免疫扩散实验(双向双扩散) PPT
生化大实验双向琼脂免疫扩散
四 操作步骤
1. 制板：用移液管吸取热琼脂 20ml，平铺 于直径9cm培养皿中。 2.打孔：待琼脂凝固后，按图1梅花孔型打 孔，孔径 2mm, 孔与孔距离 3-4mm。用针 挑去孔内琼脂。 3.用微量加样器将羊抗人IgG抗体、羊抗人 LDL 抗体及羊抗人 apoA-I 抗体各 5-10ul 加 入周边孔中，中间孔加不同峰的液体。 4. 将培养皿置于生化培养箱内，于 37 ℃温 育，隔天观察结果。
五 注意事项
1.用琼脂浇培养皿时，培养皿必须保持水平位置。
2.每个孔的加样量应保持一致，既使每个孔都被 加满，又必须不使样品溢出孔外。 3.打孔时注意不要将孔弄破。
六 复习题
1.什么是抗原？ 2.什么是抗体？ 3.双向免疫扩散的原理及应用。
○ ○ ○ 三孔型
○ ○
双孔型
○ ○ ○ ○ 双排孔型
○ ○○○ ○
梅花孔型
图1 双向免疫琼脂扩散孔型
三 试剂与器材
1.缓冲液：4.65gTris加水溶解，加115ml 0.1 M HCl，最后补水至1000ml，pH为8.2。 2.凝胶液：5g琼脂糖加500ml上述缓冲液， 微波炉加热煮沸溶解。注意用中小火， 以免暴沸。 3.待测样品：I号峰、II号峰、III号峰 4.羊抗人IgG抗体、羊抗人LDL抗体、羊抗 人apoA-I抗体。 5.生化培养箱、微波炉、刻度吸管、培养 皿、下口径2mm滴管等
二 实验原理
双向免疫扩散是一种定性试验。将抗原、抗体分 别加入琼脂板相对应的小孔中，使两者互相扩散， 在比例适当处形成可见的沉淀线。观察沉淀线的 位置、数量、形状，以及对比关系，可对抗原或 抗体进行定性分析，常用于: （ 1 ）抗原或抗体的纯度鉴定。也可对抗体效价进行 初步估算。 （ 2 ）用已知抗血清（或抗原）检测未知抗原（或抗 体） （3）抗原或抗体相对分子量的估计 双向免疫扩散常见孔型有三孔型、双孔型、双排 孔型、梅花孔型（见图1）
生化大实验双向琼脂免疫扩散
五 注意事项
1.用琼脂浇培养皿时，培养皿必须保持水平位置。
2.每个孔的加样量应保持一致，既使每个孔都被 加满，又必须不使样品溢出孔外。 3.打孔时注意不要将孔弄破。
六 复习题
1.什么是抗原？ 2.什么是抗体？ 3.双向免疫扩散的原理及应用。
2用已知抗血清或抗原检测未知抗原或抗双向免疫扩散常见孔型有三孔型双孔型双排孔型梅花孔型见图1双向免疫琼脂扩散孔型双向免疫琼脂扩散孔型三孔型双孔型梅花孔型双排孔型双排孔型1
纯度检测方法二：
双向免疫扩散试验
一实验目的
学习双向免疫扩散实验原理 掌握双向免疫扩散实验操作方法
基本概念
抗原：抗原（antigenicity）是指能够刺激机体 产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答 产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生 免疫效应（特异性反应）的物质。 抗体：抗体(antibody)指机体的免疫系统在抗 原刺激下，由B淋巴细胞分化成的浆细胞所产 生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的 免疫球蛋白。
二 实验原理
双向免疫扩散是一种定性试验。将抗原、抗体分 别加入琼脂板相对应的小孔中，使两者互相扩散， 在比例适当处形成可见的沉淀线。观察沉淀线的 位置、数量、形状，以及对比关系，可对抗原或 抗体进行定性分析，常用于: （ 1 ）抗原或抗体的纯度鉴定。也可对抗体效价进行 初步估算。 （ 2 ）用已知抗血清（或抗原）检测未知抗原（或抗 体） （3）抗原或抗体相对分子量的估计 双向免疫扩散常见孔型有三孔型、双孔型、双排 孔型、梅花孔型（见图1）
○ ○ ○ 三孔型
○ ○
双孔型
○ ○ ○ ○ 双排孔型
○ ○○○ ○
梅花孔型
图1 双向免疫琼脂扩散孔型
双相免疫扩散试验
双相免疫扩散试验
实验原理：抗原和抗体在含有电解质的琼脂凝胶板的对应孔中，各自向四周凝胶中扩散，当二者发生特异性反应时，在浓度比例合适处形成可见的白色沉淀线。
本实验用于检测免疫成功与否及所产生的抗体的效价，抗体效价以出现明显沉淀线时的抗体的最高稀释度为判定终点。
一般来说，当效价≥1:16时（可在1:64以上），即可放血收集血清。
试剂和器材：
1.待测血清（抗体）
2.0.4%BSA（抗原）
3.琼脂粉、生理盐水
4.载玻片、吸管、滴管、打孔器、湿盒等
步骤和方法：
1.制备琼脂凝胶：生理盐水配制浓度为12g/L的琼脂，完全溶化至澄清
2.浇板：将载玻片置于水平台上，吸取琼脂加在玻片上，盖满、平整、无气泡
3.打孔：待琼脂凝固后，按下图打孔
4.加样：中心孔加入抗原，1-6孔所加血清的稀释度分别为：
1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,1:256,每孔加样10μl
5.扩散：将加好样的琼脂板放入湿盒中，室温放置1-3d观察结果
结果判定：肉眼观察是否产生乳白色沉淀线
注意事项：
1. 加样时不要溢出空外
2. 反应时间要适宜，时间过长，沉淀线可解离而导致假阴性，时间过短，则沉
淀线不出现或不清楚。
实验七 免疫双扩散检测抗GFP血清抗体
实验七免疫双扩散检测抗GFP血清抗体[实验原理] 在溶液中的可溶性多价抗原与血清抗体相遇，当两者的比例适当时可以形成一种网状的不溶性的大分子复合物，这叫作免疫沉淀反应。
当这样的抗原和相应的抗体在含有电解质的琼脂凝胶中相对扩散时，在抗原与抗体的比例适当处会形成可见的沉淀线，这叫免疫双扩散实验，是免疫沉淀反应的一种。
免疫双扩散常用于动物免疫效果的检测和血清抗体效价的测定。
本实验使用的粗抗原是大肠杆菌表达的GFP的抽提物，抗体是GFP免疫兔子后得到的抗血清。
[仪器、试剂和材料]1、磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.42、1.5%琼脂，PBS配置3、兔抗GFP血清4、GFP粗提物5、微波炉6、恒温培养箱7、载玻片8、自制打孔器9、小塑料盒10、针头、牙签11、“枪”、“枪头”[实验操作]1、1.5%琼脂的配制:pH 7.4的PBS 100mL中加1.5克琼脂，微波炉中小功率加热，使琼脂完全溶化。
2、取干净的载玻片，平放于实验台（台面要水平），将融化的琼脂趁热加在载玻片上（约加4mL），使琼脂铺满整个玻片的表面（注意勿使琼脂流出玻片之外）。
令其在室温下冷却凝固。
3、将载玻片放在画好的打孔式样的样板上，用自制打孔器（内径2-3毫米）在琼脂上照样板打孔，做两朵“花”。
用针头小心地将打好的孔中的琼脂挑出，当心不要碰伤了孔周围的琼脂。
打好孔后，把凝胶的右下角切掉一小块，作为标记。
4、GFP抗原的稀释：用上次实验得到的GFP粗提物的饱和硫酸铵沉淀，加100mL的PBS使溶解，此为抗原的原液。
取出原液15mL，在一小块封口膜上用PBS做系列的倍比稀释，直到稀释为1：16。
5、在左边一朵花的中央孔中加约15mL的免疫后兔血清，周围孔加不同稀释度的GFP粗提物。
右边的一朵花除中央孔中加免疫前的兔血清外其余的与左边的相同。
加样时将每孔加满即可，注意不要使溢出孔外。
6、在小塑料盒中铺一块滤纸，加少量水将滤纸浸湿，上面放两根牙签，将加好样的载玻片放在牙签上，盖好盒盖，放37℃温箱中过夜。
双向琼脂扩散试验课件
在疫苗研制中的应用
疫苗有效性评估
通过检测免疫后机体的抗体反应，评 估疫苗的保护效果和免疫原性。
疫苗质量监控
在疫苗生产过程中，通过检测抗原含 量和纯度，确保疫苗的质量和安全性 。
在抗体检测中的应用
免疫状态评估
检测机体的抗体水平，评估个体的免疫状态和免疫保护能力 。
疫苗接种效果监测
通过检测疫苗接种后机体产生的抗体，监测疫苗的免疫效果 和接种率。
单向琼脂扩散试验
将抗原或抗体固定在琼脂 凝胶的一侧，扩散后与相 应的抗体或抗原反应，形 成沉淀线。
对流琼脂扩散试验
将抗原和抗体分别加在琼 脂凝胶的相对两侧，使两 者在琼脂中相互扩散并反 应，形成沉淀环。
双向琼脂扩散试验
在琼脂凝胶中同时加入抗 原和抗体，两者在琼脂中 扩散并反应，形成沉淀线 或沉淀环。
THANKS
感谢观看
法性和合规性。
结果误差分析
误差来源分析
01
对试验过程中可能产生的误差来源进行分析，包括仪器误差、
操作误差、环境误差等。
误差传递分析
02
对试验误差进行传递分析，了解误差对试验结果的影响程度。
误差控制措施
03
根据误差分析结果，采取相应的控制措施，减小误差对试验结
果的影响，提高试验结果的准确性和可靠性。
02
试验材料与设备
试验材料
琼脂糖凝胶
用于制备凝胶板，选择适当的 琼脂糖类型和浓度。
标记笔
用于标记抗原和抗体位置，需 选择不脱色的标记笔。
抗原和抗体
选择适当的抗原和抗体是试验 成功的关键，需确保质量和纯 度。
硝酸纤维素膜
用于固定抗原和抗体，选择适 当的规格和品牌。
缓冲液
沉淀试验——双向免疫扩散
沉淀试验一一双向免疫扩散试验一、目的要求1.掌握双向免疫扩散试验的原理和用途；2.熟悉双向免疫扩散试验的操作方法。
二、实验原理可溶性抗原(如细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液、病毒、组织浸出液等)与相应的抗体结合后，在适量电解质存在下，形成肉眼可见的白色沉淀线，称为沉淀试验(precipitation)。
在生理条件下，抗原抗体均带负电荷，使极化的水分子在其周围形成水化膜，成为亲水胶体。
当抗原与抗体结合后，表面电荷减少，水化膜变薄；而且由于抗原抗体复合物形成后，与水接触的表面积减少，由亲水胶体转化为疏水胶体。
在电解质作用下，各疏水胶体之间靠拢，形成可见的抗原抗体复合物。
如果抗原成分不纯，免疫动物后可以产生针对不同抗原成分的多种抗体，于是就形成多条沉淀线，如图2-1所示。
图双向免疫扩散试验(doubleagarimmunodiffusiontest)：将可溶性抗原和抗体分别加到琼脂板上相应的小孔内，由于抗原和抗体各自向四周扩散，故称双向琼脂扩散试验。
若抗原与抗体相对应，两者相遇即发生特异性结合形成抗原抗体复合物，由于该复合物的体积大于琼脂的微小孔隙，于是不能扩散，并逐步聚集在一起形成白色沉淀线。
每一对应抗原和抗体可出现一条沉淀线，出现沉淀带的抗体最大稀释倍数即为抗体效价。
由于抗原抗体在琼脂内的扩散受到浓度、分子量大小与表面电荷的影响，所以沉淀线可以出现在抗原孔与抗体孔之间的不同位置。
当抗体浓度过高时，沉淀线就靠近抗原孔，为前带；相反，则沉淀线靠近抗体孔，为后带。
如果抗原与抗体的比例合适，则沉淀线位于两孔中间，为等价带，如图2-2所示。
图2-2抗原-抗体结合的沉淀带形成原理示意图三、实验用途：沉淀试验广泛应用于病毒抗原、细菌毒素或寄生虫抗原等的诊断（图2-3）,以及各种免疫血清效价和毒素、抗毒素的测定等。
四、材料：（1）耗材：小平皿、1.5mL 的离心管、吸头；（2）试剂：琼脂糖、8.5%高渗盐水、待检血清、鸡卵白素（ovalbumin,OVA ）、兔抗OVA 阳性血清；（3）仪器：高压锅、打孔器、移液器、湿盒、恒温箱。
免疫扩散实验(双向双扩散)ppt课件
免疫扩散实验（双向双扩散）
2010级生物技术第四组
免疫扩散实验(双向双扩散)
1
实验目的
▪ 了解双向琼脂扩散的原理和用途。 ▪ 掌握抗体效价的测定方法。 ▪ 观察抗原、抗体在琼脂板中形成的沉淀线。
免疫扩散实验(双向双扩散)
3
实验材料
▪ 生理盐水、1%琼脂（用于制作琼脂扩散试 验平板）
▪ 已知传染性法氏囊病毒抗原、待检血清 ▪ 打孔器、微量加样器、枪头、酒精灯、搪
瓷盒等
免疫扩散实验(双向双扩散)
4
实验步骤
1. 制板：称取1g琼脂粉，加入100ml生理盐水， 煮沸使之溶解。待溶解的琼脂温度降至60℃左 右时倒入平皿中，厚度为2-3mm。注意勿产生 气泡。
2. 打孔：待琼脂凝固好后用打孔器打孔，孔径和 孔距依不同疫病检疫规程而定，一般孔径 3~5mm，孔间距4~7mm。孔型多为7孔，中央 1孔，周围6孔（如梅花孔）。用针头挑出孔内 琼脂。
3. 封底：将琼脂板无凝胶面在酒精灯火焰上轻轻 灼烧，用手背感受微烫即可。
免疫扩散实验(双向双扩散)
5
4. 抗体效价测定：用微量加样器于中央孔加 入已知抗原，于周围孔加倍比稀释的血清， 每个稀释度加1孔。加样时不要使样品外 溢或在边缘残存小气泡，以免影响扩散结 果。
免疫扩散实验(双向双扩散)
2
实验原理
▪ 双向双扩散简称双扩散，此法是一种定性 试验。可溶性抗原与相应的抗体在琼脂凝 胶中各自向四周扩散，如果抗原和抗体相 对应，则在二者比例适当处形成白色沉淀 线；若抗原和抗体无关就不会出现沉淀线。 此试验可以检测抗原或抗体的纯度，滴定 抗体的效价，以及用已知抗原（抗体）检 测和分析未知抗体（抗原）。
免疫双扩散法的基本原理
免疫双扩散法的基本原理免疫双扩散法（Immune Double Diffusion）是一种常用的免疫学实验方法，用于检测特定抗原与抗体之间的相互作用。
该方法基于抗原和抗体在凝胶中扩散的原理，通过观察扩散过程中形成的免疫沉淀线来确定样品中是否存在目标抗原。
免疫双扩散法的基本原理是基于抗原与抗体之间的可逆结合。
在实验中，首先将待测抗原和已知抗原分别与相应的抗体混合，形成抗原-抗体复合物。
然后，将这些混合物分别加入含有琼脂糖的凝胶孔中，使其扩散。
当抗原-抗体复合物扩散到凝胶孔中时，它们会与在凝胶中预先添加的相应抗体结合。
这种结合会导致免疫沉淀的形成，形成可见的沉淀线。
沉淀线的长度和密度与待测抗原的浓度成正比，可以通过比较不同样品中沉淀线的形成情况来定量测定目标抗原的含量。
免疫双扩散法的优势在于其简单性和灵敏性。
无需复杂的仪器和设备，只需一些基本的实验器材即可进行实验。
此外，该方法可以同时检测多个样品中的抗原，因此在高通量的实验中具有一定的优势。
在实际应用中，免疫双扩散法被广泛用于医学诊断、生物学研究和药物研发等领域。
例如，通过检测血清中特定抗原的含量，可以帮助医生诊断某些疾病。
在疫苗研发中，该方法可以用于检测疫苗中抗原的含量和纯度。
此外，免疫双扩散法还可以用于检测抗体的结合特异性以及抗原的相互作用。
然而，免疫双扩散法也存在一些局限性。
首先，该方法对于低浓度的抗原检测较为困难，因为低浓度的抗原很难与抗体有效结合形成免疫沉淀。
其次，该方法的定量结果受到多种因素的影响，如温度、孔的大小和凝胶的浓度等。
因此，在实验过程中需要进行严格的控制和标准化操作。
免疫双扩散法是一种简单而有效的免疫学实验方法，可以用于检测特定抗原与抗体之间的相互作用。
通过观察免疫沉淀线的形成情况，可以定量测定抗原的含量。
尽管存在一些局限性，但免疫双扩散法仍然被广泛应用于医学和生物学领域，为科学研究和临床诊断提供了有力的工具。
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实验材料
▪ 生理盐水、1%琼脂（用于制作琼脂扩散试 验平板）
▪ 已知传染性法氏囊病毒抗原、待检血清 ▪ 打孔器、微量加样器、枪头、酒精灯、搪
瓷盒等
实验步骤
▪ 制板：称取1g琼脂粉，加入100ml生理盐水， 煮沸使之溶解。待溶解的琼脂温度降至60℃左 右时倒入平皿中，厚度为2-3mm。注意勿产生 气泡。
大家有疑问的，可以询问和交流
可以互相讨论下，但要小声点
9
结果判定
用梅花孔检测抗血清的效价，操作时将抗原置 于中心孔，抗血清倍比稀释后置于周围孔，以 出现沉淀带的血清最高稀释倍数为该血清的琼 扩效价。
若凝胶中抗原、抗体是特异性的，则形成抗原 抗体复合物，在两孔之间出现清晰致密的白色 沉淀线，为阳性反应。若在72小时内仍未出现 沉淀线则为阴性反应。实验时至少要做一阳性 对照。出现阳性对照与备检样品的沉淀线发生 融合，才能确定待检样品为真正阳性。
▪ 扩散：加样完毕后，将琼脂板放于湿盒内， 保持一定的湿度，置于37℃温箱中扩散 24~48小时观察结果。
图1
结果判定ห้องสมุดไป่ตู้
▪ 用以检测抗原或比较抗原差异时，将抗血 清置中心孔，将待测抗原或需比较的抗原 置于周围相邻孔。若出现沉淀带完全融合， 证明为同种抗原；若二者有部分相连，表 明二者有共同抗原决定簇；若二条沉淀线 相互交叉，说明二者抗原完全不同。
免疫扩散实验（双向双扩散）
2010级生物技术第四组
实验目的
▪ 了解双向琼脂扩散的原理和用途。 ▪ 掌握抗体效价的测定方法。 ▪ 观察抗原、抗体在琼脂板中形成的沉淀线。
实验原理
▪ 双向双扩散简称双扩散，此法是一种定性 试验。可溶性抗原与相应的抗体在琼脂凝 胶中各自向四周扩散，如果抗原和抗体相 对应，则在二者比例适当处形成白色沉淀 线；若抗原和抗体无关就不会出现沉淀线。 此试验可以检测抗原或抗体的纯度，滴定 抗体的效价，以及用已知抗原（抗体）检 测和分析未知抗体（抗原）。
双向免疫扩散凝胶染色图
注意事项
▪ 浇制琼脂板时要均匀、无气泡。 ▪ 孔要打得圆整光滑，边缘不要破裂。 ▪ 加样时应尽量避免气泡或加到孔外，以保
证结果的准确性。 ▪ 注意微量进样器每加一个样品之后，更换
枪头。
思考题
▪ 如何进行血清琼扩效价的测定？
▪ 打孔：待琼脂凝固好后用打孔器打孔，孔径和 孔距依不同疫病检疫规程而定，一般孔径 3~5mm，孔间距4~7mm。孔型多为7孔，中央 1孔，周围6孔（如梅花孔）。用针头挑出孔内 琼脂。
▪ 封底：将琼脂板无凝胶面在酒精灯火焰上轻轻 灼烧，用手背感受微烫即可。
▪ 抗体效价测定：用微量加样器于中央孔加 入已知抗原，于周围孔加倍比稀释的血清， 每个稀释度加1孔。加样时不要使样品外 溢或在边缘残存小气泡，以免影响扩散结 果。