RNA按一定比例混合，在适当条件下形成复合物，然后添加至目标细胞中。
ii. 磷酸钙共沉淀法：将外源DNA与磷酸钙按比例混合，并静置形成磷酸钙- DNA沉淀，然后加入至目标细胞中。
细胞转染步骤
细胞转染步骤细胞转染是一种将外来脱氧核糖核酸（DNA）或核苷酸序列引入细胞内的技术。
这个过程可以用于研究基因功能、病毒感染和基因治疗。
在细胞转染过程中，有几个重要步骤需要注意。
下面是一个关于细胞转染步骤的简要介绍。
第1步：提取DNA或RNA在细胞转染前，需要先准备好DNA或RNA。
其中，DNA可通过PCR扩增、酵母合成，或从细胞中提取。
RNA则可通过反转录酶聚合酶链式反应（RT-PCR）反转录，然后进行DNA扩增。
第2步：选择转染方法目前有很多种不同的细胞转染方法，包括电穿孔、热休克、化学转染等。
要选择适合的转染方法，需要考虑许多因素，如细胞类型、转染效率和毒性等。
常用的转染剂有聚乙烯醇、脂质体、钙磷酸盐等。
第3步：制备转染复合物转染复合物是转染时添加的液体溶液，用于将DNA或RNA引入细胞。
制备复合物通常需要将DNA或RNA与转染剂混合，然后使其与乙醇或其他化学物质形成稳定的颗粒，最终形成复合物。
转染时需要将制备好的转染复合物直接加入培养基中，让细胞与其接触。
接触后，DNA或RNA会被吸附到细胞表面并被内吞到细胞内部。
转染过程通常需要一定程度的时间，具体时间取决于细胞类型和转染复合物的选用。
第5步：培养和维护转染成功后需要对细胞进行培养和维护。
这通常需要注意以下几个因素：1）细胞浸润度：细胞密度应该适合，以便观察细胞形态和产物的表达量。
2）培养基成分：为了保持细胞生长，需要选择适当的培养基成分。
3）药物筛选：转染后可能需要添加药物对细胞进行筛选，以便筛选出目标基因。
4）稳定性维护：为了保证目标基因稳定的表达，需要适当地维护和稳定细胞系。
以上是细胞转染过程中的几个关键步骤。
在进行细胞转染时，需要注意步骤的顺序和方法的选择，以便提高转染效率和成功率。
稳转流程
做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单克隆化鉴定。
有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方，大家补充。
筛选之前确定G418浓度：1，由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2，G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3，汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到 1000个细胞/ml，在100ug/ml～1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10～14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3×106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1 /300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3～5天都要更换一次含有G418的筛选液。
EndoFectin-CHO 转染试剂 说明书
EndoFectin™-CHO 转染试剂■ 产品概述：EndoFectin™ CHO 转染试剂是一种具有专利的阳离子聚合物试剂，它能与核酸形成复合物，并使该复合物进入哺乳动物细胞。
EndoFectin™ CHO 转染试剂专为转染CHO 细胞，并构建稳定的细胞系而设计。
即使在有血清存在的情况下，它仍然能高效的将核酸导入细胞。
GeneCopoeia 公司提供的 EndoFectin™ CHO 转染试剂有如下优点：• 优越的转染效率• 重组蛋白的高表达水平• 与含血清的培养基相兼容• 低细胞毒性• 易于操作■ 成分及储存条件：• 每管含有经过滤除菌的EndoFectin™ CHO 转染试剂• EndoFectin™ CHO 转染试剂 可于常温下运输。
4-8℃密闭保存。
该试剂在4-8℃的条件下，可保持稳定至少12个月。
■ 质量控制：每批EndoFectin™ CHO 均经过转染测试。
我们将eGFP 表达质粒(GeneCopoeia Catalog No. EX-EGFP-Lv01)用EndoFectin™ CHO 转染试剂转入subconfluent HEK-293 细胞。
转染16小时后，超过95%的细胞表达eGFP 。
■ 实验开始前的注意事项：质粒的质量：请务必使用高质量转染级无内毒素的质粒。
通过260nm 光吸收测定DNA 浓度，260nm/280nm 比值确定DNA 纯度（比值应该在1.8~2.0的范围之内）。
如有可能，请通过琼脂糖凝胶电泳检测质粒的完整性。
细胞的条件：使用适当保存和经常传代的健康细胞。
确保培养基没有被细菌，真菌或支原体污染。
如果细胞是近期复苏的液氮冻存细胞，请在转染前至少传代两次。
■ 瞬时转染方法：1. 接种细胞1转染前一天，用胰酶消化细胞并计数。
调整细胞浓度，将细胞铺入细胞培养的器皿，总体积如表1所示。
每个孔置入的细胞量应能使转染时细胞汇合度达到70~80%。
2. 准备DNA/EndoFectin™复合物GeneCopoeia Inc.19520 Amaranth DriveGermantown, Maryland 20874USATel: 301-515-6982; 1-866-360-9531Fax: 301-515-6983Web: GeneCopoeiaTMExpressway to Discovery用于转染核酸到哺乳动物细胞产品套装编号： Z0103储存条件：4℃－8℃保存 产品编号Z01030A Z01030BZ01030C （A*5）包装规格1mL 0.5mL 5 mL地址:广州高新技术产业开发区广州科学城掬泉路3号广州国际企业孵化器D 区8楼，510663客服电话*************电子信箱:********************网址:该产品仅限于实验科学研究用，若有任何单位或个人将该产品用于临床诊断、治疗等其他国家专门规定的特殊用途，本公司概不承担任何责任。
LIPOFECTAMINE2000转染试剂转染步骤
LIPOFECTAMINE2000转染试剂转染步骤转染是一种将外源DNA或RNA导入到细胞内的技术，以研究基因功能、蛋白质表达、细胞信号转导等方面的问题。
LIPOFECTAMINE2000是一种常用的转染试剂，广泛应用于多种细胞系中。
以下是LIPOFECTAMINE2000转染试剂转染步骤的详细介绍。
一、细胞种植与处理准备1.1细胞传代：将细胞进行传代，以保证其在良好的状态下进行实验。
1.2细胞密度调整：将细胞于适宜培养皿中培养至60-80%的密度，以保证细胞的适宜转染。
1.3细胞处理准备：在转染前，将细胞用无酶EDTA或胰酶剥离并重新悬浮在适宜的培养基中，以保持细胞的完整性和适宜的状态。
二、试剂配制2.1DNA或RNA的制备：将外源DNA或RNA在无菌条件下制备，并使用纯化试剂进行纯化和浓缩。
2.2转染试剂配制：将冻干的LIPOFECTAMINE2000转染试剂通过加入合适的无菌水，稀释成适宜浓度的转染试剂。
三、转染操作3.1转染试剂与DNA/RNA的混合：将适量的LIPOFECTAMINE2000转染试剂与DNA或RNA混合在无菌的管中，轻轻混合均匀。
注意，避免过量试剂和核酸的使用，以减少细胞的毒性和副作用。
3.2孵育混合物：将混合物在常温条件下孵育15-30分钟，以促使脂质体与核酸形成稳定的复合体。
四、转染过程4.1转染试剂与细胞的混合：将混合物缓慢滴加到处理好的细胞培养基上，缓慢摇晃培养皿以使混合物均匀分布。
4.2转染时间及培养条件：将细胞放置在转染液中，保持静止状态，同时将培养皿放回培养箱中，在37℃、5%CO2的恒温恒湿条件下进行转染。
转染时间需要根据细胞系和转染试剂的要求进行优化，一般为4-6小时。
4.3转染液的去除：将转染液小心去除，并将细胞用含有适宜抗生素或筛选剂的培养基洗涤一次，以去除残留的转染试剂。
五、细胞处理及分析5.1细胞培养：将细胞放回恒温恒湿培养箱中，用适宜培养基进行细胞的培养。
转染步骤范文
转染步骤范文转染是指将外源DNA导入到受体细胞中的过程，用于基因工程、基因治疗等研究和应用。
转染步骤是实现转染的关键步骤，包括细胞培养、转染试剂制备、转染试剂处理、细胞培养和分析。
以下是转染步骤的详细描述。
第一步：细胞培养在进行转染实验之前，首先需要培养并扩增所使用的细胞。
细胞的培养基因常见的有DMEM、RPMI等，培养基中会添加适当的酵素抑制剂（如胰酶）和生长因子，以促进细胞的生长和增殖。
第二步：转染试剂制备转染试剂可以是化学试剂，也可以是病毒载体或质粒DNA。
化学试剂常见的有聚乙烯亚胺（PEI）、脂质体、阳离子聚合物等。
病毒载体包括腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒、大肠杆菌之Coli phage等。
质粒DNA则是将外源DNA经过酶切和纯化处理得到的。
第三步：转染试剂处理在这一步中，将转染试剂与细胞一起孵育，以使转染试剂与细胞内部的DNA互相结合。
转染试剂的使用方法根据具体试剂的特点而定，常见的方法有磷酸钙共沉淀、脂质体包裹、病毒载体包装等。
第四步：细胞培养和分析在细胞孵育一定时间后，可以对转染效率进行分析。
常见的分析方法包括荧光显微镜观察、流式细胞术、PCR等。
通过这些分析方法，可以观察到转染后的外源DNA是否成功导入到细胞，并根据实验需要进行下一步操作。
除了以上步骤，还有一些实验时需要注意的要点，例如选择合适的细胞密度和培养时间、优化转染条件、进行有效杀菌等。
同时，也需要仔细阅读相关实验操作手册，并参考先前类似研究的文献，以确保实验的准确性和可重复性。
总结起来，转染步骤是进行基因转染的重要环节，包括细胞培养、转染试剂制备、转染试剂处理、细胞培养和分析。
通过精确执行每个步骤，并结合适当的方法和实验操作要点，可以高效地将外源DNA导入到受体细胞中，实现基因工程和基因治疗等研究和应用的目的。
[说明]转染详细步骤大攻略
![[说明]转染详细步骤大攻略](https://img.taocdn.com/s3/m/8d4c02e6bb68a98270fefa98.png)
[说明]转染详细步骤大攻略转染详细步骤大攻略范例----真核重组表达质粒pDsRed-N1-NS1在A549细胞中表达按上海索莱宝生物科技有限公司去内毒素质粒小提试剂盒说明书方法进行质粒抽提，测得质粒浓度为410.32ng/µl。
将培养的A549细胞铺板，待细胞密度长到90%左右时，按lipo2000说明书转染A549细胞，36h后于荧光显微镜下观察DsRed-NS1融合蛋白的表达情况。
具体操作步骤如下: 1)质粒准备按上海索莱宝生物科技有限公司去内毒素质粒小提试剂盒说明书方法进行质粒抽提，具体步骤如下:(1) 取1-5ml细菌培养物，12000rpm离心1 min,尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。
(2) 向留有菌体沉淀的离心管中加入200µl溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA),使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
(注:如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低)(3)向离心管中加入200µl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
(注:混匀一定要温和，以免污染基因组DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏)(4)向离心管中加入250µl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。
12000rpm 离心10min，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。
(注:溶液P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。
如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清)(5)加入1/5体积冰预冷的去内毒素清除剂，振荡混匀，溶液变浑浊，冰浴2min至溶液变清亮。
(6)37?水浴5 min，不时振荡，溶液又变浑浊。
12000rpm室温离心5min，溶液应分为两相，上层水相含质粒DNA，下层油状相含内毒素。
(7)将质粒DNA上层水相转移至新管，弃下层油状相，注意不要吸入油状相，重复抽提三次，即重复步骤5-7三次。
干细胞稳定转染的步骤
干细胞稳定转染的步骤1.选择合适的载体：选择适合干细胞转染的载体，常用的有携带选择标记基因的质粒载体或病毒载体，可以根据实验需要选择不同的载体。
2.DNA的准备工作：将所需的外源基因片段克隆到载体中，并根据需要设计适当的启动子和终止子。
确保DNA质粒提取纯度高，并使用合适的工具加以验证。
3. 细胞准备：选择合适的干细胞，常用的有胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)、诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)等。
干细胞需要在培养基中进行适当的扩增和传代。
4.干细胞培养：将干细胞在无细胞培养基中培养，以保持其干性。
培养基中添加相应的生长因子和细胞因子来促进细胞生长和增殖。
5.转染干细胞：将准备好的质粒载体与干细胞一起转染进入干细胞中，常用的转染方法有化学法、电穿孔法和病毒介导转染法。
根据研究需要选择合适的转染方法。
6.选择转染细胞：转染后，使用选择性抗生素或选择性标记物来选择转染成功的细胞，例如使用抗生素筛选，只有带有外源基因的干细胞才能在含有抗性抗生素的培养基中存活。
7.干细胞稳定化：将选中的转染细胞继续在无细胞培养基中培养，并经历几个传代。
在这个过程中，通过监测外源基因的表达情况来确定是否稳定表达。
8. 验证外源基因的稳定表达：使用适当的表达分析方法（如PCR、Western blot和荧光显微镜等），检测外源基因的稳定表达情况。
确保外源基因能够在转染的干细胞中稳定地表达。
9.功能验证：在转染干细胞中验证外源基因的功能。
根据实验需要，可以通过细胞增殖实验、细胞分化实验等来验证外源基因的功能。
10.数据分析和报告编写：整理和分析实验结果，并按照科学报告的形式撰写报告，描述实验过程和结果，包括外源基因的稳定表达情况和功能验证结果。
以上是干细胞稳定转染的一般步骤。
需要根据实际情况和实验要求调整和优化步骤，确保转染成功率和所需的目标基因的稳定表达。
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稳定转染细胞株的制备
带质粒的大肠杆菌的激活和扩增
（1）取-80℃冻存的带有质粒的大肠杆菌在室温解冻，或者放置37℃恒温水中约2min,待冰完全融解即可使用。
（2）LB培养基的制备按照如下配方配制
胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L
酵母提取物(Yeast extract) 5g/L
氯化钠(NaCl) 10g/L
用NaOH调节该培养基的pH,使其达到7.4，高温高压灭菌后室温保存，使用时加入氨苄青霉素(浓度为0.1mg/ml)
（3）LB固体培养基的制备到200mlLB液体培养基加入3g琼脂混匀后高温高压灭菌，待冷却至约55℃时在无菌条件下加入氨苄青霉素摇匀，分别倒入6-7个培养皿中，用封口膜封边，并倒置放于4℃保存。
（4）扩增用接种环按照四线法将解冻后的工程菌涂布接种到LB固体培养基上，待凉干后，用封口膜将培养皿封闭，然后倒置于37℃恒温箱中培养过夜(不能摇晃)，根据情况可适当延长培养时间。
观察培养基上的单克隆工程菌，待长出后，用接种环将一个单克隆工程菌转移接种到10mlLB液体培养基中，放入掁荡培养箱中37℃摇荡培养过夜，第二天观察，待LB液体培养基变浑浊后，4℃冰箱保存，以待进行下一步质粒的提取。
质粒的提取
准备质粒提取盒和扩增的带质粒大肠杆菌培养液
（1）取75ml扩增变浑浊的LB液体培养基置于试管中。
（2）5,000×g离心10分钟，弃去上清液，将试管倒置在滤纸上空干。
（3）取出质粒提取盒，用3ml细胞重悬浮液对试管中的细胞进行重悬浮。
（4）加入3ml细胞裂解液，轻轻摇晃试管混匀，室温下孵育3分钟，产生白色絮状沉淀，然后加入5ml中和液混匀
（5）将Clearing Column(兰色)放入一新的50ml离心管，将上述试管中裂解后的液体倒入兰管，孵育2分钟，1500×g离心5分钟，效果不佳的话可再离心一次，离心液待用。
（6）将Binding Column(白色)放入一新的50ml离心管，取上述离心液倒入白管，1500×g离心3分钟，弃去离心液。
（7）在白管中加入5ml内毒素清洗液(需加异丙醇)，1500×g离心3分钟，弃去离心液，在白管中再加20ml柱洗液(含有乙醇)，1500×g离心5分钟，弃去离心液后，继续1500×g离心10分钟，以保证彻底除去乙醇。
（8）取出白管，在滤纸上轻敲白管顶端的尖嘴，以保证去除试管中的乙醇，并用滤纸擦去白管外壁上的乙醇。
（9）把白管放入一个新的50ml离心管中，加入600µl无核酸酶的水(要把水加到白管中的DNA结合膜上),然后1500-2000×g离心5分钟
（10）收集离心管中的滤液，并转到1.5mlEP管中，密封，-20℃保存。
提取质粒的DNA电泳鉴定
（1）制胶取0.15g琼脂糖，15ml 1×TAE混匀，微波炉加热20分钟，使之熔化，待自然冷却60-70℃时，加入0.25µl EB,轻轻混匀。
（2）将冷却至约60℃的凝胶倒入准备好的胶床内，厚度约5mm,室温静置1h,待胶固化后，置于电泳槽中，样品端位于负极。
（3）倒入1×TAE缓冲液，覆盖住胶面，拔起梳子
（4）在样品中按1：6体积比加入上样缓冲液，混匀。
（5）在加样孔中分别加入Marker和样品。
（6）盖上电泳槽，通上电，电压80v,时间约20-25min,开始电泳。
（7）电泳结束，取出凝胶，照相后观察。
提取质粒后浓度的测定
（1）取EP管，标上记号。
（2）其中一个加双重蒸馏水80µl，其余加样品80µl(样品按:提取质粒2µl ，双重蒸馏水78µl 混匀而成).
（3）用核酸计算器测定，并记录结果。
（4）经测定，PCI-neo-PDCD重组质粒的浓度为764ng/µl, PCI-neo-空质粒的浓度为524 ng/µl.
稳定转染细胞株的筛选
（1）G418配制取1g G418,加入10mlPBS溶液，浓度为100mg/ml,完全溶解
后，过滤分装到1mlEP管中，密封，-20℃保存。
（2）浓度梯度试验确定G418的最佳筛选浓度用培养基把G418稀释成100µg/ml、200µg/ml、300µg/ml、400µg/ml、500µg/ml、600µg/ml、700µg/ml、800µg/ml、900µg/ml、1000µg/ml不同筛选浓度。
选对数期DU145细胞消化后稀释成1000-2000cell/ml细胞悬液，铺24孔板，每孔1ml ，过夜使之贴壁，然后换液，换成含不同浓度G418的培养基，培养10-14天，每3天换一次液，在筛选10～14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度，筛选时比该浓度再高一个级别，维持培养时使用筛选浓度的一半。
（3）细胞转染取对数期前列腺癌DU145细胞，消化后用无双抗10﹪血清培养液制成细胞悬液(2000cell/ml)，接种到35mm培养皿中过夜，培养到70%汇合率，进行转染。
取出培养皿，吸去培养皿中的培养液，并每皿加入RPMI 1640培养液约0.5ml重复冲洗细胞两遍，而后每皿加入RPMI 1640培养液1.5ml,转染复合物混合液0.5ml. 轻轻混匀，放入37℃，5％CO2孵育箱中培养6 h左右，进行换液，换成含10%血清的普通培养基，在37℃，5％CO2孵育箱中继续培养24h左右.
转染复合物的制取：
250µl 无血清培养基OPTI-MEM + 5µl Lipofectamine 2000（混合5min）
250µl 无血清培养基OPTI-MEM +1.9µl空质粒（混合5min）
上述二者混合后，室温静置20min，即为空质粒的转染复合物。
250µl 无血清培养基OPTI-MEM + 5µl Lipofectamine 2000（混合5min）
250µl 无血清培养基OPTI-MEM +1.31µlPDCD5重组质粒（混合5min）上述二者混合后，室温静置20min，即为PDCD5重组质粒的转染复合物。
注: 转染复合物一旦形成，应立即加入培养皿中进行细胞转染。
（4）稳定转染细胞株的筛选
从37℃，5％CO2孵育箱中取出培养皿，弃去含转染试剂的培养基，用PBS 冲洗细胞2遍，胰蛋白酶消化，接种1/2的细胞到100 mm培养皿中，加入含500 µg/ml G418的新鲜培养基，每2-3天更换一次新的筛选培养基，每天观察细胞的死亡情况。
当正常细胞完全死亡后，换用新的不含G418的培养基培养。
每天观察细胞生长状态。
在细胞达到60%汇合率时再用含500 µg/ml G418的培养基筛
选一次。
当细胞达到90%以上汇合率时将细胞转移至培养瓶中继续培养（转染后10-12天左右）。
以后每隔4-5天再用含500 µg/ml G418的培养基筛选。
直到稳定表达转染质粒的细胞达到一定数量后可以收集样品（约转染后15天左右）。
以后继续培养时加入的G418浓度降一半。