植物激素检测方法
植物激素检测方法
一、什么是植物激素？
植物激素是植物体内合成的一系列痕量有机化合物，它在植物的某一部位产生，运输到另一个或一些部位，在极低的浓度下便可引发生理反应，几乎参与了调控植物从种子休眠、萌发、营养、生长和分化到生殖、成熟和衰老的每个生命过程，既可调控植物自身的生长发育，又通过与植物所生存的外部环境互相作用调节其对环境的适应。
通过调控如细胞分裂素、油菜素内酯和生长素等植物激素的代谢可显著地改良作物的株型结构和产量构成，从而大幅度提高作物产量和品质。
植物激素主要包括生长素(auxin)、赤霉素(gibberellin，GA)、细胞分裂素(cytokinin，CTK)、脱落酸(abscisic acid，ABA)、油菜素甾醇类(brassinosteroids，BRs)、茉莉酸(jasmonic acid，JA)及其甲酯(MeJA)、水杨酸类(salicylic acids，SA)、乙烯(ethylene)和多肽激素(peptide hormones)等。
二、检测方法
科标生物检测中心可以提供各种植物样品检测服务，中心是通过权威认证的第三方机构，检测后出具权威检测报告。
三、主要分析技术
1、生物鉴定法是一类经典的植物激素检测方法，它利用激素作用于植物的组织或器官时产生的特异性反应对植物激素进行测定。
2、免疫检测技术是测定植物激素的常用方法。
该方法是基于抗原和抗体的特异性结合，因此有较好的专一性。
采用放射性元素标记的方法，即放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)，其检测灵敏度高，重复性好，但对实验条件的要求较高。
3、气相色谱火焰离子化检测法(GC-FID)和气相色谱质谱法(GC-MS)能够对所分析样品进行准确、高灵敏度测量，但由于气相色谱对样品的特殊要求，使得待测组分需具有一定挥发性，因此在植物激素样品的前处理过程中需对样品进行衍生化。
4、高效液相色谱紫外检测法(HPLC-UV)、高效液相色谱荧光检测法(HPLC-FL)和高效液相色谱质谱检测法(HPLC-MS)也大量用于植物激素的纯化及定量分析，其中MS因为具有良好的选择性和灵敏度，并且能够给出化合物的结构信息，在实际检测中得到了更普遍的运
用。
以MS作检测器时，常采用稳定同位素标记的化合物作为内标，这样既扣除了萃取步骤中样品损失的影响，同时也能排除背景基质干扰，因此使得定量分析结果更为准确。
4、毛细管电泳技术(CE)也是分离检测植物激素的有效手段，样品消耗量少、分离效果好，但由于灵敏度和重现性等方面的限制阻碍了其进一步的运用。
5、其他的分析方法也被用于植物激素的检测，如光谱法、电化学法等。
植物激素免疫测定指南
植物激素的酶联免疫吸附测定法（ELISA）免疫测定是利用抗原、抗体特异性反应而建立的，根据可视化方法的不同可分为：酶联免疫、放射免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定、生物发光免疫测定、浊度免疫测定法等。
由于酶联免疫吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assays, 简称ELISA）具有灵敏性、特异性高，且方便、快速、安全、成本低廉的特点，而日益被广泛应用于植物激素测定。
目前，几大类植物激素IAA,ABA, GA3、GA4、iPA、ZR、DHZR等都建立了相应的ELISA方法并有试剂盒出售。
植物激素的酶联免疫检测方法有两种形式（见下图），一种是在固相载体上直接包被抗体（直接法，先包被二抗，再加一抗），另一种是包被抗原（间接法）。
直接法利用游离抗原和酶标抗原与吸附的抗体进行竞争。
间接法利用游离抗原和吸附抗原与游离抗体进行竞争。
间接法的原理可用下式表示：Ab+H+HP=AbH+AbHP其中Ab表示抗体，H表示游离激素，HP表示吸附在板上的激素－蛋白质复合物。
根据质量作用定律，当该反应体系中Ab及HP的量确定时，游离H越多，结合物AbH形成的就越多，而AbHP形成的就越少，即结合在板上的抗体就越少，通过酶标二抗检测结合物AbHP的多少，就可以确定游离H 量的多少。
材料、试剂及设备1 材料各种新鲜植物材料2 仪器设备研钵，冷冻离心机，台式快速离心浓缩干燥器或氮气吹干装置，酶联免疫分光光度计，吸水纸，恒温箱，冰箱，酶标板（40孔或96孔），可调微量液体加样器（10μl，40μl,200μl,1000μl），带盖瓷盘（内铺湿纱布）。
3 试剂(1) 包被缓冲液：称取１.５g Na2CO3, 2.93g NaHCO3, 0.2g NaN3（可不加）, 用量筒加1 000 ml蒸馏水，pH为9.6.(2) 磷酸盐缓冲液（PBS）：称取8.0g NaCl, 0.2g KH2PO4 , 2.96g Na2HPO4 ·12H2O，用量筒加1 000 ml蒸馏水，pH为7.5。
植物激素的测定方法
植物激素的测定方法植物激素是一类由植物自身合成并参与生长发育调控的活性物质，对植物的生长发育起着重要作用。
因此，准确测定植物激素的含量对于研究植物生长发育调控机制具有重要意义。
本文将介绍几种常用的植物激素测定方法。
一、高效液相色谱法（HPLC）高效液相色谱法是目前应用最广泛的植物激素测定方法之一。
该方法基于植物激素在高效液相色谱柱上的保留时间和峰面积，通过与已知浓度的标准品比较，可以计算出待测样品中植物激素的含量。
高效液相色谱法具有分离效果好、分析速度快、准确度高的优点，但需要专用的仪器设备，操作较为复杂。
二、气相色谱法（GC）气相色谱法是另一种常用的植物激素测定方法。
该方法通过将待测样品中的植物激素转化为易挥发的衍生物，然后在气相色谱柱上进行分离和定量分析。
气相色谱法具有测定灵敏度高、分离效果好的特点，但需要对样品进行预处理，并且对仪器的稳定性要求较高。
三、酶联免疫吸附法（ELISA）酶联免疫吸附法是一种常用的免疫学测定方法，也可以用于测定植物激素的含量。
该方法通过将植物激素与特异性抗体结合，然后再用酶标记的二抗进行检测，最后通过比色反应或发光反应来测定植物激素的含量。
酶联免疫吸附法具有操作简便、成本较低的优点，但需要特异性较好的抗体。
四、放射免疫测定法（RIA）放射免疫测定法是一种使用放射性同位素标记的植物激素进行测定的方法。
该方法通过将放射性同位素标记的植物激素与待测样品中的植物激素结合，然后通过放射性计数来测定植物激素的含量。
放射免疫测定法具有灵敏度高、测定范围广的特点，但需要使用放射性同位素，存在辐射危险。
五、质谱法（MS）质谱法是一种高灵敏度的分析方法，可以用于测定微量的植物激素。
该方法通过将待测样品中的植物激素通过质谱仪进行分子质量分析，从而测定植物激素的含量。
质谱法具有高灵敏度、高分辨率的特点，但需要专用的仪器设备和较高的技术水平。
植物激素测定方法有高效液相色谱法、气相色谱法、酶联免疫吸附法、放射免疫测定法和质谱法等。
植物激素 整理
植物激素的检测方法1. 生物测试生物测试法是最早采用的植物激素测定方法它是利用植物激素的生理活性通过某些植物的组织和器官对植物激素产生的特异性反应进行测定的。
优点：简便易行也能反映植物激素的生理活性缺点：专一性较差且植物体内含有生长素类似物~ 拮抗物等影响测定的结果需在前处理中尽可能纯化所要测定的组分过程复杂此外重复性差工作量大2. 免疫检测免疫学技术应用于植物激素的测定有力地促进了激素定量研究的发展它的基本原理是利用抗原和抗体的特异性竞争结合。
优点：了检测灵敏度可检测出10-12 g 的微量物质相应其前处理也得到了简化又改善了测定的专一性。
缺点：抗体的制备较复杂。
3.物理化学方法物理化学方法分光谱法和色谱法两种1）分光谱法：主要有紫外吸收光谱~ 红外吸收光谱和荧光法优点：灵敏度高缺点：专一性差2）色谱法：利用物质在不同介质中的分配原理进行测定的，包括纸上层析，薄层层析(TLC) ，气相色谱(GC) ，高效液相色谱(HPLC) 以及气质联用(GC-MS) 等，将分离和测定结合起来是色谱法的基本特点。
（1）纸上层析和TLC：优点：设备简单易操作缺点：分离效率和灵敏度有限制（2）G C 和HPLC：是在纸上层析和TLC 的基础上装备了商品化的色谱柱和检测器，保证了检测方法的专一、灵敏和准确（3）GC 和HPLC 方法:分析植物激素, 灵敏度和选择性高, 重复性好, 但对前处理要求较高; 又因保留时间的分辨有一定限制, 若达不到所需纯度要求可能会出现多种化合物的保留时间相同或接近而影响测定结果。
（4）在植物激素的理化检测中, 仪器联用是当代的发展趋势：最常用的结合系统是气相色谱-质谱联用(GCMSD，技术, 它是目前最为可靠的激素检测方法, 还可验证其它测定方法的可靠性, 而且还可鉴定未知物质的结构，但需经冗长的样品纯化程序, 设备昂贵, 使用和维护成本高。
此外有气液相色谱( GLCD 配以火焰热离子检测器(FTDD 快速灵敏地对植物细胞分裂素定量测定[25], 也有薄层色谱与气相色谱结合分析ABA。
植物激素生物测定
2、苋红素合成法
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2、苋红素合成法
注意： 1、尾穗苋黄化苗对光十分敏感，整个试 验需在暗室内进行。 2、尾穗苋种子有较长的休眠期，新收获 的种子不能发芽。可放在冰箱中经2-3个 的低温处理后发芽使用。
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3、组织培养鉴定法
经典方法之一。 大豆愈伤组织、烟草茎的髓部、胡萝卜根 韧皮部等都对细胞分裂素有较高敏感性。 此法专一性强，缺点是需时较长。
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四、脱落酸的生物测定
1、小麦胚芽伸长法 与生长素的测定方法完全相同，只是脱落 酸的作用是抑制小麦胚芽鞘的伸长。与对 照相比，脱落酸处理组的小麦胚芽鞘伸长 少，脱落酸浓度愈高，胚芽鞘的伸长愈少。
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2、棉花外植体脱落法
脱落酸能诱导离区细胞中纤维素酶和果胶 酶的生物合成，从而促进植物离层的形成， 导致器官脱落。叶柄对外源脱落酸很敏感， 在一定的浓度范围内，脱落率与浓度成正 比，脱落时间与脱落酸浓度成反比。
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1、萝卜子叶增重法
细胞分裂素有促进萝卜子叶增大的效应， 其主要原因是促进了细胞的分裂和扩大。 在一定浓度范围内（激动素为2-25mg/L）， 子叶增重与浓度呈线性关系。
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1、萝卜子叶增重法
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2、苋红素合成法
原理：尾穗苋（Amaranthus caudatus） 在光照下由幼苗合成一种红色色素-苋红 素（Amaranthin或Betacyanin）。在暗中 发芽的尾穗苋子叶不能合成苋红素，子叶 呈白色。但如供给细胞分裂素和酪氨酸， 暗中萌发的尾穗苋子叶就能合成苋红素。 在激动素浓度为0.01-3mg/L范围内，色素 的量与激动素浓度增加成比例。
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第五章：植物激素的生物测定
植物激素的测定分析采用薄层层析(thin layer chromatography,TLC)、气相色谱 (gas chromatography,GC)、高效液相层 析(high performance liquid chromatography,HPLC)和质谱分析(mass spectrography,MS)等，其原理大都是基 于不同物质在不同介质中有不同的分配系 数。
酶联免疫法(ELISA)测定植物激素含量
酶联免疫法（ELISA）测定植物激素含量姓名：李希东专业：植物学学号：200808201 日期：09.5.10 成绩：一、实验目的：掌握间接法测定植物激素的原理和方法；了解逆境对玉米根系ABA和IAA含量的影响。
二、实验原理：酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbert assay，简称ELISA)是在免疫酶技术(immuno enzymite technique)的基础上发展起来免疫测定技术。
其建立在两个重要的生物化学反应基础之上的，即①抗原抗体反应的高度专一性和敏感性；②酶的高效催化特性。
ELISA把这二者有机地结合在一起，即被分析物先与其相应的抗体或抗原反应，然后再检测抗体或抗原上酶标记物的活性，从而达到定性或定量测定的目的。
间接法是将过量的与蛋白质连接的待测植物激素(实验前将该激素与牛血清白蛋白等蛋白质连接成[激素一蛋白质复合物])吸附在固相支持物上，然后加入待测植物激素和相应抗体，使抗体与待测植物激素及激素蛋白质复合物结合，再加入酶标抗体(标记酶与非特异第二抗体的复合物)，就形成〔蛋白质·激素·第一抗体·第二抗体·酶复合物〕，加入底物后就生成有色产物，测定其吸光率，可计算待测抗原的量。
如果抗体、激素一蛋白质复合物和酶标抗体的量一定，并且[激素·蛋白质复合物]和待测激素的总量超过抗体的量，那么生成的[蛋白质·激素·第一抗体·第二抗体·酶复合物]的量就受待测激素含量的限制，因此待测抗原的量将与吸光率成反比。
图A表示间接酶联免疫方法的基本原理：A.间接酶联免疫原理示意图示反应板（固相载体）示激素特异抗体（一抗）示激素（抗原）示非特异二抗示蛋白质·激素复合物示标记酶本实验所采取的方法，则是利用游离抗原和吸附抗原与游离抗体的竞争性结合反应，它的原理可用下式表示:Ab十H十HP=AbH十AbHP其中Ab表示抗体，H表示游离激素，HP表示吸附在板上的激素一蛋白质复合物。
植物激素整理
植物激素整理植物激素的检测方法1. 生物测试生物测试法是最早采用的植物激素测定方法它是利用植物激素的生理活性通过某些植物的组织和器官对植物激素产生的特异性反应进行测定的。
优点：简便易行也能反映植物激素的生理活性缺点：专一性较差且植物体内含有生长素类似物~ 拮抗物等影响测定的结果需在前处理中尽可能纯化所要测定的组分过程复杂此外重复性差工作量大2. 免疫检测免疫学技术应用于植物激素的测定有力地促进了激素定量研究的发展它的基本原理是利用抗原和抗体的特异性竞争结合。
优点：了检测灵敏度可检测出10-12 g 的微量物质相应其前处理也得到了简化又改善了测定的专一性。
缺点：抗体的制备较复杂。
3.物理化学方法物理化学方法分光谱法和色谱法两种1）分光谱法：主要有紫外吸收光谱~ 红外吸收光谱和荧光法优点：灵敏度高缺点：专一性差2）色谱法：利用物质在不同介质中的分配原理进行测定的，包括纸上层析，薄层层析(TLC) ，气相色谱(GC) ，高效液相色谱(HPLC) 以及气质联用(GC-MS) 等，将分离和测定结合起来是色谱法的基本特点。
（1）纸上层析和TLC：优点：设备简单易操作缺点：分离效率和灵敏度有限制（2）G C 和HPLC：是在纸上层析和TLC 的基础上装备了商品化的色谱柱和检测器，保证了检测方法的专一、灵敏和准确（3）GC 和HPLC 方法:分析植物激素, 灵敏度和选择性高, 重复性好, 但对前处理要求较高; 又因保留时间的分辨有一定限制, 若达不到所需纯度要求可能会出现多种化合物的保留时间相同或接近而影响测定结果。
（4）在植物激素的理化检测中, 仪器联用是当代的发展趋势：最常用的结合系统是气相色谱-质谱联用(GCMSD，技术, 它是目前最为可靠的激素检测方法, 还可验证其它测定方法的可靠性, 而且还可鉴定未知物质的结构，但需经冗长的样品纯化程序, 设备昂贵, 使用和维护成本高。
此外有气液相色谱( GLCD 配以火焰热离子检测器(FTDD 快速灵敏地对植物细胞分裂素定量测定[25], 也有薄层色谱与气相色谱结合分析ABA。
植物激素的酶联免疫吸附测定法(ELISA)
结果计算： 曲线的横坐标用激素标样各浓度（ng/ml ）的自然对 数表示，纵坐标用各浓度显色值的logit值表示。Logit 值的计算方法如下： B/B0 B Logit（B/B0）=ln———— =ln———— 1-B/B0 B0-B 其中B0是0ng/ml孔的显色值，B是其它浓度的显色 值。 待测样品可根据其显色值的logit值从图上查出其所 含激素浓度（ng/ml）的自然对数，再经过反对数即可 知其激素的浓度（ng/ml）。 求得样品中激素的浓度后，再计算样品中激素的含量 （ng/g•fw）。
材料、试剂及设备
(1) 磷酸盐缓冲液（PBS）：称取8.0g NaCl, 0.2g KH2PO4 , 2.96g Na2HPO4 •12H2O，用量筒加1 000 ml蒸馏水，pH为7.5。 (2) 样品稀释液：500 ml PBS中加0.5 ml Tween-20， 0.5g明胶（稍加热溶解）。 (3) 底物缓冲液：称取5.10g C6H8O7•H2O（柠檬酸）， 18.43g Na2HPO4•12H2O，用量筒加1 000ml蒸馏水， 再加1 ml Tween-20，pH为5.0。 (4) 洗涤液：1000ml PBS加1mlTween-20。 (5) 终止液：2mol/L H2SO4。
实验步骤
一、竞争：即加标准物、待测样和抗体。 加标样及待测样： 取适量所给标样用样品稀释液配成： IAA标准曲线的最大浓度为100ng/ml。然后再依ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ2倍 稀释8个浓度（包括0ng/ml ）。将系列标准样加入96孔 酶标板的前两行，每个浓度加2孔，每孔50μl,其余孔加 待测样，每个样品重复两孔，每孔50μl。 加抗体：在5ml样品稀释液中加入一定量的抗体,混匀 后每孔加50μl，然后将酶标板加入湿盒内开始竞争。 竞争条件37℃左右0.5h。
植物激素的测定方法
加 抗体
➢在微孔中加入一定量的抗体,混匀后每孔加 50μl，然后将酶标板加入湿盒内开始竞争。
➢竞争条件37℃左右0.5h。
洗板
将反应液甩干并在报纸上拍净。第一 次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着 加第2次。共洗涤3次。
加“二抗”
将适当的酶标二抗，加入10ml样品稀释 液中（比如稀释倍数1:1000就加10μl），混 匀后，在酶标板每孔加100μl，然后将其放入 湿盒内，置37℃下，温育0.5h。
4、制备生物导弹用于肿瘤、 移植等的临床治疗。
六、人工制备的抗体
• 多克隆抗体：多个抗原决定基——机体—— 多种抗体的混合物
• 单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）：由一个B细胞克隆产生的、针对 某一特定抗原决定簇的高度特异性抗体
• 基因工程抗体
用标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提高免 疫学诊断的敏感性
植物激素的酶连免疫分析法
几种酶标分析仪
DNM-9602A酶标分析仪
DNM-9602G酶标分析仪 DNM-9602 标配酶标分析仪
操作步骤
包被---温育---洗涤---竞争--温育---洗涤---加二抗---温育--洗涤---显色---比色---计算
包被
• 每小孔中加入100μl包被缓冲液，然后 将酶标板放入内铺湿纱布的带盖瓷 盘内。
间接ELISA
双抗夹心法
放射性同位素：
125I、131I 酶：辣根过氧化物 酶、硷性磷酸酶
荧光素 ：异硫氰酸荧光素（黄 绿色荧光）、藻红蛋白、 罗丹 明（红色荧光）
放射免疫检测法（RIA） 酶免疫检测法（EIA） 免疫荧光检测法（IFA） 液相（ELISA）、固相（免疫组化技术）
植物激素生物测定
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1、水稻幼苗叶鞘伸长“点滴”法
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2、大麦胚乳法
大麦种子吸水萌动后，胚中产生的赤霉素 将胚乳最外的糊粉层中的α -淀粉酶激活。 无胚的大麦半粒种子不能产生赤霉，因此 没有α -淀粉酶活性。它被成功地应用于 赤霉素类物质的测定。
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2、大麦胚乳法
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3、矮生玉米叶鞘法
以赤霉素浓度的对数为横坐标,叶鞘长度的 对数为纵坐标。
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2、苋红素合成法
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2、苋红素合成法
注意： 1、尾穗苋黄化苗对光十分敏感，整个试 验需在暗室内进行。 2、尾穗苋种子有较长的休眠期，新收获 的种子不能发芽。可放在冰箱中经2-3个 的低温处理后发芽使用。
30
3、组织培养鉴定法
经典方法之一。 大豆愈伤组织、烟草茎的髓部、胡萝卜根 韧皮部等都对细胞分裂素有较高敏感性。 此法专一性强，缺点是需时较长。
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第五章：植物激素的生物测定
生物测定法是通过测定激素作用于植株或 离体器官后所产生的生理生化效应的强度， 从而推算植物激素含量的方法。
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第五章：植物激素的生物测定
植物激素的生物测定法要求有较强的专一 性, 较高的灵敏性和较短的实验周期, 尤 其是对粗提物的未知激素的粗筛, 常可得 到定性定量的相对结果。测定时, 对环境 条件和植物材料都有较严格的要求。
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三、细胞分裂素的生物测定法
细胞分裂素(cytokinins)是植物体内普遍存 在的一类激素，其生理作用主要是促进细胞 分裂和扩大，延迟叶片衰老。 细胞分裂素生物测定依据： A：细胞分裂，细胞数目增加或组织增重； B：细胞扩大，即体积的增加； C：延迟叶片衰老，即叶绿素的降解延缓； D：诱导素的合成，即苋红素的合成。
植物激素的检测方法
比色谱法是最早应用于生长 素分析的光谱法，但由于该法选 择性差，现很少被应用。荧光分 析法是进行痕量、超痕量甚至分 子水平上分析的重要手段，它具 有选择性好、取样少、灵敏度高 以及简便快速等优点，近年来在 植物激素分析中得到广泛应用。
电化学分析法
电化学分析法相对于气相色谱(GC)、液相色 谱(HPLC)、毛细管电泳(CE)、免疫法等分析方法具 有简单、方便和仪器价廉等特点. 在早期的研究中, 植物激素的电化学分析方法主要是针对脱落酸、赤 霉素、玉米素和激动素等植物激素标准品的电化学 行为进行探讨. 通过研究发现, 植物激素存在的本底 溶液的性质和pH 对测定结果会产生很大影响。
色谱法和光谱法
色谱法
光谱法
色谱学是利用物质在不同介质中的 分配原理进行测定的, 包括纸上层析、薄 层层析( TLC)、气相色谱( GC)、高效相 色谱( HPLC) 以及气质联用( GC-M S) 等, 将分离和测定结合起来是色谱法的基本 特点。根据色谱学理论, 某种化合物在一 定色谱条件下的出峰时间(保留时间) 是 固定的, 这是色谱学定性的依据； 而色 谱峰面积(或峰高) 与物质的含量(或总量) 成正比, 这是色谱学定量的基础。
植物激素 的 检测方法
目录
CONTENTS
01
02
03
04
植物 激素 定义
植物 激素 分类
植物 激素 检测 方法
参考 文献
1
植物激素的定义
植物激素的定义
天然植物激素或内源性植物激素, 是植 物自身代谢产生的一类具有高度生物活 性的有机小分子化合物. 它们一般先在 植物的某一部位合成, 然后再转运到其 他部位去发挥作用。植物激素虽是小分 子, 却调控着几乎整个植物生命周期, 如 种子萌发、茎叶伸长、果实成熟以及脱 落等生理过程。植物激素还能感应植物 所处生存环境的外界刺激, 如水分、光 照、温度和损伤等, 并作出相应的反应。