双歧杆菌与乳酸菌筛选培养基
产细菌素双歧杆菌的筛选及其分泌条件研究_尚楠
产细菌素双歧杆菌的筛选及其分泌条件研究尚 楠，王 洋，任发政，李平兰*(中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083)摘 要：以32株我国广西巴马长寿老人源双歧杆菌为材料，以植物乳杆菌PL-2为指示菌，经筛选获得1株具有明显抗菌效果的双歧杆菌L-SN 。
排除有机酸、H 2O 2等干扰因素，经硫酸铵沉淀粗提，蛋白酶敏感性实验后确定其产生的抗菌物质为细菌素。
通过形态学、生理生化以及16S rRNA 序列分析鉴定菌株L-SN 为动物双歧杆菌乳亚种(Bi fi dobacterium animalis subsp . lactis L-SN)。
进一步研究菌株L-SN 产细菌素的生物学特性，确定其最佳分泌细菌素条件为起始pH6.5、培养温度30℃、培养时间28h 。
在此基础上，考察菌株L-SN 所产细菌素的抗菌谱，发现其具有广谱的抗菌效果，尤其对金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌等致病菌有显著的作用，显示出该双歧杆菌的潜在开发应用前景。
关键词：双歧杆菌；筛选；细菌素；分泌特性Screening of Bacteriocin-producing Bi fidobacterium Strain and Culture Coditions for Bacteriocin Secretion SHANG Nan，WANG Yang，REN Fa-zheng，LI Ping-lan *(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing100083, China)Abstract ：Bi fi dobacterium L-SN capable of producing an antimicrobial substance that was effective against Lactobacillus plantarum PL-2 was screened from 32 strains of Bi fi dobacterium isolated from the feces of centenarians in Bama county of Guangxi region. By eliminating the effects of organic acid and H 2O 2, we con fi rmed the antimicrobial role because of bacteriocin. Based on morphological, physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA sequence analysis, the strain L-SN was identi fi ed as Bi fi dobacterium animalis subsp. lactis . We investigated the secretion characteristics of Bi fi dobacterium animalis L-SN and established the optimum incubation conditions for producing bacteriocin: 28 h of culture at 30 ℃ and initial medium pH 6.5. The bacteriocin had a wide spectrum of antibacterial activities against Gram-positive and Gram-negative bacteria, especially against Staphylococcus aureus , Escherichia coli and Listeria monocytogenes showing a potential application prospect.Key words ：Bi fi dobacterium ；screening ；bacteriocin ；secretion characteristics 中图分类号：Q 936 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)23-0170-06doi:10.7506/spkx1002-6630-201323036收稿日期：2013-09-21基金项目：国家自然科学基金项目(31071591)作者简介：尚楠(1990—)，女，硕士研究生，主要从事益生菌的研究。
乳酸菌检验原始记录
乳酸菌检验原始记录（平板计数法）4结果表述1 .若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（m1）样品中菌落总数结果。
2 .若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式（1）计算。
N= --------------------（.+o.ι%）d式中：N一一样品中菌落数；ΣC——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；nι一一第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；n2一一第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；d——稀释因子（第一稀释度）。
3 .若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU,则对稀释度最高的平板进行计数,其他平板可记录为多不可计,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
4 .若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
5 .若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。
6 .若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU-300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于300CFU时，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
计算过程：方法复核日期报告1 .菌落总数小于Ioe）CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。
2 .菌落总数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，采用前2位数字，后面用。
代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五人”原则修约后，采用两位有效数字。
3 .称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CF∪∕m1为单位报告。
报告人报告日期复核人。
婴儿粪便中益生菌的分离筛选及培养
婴儿粪便中益生菌的分离筛选及培养作者：郑丽君吴秀英李洪亮来源：《农产品加工·上》2019年第04期摘要：采用从婴儿粪便中提取具有益生作用的菌种，为下一步的研究开发做乳酸菌种库做积累。
选取河南省洛阳市 5位志愿者进行样品采集，得到5份完全由母乳喂养的婴儿（2月龄）自然排出的粪便样，并分离纯化出5株乳酸菌（RS1， RS2，RS3，RS4，RS5）和5株双歧杆菌（SQ1，SQ2，SQ3，SQ4，SQ5），经鉴定，确定RS3和SQ1具有益生作用的。
结果表明，此2株菌具有较好的耐酸性、胆盐耐受力，对温度敏感，对模拟胃液和肠液具有较强的耐受力，且对大肠杆菌、沙门氏菌具有95%以上的抑菌率，可作为优良的益生菌候选菌种。
关键词：婴儿粪便；乳酸菌；双歧杆菌；分离鉴定中图分类号：S852.6 文献标志码：A doi：10.16693/ki.1671-9646（X）.2019.04.003Isolation and Cultivation of Probiotics from Infant FaecesZHENG Lijun，WU Xiuying，LI Hongliang，SUN Tao（Inner Mongolia Mengniu Dairy Industay（Group）Co.，Ltd，Huhot，Inner Mongolia 011517，China）Abstract：Along with increased recognition of the probiotics， however， the basic mechanism of probiotics hasn't been completely unified up to now，which needs further research and analysis. The purpose of this study was to isolate probiotic strains from the feces of infants，and to lay the foundation for constructing the library of probiotics next step. Five natural excrement samples were collected from full breastfeeding babies（2 months）of Luoyang He'nan，five Lactic acid bacteria （RS1，RS2，RS3，RS4，RS5）and five Bifidobacterium（SQ1，SQ2，SQ3，SQ4，SQ5）were isolated after purification. Furthermore，two strains（RS3，SQ1）were characterized to have probiotic function. The results showed that these two strains were well resistant to acid and bile condition，sensitive to temperature，and highly tolerant to simulated gastric and intestinal fluid. In addition，up to 95% E. Coli and Salmonella were inhibited by these two strains. Based on their phenotypic characteristics，（RS3）and（SQ1）can be excellent candidates of probiotics library.Key words：baby faeces；Lactobacillus；Bifidobacterium，；isolation and identification0 引言益生菌是一類可以对宿主细胞起到有益作用的活性微生物，定植在人体肠道和生殖系统中[1]，分为乳酸菌类、双歧杆菌类、革兰氏阳性双歧杆菌。
双歧杆菌与乳酸菌筛选培养基
BBL培养基双歧杆菌选择性培养基成份蛋白胨酵母粉葡萄糖可溶性淀粉氯化钠5%半胱氨酸西红柿浸出液吐温80肝提取液琼脂蒸馏水MRS培养基乳酸细菌培养基（MRS）蛋白胨 g牛肉膏 g酵母膏 g柠檬酸氢二铵[（NH4）2HC6H5O7] g葡萄糖(C6H12O6·H2O) g吐温80 mL乙酸钠（CH3COONa·3H2O） g磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O） g硫酸镁（MgSO4·7H2O） g硫酸锰（MnSO4·H2O） g琼脂 g蒸馏水 1 000 mLpH ~当乳酸菌生长代谢出乳酸后，会使pH下降而使颜色由绿变为黄绿，也由于pH值降低再加上抗生素及厌氧培养的作用，所以一般的微生物不容易在此培养基上生长，因此十分容易鉴别乳酸菌。
2005-03-10 08:08 消息引用收藏分享奉上一篇实验，以供参考！厌氧菌的分离和培养目前培养厌氧微生物的简便而又有效的技术包括有：厌氧箱培养技术；厌氧罐培养技术；厌氧袋培养技术；亨盖特厌氧滚管技术。
这里介绍的是亨盖特厌氧滚管技术。
亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特（Hungate）于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术。
以后这项技术又经历了几十年的不断改进，从而使亨盖特厌氧技术日趣完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一整套完整技术。
而且多年来的实践已经证明它是研究严格、专性厌氧菌的一种极为有效的技术。
亨盖特厌样滚管培养技术不仅可用于有益厌氧菌如双歧杆菌等的分离、与活菌培养计数，还可以用于有害***菌（如酪酸菌）或病原菌（如肉毒梭状芽孢杆菌）的分离与鉴定。
1材料样品双歧酸奶（液体）、双歧杆菌制剂（固体）。
培养基改良MRS培养基，PTYG 培养基。
仪器和器具亨盖特厌氧滚管装置一套，厌氧管，厌氧瓶，滚管机，定量加样器。
2 流程铜柱除氧→预还原培养基→稀释用液制备→稀释样品→滚管→培养→计数3方法铜柱系统除氧铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质玻璃管。
乳酸菌和双歧杆菌制剂对小鼠肠道菌群失调模型的调节作用
第 １ ６期
２ ０ １ ３年 ６月
科
学
技
术
与
工
程
Ｖｏ １ ． １ ３ Ｎ ｏ ． １ ６ Ｊ ｕ ｎ ．２ ０ １ ３
１ ６ ７ １ —１ ８ １ ５ （ ２ ０ １ ３ ） １ ６ － ４ ４ ９ ７ — ０ ４
Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ａ ｎ ｄ Ｅ ｎ ｇ ｉ ｎ ｅ ｅ ｒ ｉ ｎ ｇ
于选择肠球菌 ； 乳酸杆 菌选择 培养基 （ ＭＲ Ｓ ） 用 于
菌、 乳酸菌、 双 歧杆 菌 的菌 落数 ， 并 以每 克 盲 肠 内容 物 中菌落 数 的常用 对数 表示 。
１ ． ３ ． ４ 双歧杆 菌和 乳酸 杆 菌的调 节治 疗
选择乳酸杆 菌 ； 双歧杆 菌选择 培养 基 （ Ｂ Ｂ Ｌ） 选 择
后， 检测被检菌群 的数量 。结果 不同剂量头孢 曲松钠灌 胃的小 鼠盲肠体 积均有所增 大 ， 模 型组的优势 菌的数量 显著 减少。通
过 口服 乳酸菌和双歧杆菌制剂 ， 可 以适 当的恢复乳酸 菌和双 歧杆 菌的数量 。与对 照组 比较 差异 显著 。说 明实 验成功地 制备 了小 鼠的肠道 菌群 失衡模 型 ， 模 拟长 期应用抗 生素的机 能环境 ， 通过 外源性 的补充 乳酸菌和双 歧杆 菌 ， 对 保持肠道 菌群 的平 衡具有调 节和修 复作用。
关键词
乳酸菌
双歧杆菌
抗 生素 文献标 志码
菌群 失调 Ｂ
中图法分类号
１ １ ３ ７ ８ ． ９ １ ；
哺乳 动 物肠 道 内存 在 数 量 庞 大 、 结 构 复 杂 的 正 常菌 群 ， 对 宿 主 具有 营养 、 免 疫 和 生 物 拮 抗 等 作
双歧杆菌和乳酸菌的一种简便快速计数法
双歧杆菌和乳酸菌的一种简便快速计数法/Lf/微生7l,)双歧杆菌和乳酸菌的一种简便快速计数法(复美军互磊,和微生物:j=海南433)|一3当前,含双歧杆菌和乳酸菌的各种微生态调节剂正在国内外迅速发展''为确保这类制剂的质量,活菌计数极其重要可是,由于这两类细菌都是厌氧菌,在计数方法上需要特殊的设备和较复杂的操作技术,因此现有方法还很不理想.我们根据高层半固体琼脂培养基具有良好厌氧性能的原理在必要的条件试验基础上,提出了一种适用于双歧扦菌和乳酸菌等不产气厌氧菌的简便快速活菌计数法(下称本法),现简报如下.l材料和方法.1l菌种两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumb~dum)A TCC29521菌株(由美国UMDNJ的J.Fu教授喜赠):青春双歧杆菌(B.adolescentis)FTB[菌株r由本实验室自国内纯菌产品中分得):嗜酸乳扦菌(Lactobacillusacidophilus)FALA菌株(由本实验室自国外纯菌胶囊中分离).1.2培养基VL琼脂培养基:按文献【3]方法配制:MRS培养基和LAB培养基:按文献[4】方法配制.2结果2I本法的操作步骤和实验条件操作步骤如图IIImIImIImlhnlImli图I用高层半固体琼脂试曾进行系列稀释l试样:2装有玻璃珠和99mi生理盐水的250ml血浆瓶(预先煮沸除氧):3.9ml高层半固体培养基(未凝前)经试验,本法的最适琼脂谁度为O.3%～O4%:稀释时,用吸管上下轻搅3～5敬{不能产生气泡)培养温度为37℃;培养时间一般为16～24h(不超过36h),稀释度以每管菌落数在30～300为宜/一,I∑】xl0/9计算公式为:活菌数(个/m1)='-一×稀释倍数:用来计数的试管数:N:不同试管中所长的菌落数.上悔市高拉科技发展基垒项目.微生物学专业1995届本科生严二平和孙刚曾参加部分实验1996届硕士研究生.本文于1995年7月26H收到.1期马向前等:双歧杆菌和乳酸苗的一种简便快速计数法63由于在此法中,稀释管和计数管是同一试管,所以计数时应注意两点,一是因每支试管在混匀后都要吸出Ina].最后均为9ml,所以应乘以10/9才能表示每毫升菌液实际含苗落数;二是后稀释度的试管中长出的菌落数实为前一稀释度每毫升的活菌数,所以在乘稀释倍数时切忌出错22本法与其他方法的比较本法与平板厌氧罐培养法通用乳酸菌计数法比较的结果见表1表l本法与其f酉涪的比较注:双歧杆菌用VL琼脂培养基培养.乳酸菌和酸奶样品用MRS培养基培养.从表I可以看出,本法与常规的两种计数方法相比,既简便又快速,而且活菌检出率也高,所以在以下实验中,均采用本法2.3最适培养基的选择对用于双歧杆菌或乳酸菌计数的三种培养基进行比较,结果见表2.表2不同培养基对计数结果的影响表3若干含双歧扦茁和乳酸茁商品中的活菌数微生物37卷从表2可看出,无论对双歧杆菌(ATCC2952I,FTBI),还是对乳酸菌(FALA,酸奶中的乳酸菌),都以LAB的检出率为高,故在以下试验中均采用LAB.2,4各商品中所台双歧杆菌和乳酸菌数的捡测为检验本法的实际效果,我们对市售商品(包括国外产品)进行了活菌检测,结果见表3.3讨论双歧杆菌和乳酸菌的传统计数法主要包括试样分散一系列稀释一滁布或倾注平板一厌氧培养菌落计数五步操作,由此必然带来设备特殊,操作繁琐和耗时费力等缺点本文作者在验证了高层半固体琼脂培养基具有良好厌氧性能的基础上,提出了集稀释(凝固前)和计数(凝固后)于周一试管的设想,使禚菌计数只需试样分散一系列稀释+常规培养一菌菇计数三步经试验,证明它但可省略厌氧培养装置和简化许多操作,而且还有明显缩短培养时间等优点,因此,这是一种有较高应用价值的计虬参考文献…1康自微生态学原理大连:大连出版社,1996131～144【2】周德庆微生物学教程.北京:高等教育出版社,1993200.f]】RasicJLKurmannJABilidobacrmandTheirRole.BirkhauserV eflag,BaselBostonStuttgart ,I983144～158.1O～17Il许率发.李宏建,柴金贞酸奶和乳酸菌饮料加工.北京:中国轻工业出版社,19941～169[5】赵国屏,周德庆微生物学通报.1984,II(I):26--29 ASIMPLERANDFASTERMETH0DFORENUMERA TING BIFIDoBACTERIAANDLA(1lCACIDBACTERIA MaXiangqianZhouDeqing(Depc~tmeniM/cro6/dogvandM砌B/oted'~/ogv.FudanUmters/r),,s蜘21)0433) AbstractAnewmethodiSreportedfortheenumerationofbindobacteriaandlactJcacid bacteriawhichdon'tproducegas.Theadvantagesofthismethodare:(1)simcity——the tIlbewhichcontainshighlayer$emi-solidhastwofunctions:dilutionandenumeration.so theoverelaborateenumerationprocedurebyusingplatecanbeabolished;theins~umentfor anaerobiccultivationandrelatedoperationcanbeomittedbecauseofthegoodanaerobic propertyofhighlayersemi-solidagartube.(2)rapidity-—一山ecountingofbifidobacteria andIactieacidbacteriacanbedoneafterincubationabout16～24hifweu9ethismethod, WhileinthetraditionaIplatemethod,48～72haleneeded.(3)preciseness--countsof bifidobacteriaorlacticacidbacteriaaresimiLartoorhigherthanthatofthetraditionalD1ate method.WehadmeasuredtheviablecountofbifidobacteriaandIactieacidbacteriain commercialprobioticsandyogurtsbyusingthismethod.KeywordsSemi-solidagarmedium,Enumeration,Bifidobacterh~cticacidbacteria。
乳酸菌的制作原理
乳酸菌的制作原理
乳酸菌的制作原理是指利用合适的培养基和条件培养乳酸菌菌株，使其产酸和生长，最终得到活性乳酸菌产品的过程。
乳酸菌的制作过程可以分为以下几个步骤：
1. 菌株的选取：乳酸菌菌株的选择通常基于其对人体有益的特性，如抗菌作用、免疫调节功能等。
常见的乳酸菌菌株包括嗜酸乳杆菌、双歧杆菌等。
2. 培养基的准备：选择合适的培养基是保证乳酸菌生长和繁殖的重要条件。
常用的培养基包括牛乳、乳清、大豆蛋白等，其中添加了一定的碳水化合物作为乳酸菌的能量来源。
3. 接种和培养：将选取的乳酸菌菌株接种到准备好的培养基中，然后在适当的温度和湿度下进行培养。
乳酸菌通常适合在温度为35-40摄氏度的环境中进行培养，而pH值在
4.5-6.5之间是
乳酸菌最适宜的生长条件。
4. 发酵和产酸：培养一段时间后，乳酸菌会开始进行发酵作用，将培养基中的碳水化合物转化为乳酸。
乳酸的积累会降低培养基的pH值，创造出适宜乳酸菌生长的环境。
5. 停止发酵和分离：发酵达到一定程度后，需要停止发酵过程。
通常通过改变培养条件或者降低温度来停止发酵。
然后通过离心、过滤等方法将乳酸菌分离出来。
6. 产品加工和包装：分离出的乳酸菌经过适当的处理和加工，如冻干、稳定剂添加等，最终制成乳酸菌产品。
然后将其进行严格的检验，包装并储存，以保持其活性和稳定性。
总之，乳酸菌的制作原理是通过选择适宜的菌株和培养条件，促使乳酸菌进行发酵作用并产酸，最终得到高活性的乳酸菌产品。
乳酸菌、双歧杆菌检验培养基
改良番茄汁培养基Tomato Juice Agar,Modified 用途：用于食品中乳酸菌总数测定改良MC培养基Chalmers Agar ,Modified 用途：用于食品中乳酸菌总数测定MRS琼脂MRS Agar Base 用途：用于食品中乳酸菌总数测定LBS琼脂LBS agar 用途：用于乳酸菌检测和分离培养BLB培养基BLB Modified 用途：用于双歧杆菌的分离培养改良的M17培养基M17培养基是酸奶中嗜热链球菌计数的重要培养基,它也是从酸奶或牛奶中分离嗜热链球菌的常用培养基。
配方：胰蛋白胨5.0g、鱼蛋白胨5.0 g、牛肉膏5.0 g、酵母浸膏2.5 g、抗坏血酸0.5g、硫酸镁0.25g、甘油10.0g、乳糖3.0g、磷酸二氢钾5.0g、琼脂11.0 g、蒸溜水lL，用NaOH调节pH至6.9，121℃蒸汽灭菌15min。
乳酸杆菌选择性琼脂Lactobacillus Selective Agar用途：用于乳酸杆菌检测和分离培养APT琼脂APT Agar用途：用于乳酸菌分离培养BL琼脂培养基BL Agar Medium 用途：用于双岐杆菌分离培养（GB标准）BBL琼脂培养基BBL Agar Medium 用途：用于双岐杆菌分离培养（GB标准）TPY琼脂培养基TPY Agar Medium 用途：用于双岐杆菌分离培养（GB标准）PYG液体培养基基础PYG Broth Medium Base用途：用于双岐杆菌增菌培养，使用时需加入氯化血红素和维生素K1（GB标准）MC培养基MC Medium 用途：用于食品中乳酸菌检测的肉汤APT Broth用途：用于异质发酵乳酸杆菌和其它需高含量盐酸硫酸胺素菌的培养。
乳酸杆菌肉汤培养基Lactobacillus broth Medium用途：用于乳酸杆菌增菌培养MRS肉汤MRS Broth 用途：用于乳酸菌增菌培养双歧杆菌BS培养基Bifidobacterium BS Medium 用途：用于双歧杆菌分离培养。
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BBL培养基
双歧杆菌选择性培养基成份
蛋白胨15.0g
酵母粉2.0g
葡萄糖20.0g
可溶性淀粉0.5g
氯化钠5.0g
5%半胱氨酸10.0mL
西红柿浸出液400.0mL
吐温80 1.0mL
肝提取液80.0mL
琼脂20.0g
蒸馏水520.0mL
pH7.0
MRS培养基
乳酸细菌培养基（MRS）
蛋白胨10.0 g
牛肉膏10.0 g
酵母膏 5.0 g
柠檬酸氢二铵[（NH4）2HC6H5O7] 2.0 g
葡萄糖(C6H12O6·H2O) 20.0 g
吐温80 1.0 mL
乙酸钠（CH3COONa·3H2O） 5.0 g
磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O） 2.0 g
硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.58 g
硫酸锰（MnSO4·H2O）0.25 g
琼脂18.0 g
蒸馏水 1 000 mL
pH 6.2~6.6
当乳酸菌生长代谢出乳酸后，会使pH下降而使颜色由绿变为黄绿，也由于pH 值降低再加上抗生素及厌氧培养的作用，所以一般的微生物不容易在此培养基上生长，因此十分容易鉴别乳酸菌。
2005-03-10 08:08 消息引用收藏分享
奉上一篇实验，以供参考！
厌氧菌的分离和培养
目前培养厌氧微生物的简便而又有效的技术包括有：厌氧箱培养技术；厌氧罐培养技术；厌氧袋培养技术；亨盖特厌氧滚管技术。
这里介绍的是亨盖特厌氧滚管技术。
亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特（Hungate）于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术。
以后这项技术又经历了几十年的不断改进，从而使亨盖特厌氧技术日趣完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一整套完整技术。
而且多年来的实践已经证明它是研究严格、专性厌氧菌的一种极为有效的技术。
亨盖特厌样滚管培养技术不仅可用于有益厌氧菌如双歧杆菌等的分离、与活菌培养计数，还可以用于有害***菌（如酪酸菌）或病原菌（如肉毒梭状芽孢杆菌）的分离与鉴定。
1材料
1.1 样品
双歧酸奶（液体）、双歧杆菌制剂（固体）。
1.2 培养基
改良MRS培养基，PTYG培养基。
1.3 仪器和器具
亨盖特厌氧滚管装置一套，厌氧管，厌氧瓶，滚管机，定量加样器。
2 流程
铜柱除氧→预还原培养基→稀释用液制备→稀释样品→滚管→培养→计数
3方法
3.1铜柱系统除氧
铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质玻璃管。
此管的大小为40—400mm，两段被加工成漏斗装，外壁绕有加热带，并与变压器相连来控制电压和稳定铜柱的温度。
铜柱两端连接胶管，一端连接气钢瓶，一端连接出气管口。
由于从气钢瓶出来的气体如N2、CO2和H2等通常都含有O2，故当这些气体通过温度约360℃的铜柱时，铜和气体中的微量O2化合生成CuO，铜柱则由明亮的黄色变为黑色。
当向氧化状的铜柱通入H2时，H2与CuO中的氧就结合形成H2O，而CuO又被还原成了铜，铜柱则又呈现明亮的黄色。
此铜柱可以反复使用，并不断起到除氧的目的。
当然H2源也可以由氢气发生器产生。
3.2 预还原培养基及稀释液的制备
制作预还原培养基及稀释液时，先将配制好的培养基和稀释液煮沸驱氧，而后用半定量加样器趁热分装到螺口厌氧试管中，一般琼脂培养基装4.5-5ml，稀释液装9ml，并插入通N2气的长针头以排除O2。
此时可以清楚地看到培养基内加入的氧化还原指示剂—刃天青由蓝到红最后变成无色，说明试管内已成为无氧状态，然后盖上螺口的丁烯胶塞及螺盖，灭菌备用。
3.3 双歧杆菌样品不同稀释度的制备
在无菌条件下准确称取1g固体或用无菌注射器吸取1ml混合均匀的液体样品，而后加入装有预还原生理盐水的厌氧试管中，用震荡器将其震荡均匀，制成10-1稀释液。
用无菌注射器吸取1ml 10-1稀释液至另一支装有9ml生理盐水的试管中，制成10-2稀释液。
按此操作方法依次进行10倍系列稀释至10-7，制成不同浓度的样品稀释液。
通常选10-5、10-6、10-7三个稀释度进行滚管培养计数。
3.4厌氧滚管培养法
将盛有融化的无菌无氧琼脂培养基试管放置于50℃左右的恒温水浴中，用1ml无菌注射器分别吸取10-5、10-6、10-7三个稀释度的稀释液各0.1ml于融化了的琼脂培养基试管中，而后将其平放于盛有冰块的盘中或特制的滚管机上迅速滚动，这样带菌的融化培养基在试管内壁立即凝固成一薄层。
每个稀释度重复3次，而后置于37℃（酸奶样品42℃）恒温培养箱中培养。
一般培养24—48小时后，即可在厌氧管的琼脂层内或表面长出肉眼可见的菌落。
3.5 双歧杆菌活菌（分离）计数
选择分散均匀，数量在几十~几百个菌落的厌氧试管进行活菌计数，即可得出每克或每毫升样品中含有的双歧杆菌数量。
3.6 计算
双歧杆菌的活菌数量cfu/g(ml)样品=0.1ml滚管计数的实际平均值×10×稀释倍数。