骨髓基质干细胞及聚羟基烷酸酯重建组织工程化半月板体外实验研究

骨髓基质干细胞和聚羟基烷酸酯重建组织工程化半月板体外实验研究博士研究生王其友导师蔡道章教授中山大学附属第三医院骨科摘要一研究背景及目的半月板是膝关节内的纤维软骨组织，可以吸收振荡、传导膝关节的负荷、增加膝关节的稳定性并起到润滑关节的作用。

半月板损伤是临床中骨科常见病，既往半月板损伤后均以半月板部分切除或全部切除的方法进行治疗，Ｓｍｉｌｌｉｅ甚至建议，无论半月板撕裂程度如何，为了获得完整的半月板再生，均应行彻底的半月板切除术。

然而，大量的基础及临床研究表明，半月板切除后再生的半月板是以纤维组织为主的结构，与正常的半月板差别很大，其生物力学性能远不如正常的半月板组织，且再生与正常半月板移行处极易发生再破裂。

不仅如此，多个研究结果表明：半月板切除后常不可避免引起关节退变，骨关节炎的病变程度与半月板切除的量成正比。

由此可见，半月板的功能十分重要，尽可能的保留健康正常半月板及重建半月板是半月板损伤治疗的现代观点。

而半月板自我愈合的能力仅限于半月板的血管区。

对于血管区外的损伤及退变，促使半月板自我愈合的方法还需迸一步研究，现有的重建半月板方法主要有半月板移植和半月板假体两种。

半月板假体是指选用生物力学性能与半月板相近，有良好的组织相容性的有机材料组成，植入关节内以替代半月板功能。

然而，不同的个体对植入的半月板假体滑膜反应的敏感性不同，总有一定比例的个体出现严重的滑膜反应。

此外，假体是否会诱发恶变，或者对关节内软骨等重要结构是否会产生破坏仍无明确结论。

因此，半月板假体目前主要在实验研究阶段，半月板移植临床近期效果不错，与其他器官移植类似存在供体来源有限、组织保存困难、存在免疫排斥反应、有潜在的传播疾病危险以及远期疗效不确定。

早在１９２９年对于半月板修复再生的研究就开始了，早期研究结果认为半月板纤维软骨的损伤不能愈合。

直到８０年代，有研究发现纤维软骨细胞具备活跃４ＴＧＦ—Ｂ１在体外可以诱导犬ＢＭＳＣｓ向软骨细胞分化，分化的软骨细胞表型具备软骨细胞特点。

经阿新蓝染色和甲苯氨蓝染色可见细胞核被染成蓝色，细胞和细胞之间有弥漫的紫红色异染性物质分布。

采用软骨特异性的ＩＩ型胶原进行鉴定结果显示ＩＩ型胶原蛋白阳性表达形态完全符合细胞软骨的结构。

５联合叙贯应用ｂＦＧＦ和ＴＧＦ一１３１生长因子可成功诱导ＢＭＳＣｓ分化为软骨细胞，较单一的诱导剂明显缩短诱导时间。

６ＰＨＢＶ体外细胞相容性实验显示其有良好的细胞相容性，对细胞无毒副作用，较好的生物力学性能，通过进一步的改良，可以作为组织工程化半月板的载体。

７骨髓基质干细胞＋诱导软骨细胞混合在体外与ＰＩｔＢＶ载体结合，可能通过细胞间的及细胞与基质间的相互作用，细胞在载体上增殖生长更好，与对照组有显著性差异。

关键词：半月板；骨髓基质干细胞；软骨细胞；聚羟基丁酸一戊酸酯组织工程：细胞生长因子的增生能力。

同时，生物工程学研究逐渐开展，细胞及分子生物学研究深入，材料学研究的发展等促使组织工程学研究产生。

组织工程就是利用种子细胞一生物材料一细胞因子重建组织器官。

组织工程化半月板的设计原理是从体内取出少量的种子细胞，体外培养扩增后在适合的载体上培养诱导分化，从而获得有活性的半月板。

然而较全身其它组织如骨、软骨等组织而言，目前半月板组织工程缺乏大量实验研究，半月板复合细胞的性质和细胞外基质使得半月板组织工作化更为困难。

一些实验致力于纤维软骨、骨髓基质干细胞等培养条件的研究，仍然有很多工作需要进一步研究。

有实验研究了各种生长因子对各种种子细胞的作用。

在支架材料的研究已做了一些工作，包括天然生物材料及人工合成材料多种材料的实验及临床研究。

这些方法决定了半月板组织工程化的进程。

在完成组织工程化半月板临床应用这一目标之前，还有许多方面问题需要解决，这些问题的解决依赖于种子细胞的类型、来源及培养条件的探索：生长因子在组织工程学中的应用；生物支架的研究和改进以及如何引导细胞向理想的表型分化。

对于半月板而言，由于膝关节内的生物力学需要，对于支架的良好的生物力学性能要求更高。

在种子细胞方面，自体半月板纤维软骨细胞是组织工程化半月板理想的细胞来源。

Ｗｅｂｂｅｒ等曾成功地分离出半月板的纤维软骨细胞，经体外培养显示出很强的增生能力。

在琼脂糖培养系统中，纤维软骨细胞还显示出活跃的分化特征。

纤维软骨细胞的培养研究不多，在藻酸盐类培养或琼脂糖悬液中纤维软骨细胞培养通常为单层。

～项研究中显示：在ＤＭＥＭ或Ｈａｍ’ｓＦ一１２培养液中加入小牛血清（ＦＢＳ）后在Ｈａｍ’ＳＦ．１２培养液中纤维软骨细胞生长更快，细胞呈不同表型。

在ＤＭＥＭ培养液中，细胞呈多边形，而在Ｈａｍ’ｓＦ一１２液中细胞含有空泡或呈纺锤状。

理论上这两种类型细胞是近似于半月板的细胞类型，但尚未进一步实验证实。

同时，纤维软骨细胞在无血清培养液中生长性能更像软骨细胞。

Ｗｅｂｂｅｒ等还研究了器官培养模型：用体外法修复半月板损伤，实验包括去除兔的半月板造成一个缺损，用支架填充缺损处后将半月板放入培养液中，便于观察修复组织的变化，近期实验结果满意。

但纤维软骨细胞取材有限，于是就有大多数实验寻求组织化半月板的种子细胞来源。

骨髓基质干细胞是来源于问质干细胞，具有分化成包括软骨细胞和骨细胞在内的多种组织能力而被看作组织工程化半月板的种子细胞。

骨髓基质干细胞（ＢｏｎｅＭａｒｒｏｗＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，ＢＭＳＣｓ）具有多向分化潜能，除可向中胚层来源的骨、软骨、心肌、脂肪和肌腱等细胞分化外，还可跨胚层向内胚层和神经外胚层，如肝、胆管上皮、肺、肠、皮肤上皮和神经元及神经胶质细胞分化。

因此，从理论上利用骨髓基质干细胞作为组织工程化半月板的种子细胞是完全可行的。

这以理论需建立在对纤维软骨生物特性的了解上，利用各种生物因子诱导骨髓基质干细胞定向分化成纤维软骨细胞。

加上骨髓基质干细胞取材容易、扩增迅速、可自体移植等特点，是现代组织工程理想的种子细胞。

近年骨髓基质干细胞移植在软骨组织工程中应用已取得了一些进展。

但主要集中在把ＢＭＳＣｓ与支架混合移植至受损部位的软骨部位，研究其在特定环境下向软骨细胞分化，期望在结构和功能上替代受损的软骨细胞。

但对ＢＭＳＣｓ体外定向诱导后混合载体三维培养，重建组织工程化半月板的研究不多。

用于组织工程化半月板的支架可分为二大类：天然的和人工合成的。

四类天然支架用于组织工程化半月板：胶原、纤维蛋白、骨膜组织及软骨组织。

在这四类中，主要用于组织工程化半月板的材料是胶原和纤维蛋白。

而骨膜组织效果最差。

最令人鼓舞的结果来自于胶原支架，其优点是生物相容性好、抗原性弱，其分子结构利于种子细胞粘附，在体内可逐步分解，降解终产物无毒副作用。

但实验修复组织未行力学试验。

最好的结果来自胶原一糖胺聚糖（ｇｌｚｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｚｃａｎ，ＧＡＧ）支架研究，这种支架取材于牛的肌腱，实验动物狗被切除８０％的半月板，用胶原一ＧＡＧ支架替代切除部分，将支架修剪成合适的形状，缝合在切除的半月板部位，３年后关节软骨未显示退变迹象。

纤维蛋白（ｆｉｂｒｉｎ）作为天然材料用于组织工程化半月板的重建，具有取材方便、生物相容性好等优点，但其生物力学特征（抗压、抗张、抗剪切力）较差，不足以胜任半月板重建。

用于组织工程化半月板的人工合成材料主要有两类，可降解的和不降解的。

不降解的主要有碳素纤维聚合物、特氟伦网等。

由于这些不降解的材料永久留于体内会有许多中远期并发症，可引起关节内结构的严重破坏，目前已较少应用。

可降解的人工合成生物材料是组织工程化半月板的最佳生物材料。

其优点在于可以根据需要调控材料内部微孑Ｌ大小、表面特性和生物力学特性。

包括聚乳酸（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃａｃｉｄＰＬＡ）、聚羟乙酸（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｃａｃｉｄＰＧＡ）以及ＰＬＡ—ＰＧＡ各种异构体。

尽管有很多的人工合成支架被试验，尚未有一种达到胶原支架的实验进程。

聚羟基烷酸（Ｐｏｌｙ．ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅｓ，ＰＨＡ）是许多微生物合成的胞内碳原和能量储存物。

此物质是一种聚脂类物质，具有热塑性，与聚丙烯、聚乙烯的物理性能和化学结构相似，能拉丝、压膜、注塑等。

它是由１００—３００００个相同或不同的羟基脂肪酸单体首尾相联构成的高分子聚合物。

又分为不同种类：如多聚羟基丁酸［Ｐｏｌｙ（３・ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ），Ｐ（３ＨＢ）］、羟基ｒ酸和羟基戊酸共聚体［Ｐ（ＨＢ—ｃｏ－Ｈｖ）］、羟基丁酸和羟基己酸共聚体［Ｐ（ＨＢ—ＣＯ—ＨＨ）】、羟基丁酸和羟基辛酸共聚体［Ｐ（ＨＢ．ＣＯ—ＨＯ）】等。

多聚羟基烷酸不仅具有塑料的质轻、耐腐蚀、可塑性强、光学活性和压电性好等优良特性，而且具有生物可降解性和生物相容性，在近年来兴起的组织工程中，ＰＨＡｓ显示出广阔的应用前景。

由于其具有可塑性、柔韧性、生物相容性以及可降解性，不仅可用于手术缝合线、药物释放包囊、疮口贴膜，而且可以制成各种模型在体内或体外培养血管、心脏、肝脏、肾脏、角膜、骨骼等组织和脏器供器官移植，达到修复创伤和重建功能的目的。

因此多聚羟基烷酸是一类极有前途的新材料。

在各种多聚体中，对羟基丁酸（ＰＨＢ）的研究最多，发酵机理及其性质了解较多，通过对３．羟基戊酸与３一羟基丁酸共聚物（ＰＨＢＶ）性质研究发现其机械性能优于ＰＨＢ，随着ＨＶ比例增高，ＰＨＢＶ强度和韧性提高，溶解稳定性提高，而且更易被降解。

目前ＰＨＢＶ用于组织工程化半月板尚未见报道。

有关生长因子方面，已知有许多细胞因子具有促进软骨细胞增生、分化的作用，包括成纤维细胞生长因子（ＦＧＦ）、转化生长因子一１３（ＴＧＦ一１３）、胰岛素样生长因子（ＩＧＦ）及血小板衍生生长因子（ＰＤＧＦ）等。

许多生长因子应用在半月板软骨细胞实验中，检测对半月板破裂、缺损的愈合能力或在组织、细胞的培养条件下蛋白合成的能力。

研究显示ＴＧＦ—Ｂ是适合的生长因子之一，ＴＧＦ．Ｂ在软骨细胞不同阶段均有增强蛋白多糖的合成作用，呈剂量依赖性，其中ＴＧＦ．Ｂｌ研究最为深入。

成纤维细胞生长因子可分为酸性和硷性两种，碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）的生物效应包括促进细胞增殖分裂，维持软骨细胞的表型及表达，ｂＦＧＦ与ＴＧＦ．Ｂ１在对软骨细胞上的作用呈现相互促进的正协同效应。

尽管如此，目前这些细胞因子发挥调节作用的机理及因素尚不清楚，它们在组织工程化半月板重建中应用处于实验阶段，还需要从分子和基因水平对其作用机理和调节机制作进一步研究。

本实验研究拟从以下三个方面探讨：（１）犬的骨髓基质干细胞（ＢＭｓＣｓ）在体外培养扩增的条件控制，ＢＭＳＣｓ体外传代的生物学特性。

（２）在体外利用传代的ＢＭＳＣｓ，选用适宜浓度的ｂＦＧＦ和ＴＧＦ～１３１叙贯诱导犬ＢＭＳＣｓ成软骨细胞的条件以及对诱导的软骨细胞进行组织化学鉴定。

（３）应用体外传代扩增犬的ＢＭＳＣｓ和体外诱导ＢＭＳＣｓ成软骨细胞在不同处理条件下的ＰＨＢＶ膜状材料及三维支架上结合生长情况，常规行细胞记数，ＨＥ染色等了解种子细胞与载体的结合情况。