细胞筛选 个人整理
细胞筛选个人
细胞筛选个人Document serial number【KKGB-LBS98YT-BS8CB-BSUT-BST108】细胞筛选一嘌呤霉素(一)确定最优筛选浓度当用于筛选特定细胞的嘌呤霉素合适浓度未知时，需进行滴定，或制定针对那种细胞的嘌呤霉素杀菌曲线。
一般而言，嘌呤霉素浓度范围在2-10微克/毫升时是足以杀灭大多数未转染的哺乳动物细胞系。
1.培养待转染（而不是转染后）的细胞。
（筛选的目的是杀灭未转染的细胞）2.取对数生长期的细胞（一般在铺满培养器皿底部的70%~80%时），用新鲜无抗无血清的培养基制成1.5×105个/ml的细胞悬液。
3.向96孔培养板中加细胞悬液，每孔100微升（使每孔细胞数在1.5×104个），然后向每孔加新鲜无抗无血清的培养基适量，培养箱中静置培养过夜。
（这样做是为了保证在固定细胞密度下确定最佳G418药物筛选浓度。
）4.第二天用嘌呤霉素浓度分别为0,2,4,6,8,10微克/毫升的新鲜无抗无血清培养基溶液替换各孔中的旧的培养基。
（每个浓度可用两个复孔，相当于每个浓度测定三次）。
（注意：对于多数细胞种类而言，过量的嘌呤霉素能引起许多非必需的表型的反应。
）5.每日检查细胞活力，根据细胞活力，每三天(即每隔两天)更换含嘌呤霉素的新鲜无抗无血清培养基溶液一次。
如细胞生长过快，可以缩短换液时间（每隔一天）。
6.在正常的实验操作规程时，一种细胞最优筛选浓度的确立时间随细胞的生长率和一般生存时间而定，大概需3到14天。
在所需时间之后，嘌呤霉素的导致所有细胞死亡的最小浓度就是应该用于该细胞和该实验的浓度。
最优浓度为在3-5天内杀死所有细胞的浓度。
(二)转染细胞1.第一天：在60mm培养皿内种植细胞，细胞密度为能使第二天细胞融合能达到70%-80%的密度，CO2孵箱过夜培养。
2.第二天：准备3ml无抗生素无血清培养基，加入Polybrene使其终浓度为8μg/ml。
将已经制备的病毒颗粒0.5ml加至上述培养基，轻吹混匀。
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结4
（一）筛选结果鉴定：（1）基因组DNA提取→PCR鉴定外源基因（2）SHG-44-重组pcDNA3阳性细胞、SHG-44-vect裂解→聚丙烯酰胺凝胶电泳→免疫印迹鉴定P16蛋白表达（Western-blot）。
（3）测定外源性基因对SHG-44细胞增殖的影响①流式细胞仪分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→单细胞悬液→70%酒精固定→裂解细胞→核糖核酸酶消化→碘化丙啶染色→上机分析G1期和G2/M、S期比例。
②细胞生长曲线测定：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→5×104/孔接种24孔培养板→24hr后各自用苔盼蓝染色计数细胞→计算细胞生长抑制百分率。
③软琼脂克隆形成率分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→104 细胞→0.3%低熔点琼脂糖培养→1-2周后计数不可少于50个细胞的克隆数→计算克隆形成率抑制率。
三、注意事项1、优化转染条件（脂质体的用量、DNA密度、细胞密度、脂质体和DNA混合孵育时间）每种细胞和质粒均须进行。
用于转染的核酸应高度纯化。
为避免微生物污染，所用溶液滤过灭菌，以及随后的使用应在无菌条件下，这是细胞惯常的做法。
但是，脂质体以及脂质体/ DNA混合物无需滤过除菌。
2、预备脂质体/DNA混合物必须在无血清下进行。
但是在随后的脂质体/ DNA与被转染细胞共孵育的过程中，血清又是培养基的一部分。
3、在转染之前更换培养基，可提高转染效率，但所用培养基必须37℃预温。
4、脂质体/ DNA混合物应当逐滴加入，尽可能保持一致，从培养皿一边到另一边，边加入边轻摇培养皿，以确保均匀分布和避免局部高浓度。
常见问题和解答：Q：我觉得套环法操作不如96孔办法效率高。
A：也不一定.依据实验目的与要求而定. 如果克隆效率较低的细胞,套环可能更好.用96孔板法,如果不是每孔单个细胞,就不能保证是单克隆.即使是增加到每孔十几个细胞或上百个,一个96孔板也只能培养一万个细胞,十万个细胞就至少需要10个板,100万个细胞就需要100个板,对于转基因细胞筛选或基因打靶,工作量就太大了.且细胞在单独生长条件下,远远不如千万个细胞共同培养活力好. 因此还得看这位朋友使用的是什么细胞,有限细胞系还是无限细胞系,转基因还是非转基因,筛选还是不筛选,需要的单细胞克隆株数量多少?Q：请问一种细胞如果转染了稳定表达的，含neo抗性基因的质粒后，如何用G418筛选？我查看了国内、外50几篇文献后发现没有一个定论的说法。
细胞筛选的基本原理
细胞筛选的基本原理
细胞筛选的基本原理是通过对细胞的表型特征进行筛选和分选，以获取特定细胞种群或个体的目标细胞。
细胞筛选常用的方法包括细胞荧光染色、流式细胞术和细胞排序等。
细胞荧光染色是通过给细胞标记上特定的荧光染料，利用染料与目标细胞结合的选择性，通过荧光显微镜观察并筛选出目标细胞。
这种方法常用于标记特定类型的细胞或细胞表面的特定蛋白质。
流式细胞术是一种通过流式细胞仪分析和分选细胞的方法。
该方法利用细胞在流体中的流动性质，通过细胞在激光束中散射和发射的特性，对细胞进行快速检测和分析。
通过设置特定的参数，可以根据细胞的某些特征（如大小、荧光标记等）将细胞分选出来。
细胞排序是一种利用细胞排序仪将细胞按照某些特定的标准进行分选和分离的方法。
该方法常用于将特定类型的细胞或特定表型的细胞从混合细胞群中分离出来。
细胞排序仪通过对细胞进行高速快速的检测和分析，根据设定的标准将目标细胞进行收集和分离。
细胞筛选的基本原理是通过对细胞的特定特征进行标记或分析，从大量细胞中筛选出目标细胞。
这些方法在生物医学研究和临床诊断中广泛应用，可以帮助科学家们更好地理解细胞的功能和疾病的机制，并且在细胞治疗和药物筛选等领域具有重要的应用价值。
G筛选稳定表达细胞系经验总结图文稿
G筛选稳定表达细胞系经验总结Company number【1089WT-1898YT-1W8CB-9UUT-92108】G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单化鉴定。
有自己的体会也有其他战友遇到的情况,和大家分享.没有总结好的地方，大家补充。
筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3x106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个，按比例1/300孔内应该有几十个，事实上，它们几乎全死光了，只有几个。
加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
稳转细胞系筛选注意事项
稳转细胞系筛选注意事项稳转细胞系筛选是细胞工程和生物医学研究中非常重要的一环。
以下是关于稳定细胞系筛选的50条注意事项，并对每一条进行详细描述：1. 选择合适的细胞系来源：在进行稳转细胞系筛选前，首先要选择合适的细胞系来源，以确保细胞系的稳定性和易转染性。
常用的细胞系来源包括HEK293、CHO、MDCK等。
2. 确定转染条件：在进行稳转细胞系筛选前，需要确定适合的转染条件，包括转染试剂种类、浓度、转染时间和细胞密度等。
3. 标定荧光素酶检测试剂盒：在进行稳转细胞系筛选时，需要使用荧光素酶检测试剂盒来检测稳定转染细胞系的活性。
4. 建立适当的质粒载体：选择适当的质粒载体对稳转细胞系的构建和筛选至关重要。
常用的载体包括pCDNA3.1、pcDNA3.1+、pEGFP-N1等。
5. 筛选适宜的筛选标记物：在进行稳转细胞系筛选前，需要选择适宜的筛选标记物，如抗生素、蛋白荧光标记等。
6. 确定稳定转染细胞系的稳定性：在进行稳定转染细胞系筛选时，需要对转染细胞系的稳定性进行验证，通常采用长期培养和连续传代的方式来确保转染细胞系的稳定性。
7. 选择适合的培养基和培养条件：在进行稳转细胞系筛选时，需要选择适合的培养基和培养条件以促进细胞系的稳定生长和表达。
8. 确定荧光素酶基因的稳定插入：在进行稳转细胞系筛选前，需要确保荧光素酶基因在细胞基因组中的稳定插入，通常采用PCR、Southern blotting等方法来验证。
9. 考虑基因组的稳定性：在进行稳转细胞系筛选前，需要考虑基因组的稳定性，并尽量避免对细胞基因组的不良影响。
10. 确定筛选标准：在进行稳转细胞系筛选前，需要确定筛选标准，如荧光素酶基因活性的阈值、抗生素的最佳浓度等。
11. 使用酶切鉴定：使用酶切鉴定来确保质粒载体的正确构建和稳定转染细胞系的正确筛选。
12. 建立稳定转染细胞系的储备：在进行稳转细胞系筛选后，需要建立稳定转染细胞系的储备，以备后续实验使用。
细胞转染与筛选
细胞转染与筛选方法总结细胞转染：对数期生长的U251细胞经含EDTA的0.25%胰酶消化后，细胞计数，接种于六孔板，每孔种植2×105个细胞，加2ml/孔完全培养基培养过夜，弃去培养基，PBS 洗3次，加入2ml/孔OPTI-MEM培养基。
将3μl FUGENE HD加入94μl空白OPTI-MEM培养基中，混匀，室温放置5min，加入PEGFP-N1或PEGFP-LRIG1质粒体2μg，混匀，室温放置10min，加入六孔板中。
六小时后，将细胞培养基换成DMEM完全培养基。
细胞筛选：转染后36h, 荧光显微镜下观察细胞转染情况，48h后加入G418，其终浓度为1000μg/ml。
放入细胞培养箱继续培养，每两天换液，重新加入G418。
待正常组细胞全部死亡（约15d）将G418浓度调整至500μg/ml，继续培养2周后，长出抗性克隆，挑取单个克隆，在96孔板中扩增，培养2周后，单个克隆已经长满整个孔，将细胞消化后转入6孔板，使用完全培养基继续培养，继而进行其他指标的检测。
细胞转染操作方法转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。
随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。
转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。
电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。
理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。
病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。
但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。
其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。
需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。
细胞筛选 个人整理
细胞筛选一嘌呤霉素(一)确定最优筛选浓度当用于筛选特定细胞的嘌呤霉素合适浓度未知时，需进行滴定，或制定针对那种细胞的嘌呤霉素杀菌曲线。
一般而言，嘌呤霉素浓度范围在2-10微克/毫升时是足以杀灭大多数未转染的哺乳动物细胞系。
1.培养待转染（而不是转染后）的细胞。
（筛选的目的是杀灭未转染的细胞）2.取对数生长期的细胞（一般在铺满培养器皿底部的70%~80%时），用新鲜无抗无血清的培养基制成1.5×105个/ml 的细胞悬液。
3.向96孔培养板中加细胞悬液，每孔100微升（使每孔细胞数在1.5×104个），然后向每孔加新鲜无抗无血清的培养基适量，培养箱中静置培养过夜。
（这样做是为了保证在固定细胞密度下确定最佳G418药物筛选浓度。
）4.第二天用嘌呤霉素浓度分别为0, 2, 4, 6, 8, 10微克/毫升的新鲜无抗无血清培养基溶液替换各孔中的旧的培养基。
（每个浓度可用两个复孔，相当于每个浓度测定三次）。
（注意：对于多数细胞种类而言，过量的嘌呤霉素能引起许多非必需的表型的反应。
）5.每日检查细胞活力，根据细胞活力，每三天( 即每隔两天)更换含嘌呤霉素的新鲜无抗无血清培养基溶液一次。
如细胞生长过快，可以缩短换液时间（每隔一天）。
6.在正常的实验操作规程时，一种细胞最优筛选浓度的确立时间随细胞的生长率和一般生存时间而定，大概需3到14天。
在所需时间之后，嘌呤霉素的导致所有细胞死亡的最小浓度就是应该用于该细胞和该实验的浓度。
最优浓度为在3-5天内杀死所有细胞的浓度。
(二)转染细胞1.第一天：在60mm培养皿内种植细胞，细胞密度为能使第二天细胞融合能达到70%-80%的密度，CO2孵箱过夜培养。
2.第二天：准备3ml无抗生素无血清培养基，加入Polybrene使其终浓度为8μg/ml。
将已经制备的病毒颗粒0.5 ml加至上述培养基，轻吹混匀。
去除60mm培养皿内的旧的培养基，加入含病毒培养基。
基因编辑中的细胞选择和筛选方法
基因编辑中的细胞选择和筛选方法基因编辑是一种革命性的技术，它通过修改细胞或生物体的基因组，改变其遗传特性。
在基因编辑的过程中，选择适合的细胞以及筛选成功编辑的细胞是非常重要的步骤。
本文将介绍基因编辑中的细胞选择和筛选方法。
细胞选择是基因编辑的第一步骤，它确保编辑过程中使用的细胞具有所需的特性。
有多种方法可以进行细胞选择，其中一种常用的方法是利用细胞表面标记物或受体的特异性结合。
例如，可以使用抗体结合特定受体或标记物来选择具有特定受体或标记物表达的细胞。
此外，还可以利用细胞自身的特性进行选择，例如利用荧光标记或基因表达来选择特定表型的细胞。
在基因编辑中，细胞筛选是确定是否成功编辑目标基因的关键步骤。
常见的筛选方法包括荧光筛选、克隆形成筛选和PCR筛选。
荧光筛选是基于荧光蛋白的表达来筛选编辑成功的细胞。
通过将荧光蛋白基因与目标基因连接，编辑成功的细胞将表达荧光蛋白。
通过观察荧光蛋白的表达情况，可以快速筛选出编辑成功的细胞。
克隆形成筛选是一种常用的选择策略，它基于编辑细胞的能力形成稳定的克隆。
通过将编辑细胞单个分离并培养在含有适当营养物和生长因子的培养基中，只有成功编辑的细胞才能通过克隆形成筛选，并形成具有目标基因编辑的克隆。
PCR筛选是一种广泛应用于基因编辑的筛选方法。
通过设计引物，可以扩增出包含目标编辑位点的片段。
成功编辑的细胞会产生特定的PCR产物，而未编辑的细胞则不会产生这样的产物。
通过PCR分析样品，可以快速鉴定出编辑成功的细胞。
除了上述的筛选方法，还有一些先进的技术被应用于细胞筛选，如高通量筛选和单细胞测序。
高通量筛选利用自动化平台和大规模细胞处理，可以更快地筛选大量细胞，并快速发现编辑成功的细胞。
单细胞测序则可以对单个细胞进行基因组分析，帮助确定编辑成功的细胞。
尽管有多种方法可以用于细胞选择和筛选，但选择合适的方法仍然是具有挑战性的。
不同的基因编辑技术和样本类型可能需要不同的筛选方法。
此外，细胞选择和筛选的成功还受到实验条件、细胞类型和编辑效率的影响。
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一嘌呤霉素
(一)确定最优筛选浓度
当用于筛选特定细胞的嘌呤霉素合适浓度未知时，需进行滴定，或制定针对那种细胞的嘌呤霉素杀菌曲线。
一般而言，嘌呤霉素浓度范围在2-10微克/毫升时是足以杀灭大多数未转染的哺乳动物细胞系。
1.培养待转染（而不是转染后）的细胞。
（筛选的目的是杀灭未转染的细胞）
2.取对数生长期的细胞（一般在铺满培养器皿底部的70%~80%时），用新鲜无抗无血清的培养基制成
1.5×105个/ml的细胞悬液。
3.向96孔培养板中加细胞悬液，每孔100微升（使每孔细胞数在
1.5×104个），然后向每孔加新鲜无抗无血清的培养基适量，培养箱中静置培养过夜。
（这样做是为了保证在固定细胞密度下确定最佳G418药物筛选浓度。
）
4.第二天用嘌呤霉素浓度分别为0, 2, 4, 6, 8, 10微克/毫升的新鲜无抗无血清培养基溶液替换各孔中的旧的培养基。
（每个浓度可用两个复孔，相当于每个浓度测定三次）。
（注意：
对于多数细胞种类而言，过量的嘌呤霉素能引起许多非必需的表型的反应。
）
5.每日检查细胞活力，根据细胞活力，每三天(即每隔两天)更换含嘌呤霉素的新鲜无抗无血清培养基溶液一次。
如细胞生长过快，可以缩短换液时间（每隔一天）。
6.在正常的实验操作规程时，一种细胞最优筛选浓度的确立时间随细胞的生长率和一般生存时间而定，大概需3到14天。
在所需时间之后，嘌呤霉素的导
致所有细胞死亡的最小浓度就是应该用于该细胞和该实验的浓度。
最优浓度为在3-5天内杀死所有细胞的浓度。
(二)转染细胞
1.第一天：
在60mm培养皿内种植细胞，细胞密度为能使第二天细胞融合能达到70%-80%的密度，CO2孵箱过夜培养。
2.第二天：
准备3ml无抗生素无血清培养基，加入Polybrene使其终浓度为8μg/ml。
将已经制备的病毒颗粒
0.5ml加至上述培养基，轻吹混匀。
去除60mm培养皿内的旧的培养基，加入含病毒培养基。
（Polybrene能够增加病毒感染的效率，然而，有时候Polybrene对细胞有毒性。
这时，可以用ProtamineSulfate代替Polybrene）
(三)筛选细胞
1.病毒感染后24小时，可以换用含最优浓度puromycin的培养基。
2.如果病毒对细胞有毒性，可以减少感染时间至4-6小时，然后换用新鲜培养基，24-48小时后换加含最优浓度puromycin的培养基。
最好设立一个对照皿，不加病毒液，加入Ploybrene，观察Polybrene是否对细胞有毒性；如果Polybrene没有毒性，还可以加入puromycin，作为puromycin是否有效的对照。
3.以后每隔一天换用新鲜含puromycin的无抗生素无血清培养基，以替换含大量死细胞的培养基。
直到抗性群落能被识别出（一般是在筛选后10到12天）。
4.待抗性细胞长满以后，细胞转入10cm培养皿，同时，留一部分细胞在原来的60mm平皿内。
5.60mm平皿内细胞长满后，收获细胞，在蛋白或mRNA水平鉴定基因敲低效率。
6.10cm培养皿内的细胞待长满后传代，首先每种稳定细胞系冻存4-5支细胞，待基因敲低鉴定清楚后，解冻冻存细胞，进行表型观察分析。
通常情况下，由于慢病毒为复制缺陷型病毒，受感染的细胞不能产生新的病毒，因此从加入病毒颗粒开始，经过5-6次换液后，培养基内已不存在病毒颗粒，可以移至普通细胞培养室内培养研究。
二G418
(一)确定最优筛选浓度
由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
1.G418的配制：
取1gG418溶于1ml1mol/L的HEPES液，加蒸馏水定容至10ml（使G418终浓度为
0.1g/ml ,HEPES终浓度为100mmol/L），过滤消毒，4度保存。
HEPES的化学全称为羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid），分
2.制备筛选培养基：
在100ug/ml～1000ug/ml范围内按0ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、
300ug/ml、400ug/ml，500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml、800ug/ml，900ug/ml、1000ug/ml浓度用无抗无血清培养基稀释G418制成筛选培养基。
心得：
由于特性明确的细胞系G418的最佳用量还是比较稳定的，所以有时候不需要在这么大范围内进行筛选。
比如说你要转染NIH3T3细胞，现在我告诉你我测试过NIH3T3细胞对G418的敏感性，我用的筛选浓度是200 ug/ml。
这时你就可以做150ug/ml、200ug/ml、300ug/ml三个浓度进行筛选。
3.培养待转染（而不是转染后）的细胞。
（筛选的目的是杀灭未转染的细胞）
4.取对数生长期的细胞（一般在铺满培养器皿底部的70%~80%时），用新鲜无抗无血清的培养基制成1×104个/ml的细胞悬液。
5.向96孔培养板中加细胞悬液，每孔100微升（使每孔细胞数在1×103个），然后向每孔加新鲜无抗无血清的培养基适量，培养箱中静置培养。
（这样做是为了保证在固定细胞密度下确定最佳G418药物筛选浓度。
）汇合度：
实际上就是指细胞占培养表面的比例，如果细胞铺满了整个容器，我们就认为它们100%汇合，也就是汇合度100%。
汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%！
6.培养6小时左右开始加药。
加筛选培养基筛选:
吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基适量。
7.换液：
每日检查细胞活力，根据细胞活力和培养基的颜色，每三天(即每隔两天)更换筛选培养基一次。
如细胞生长过快，可以缩短换液时间（每隔一天）。
有死细胞勤换液，可以减少对存活细胞的影响。
8.确定最佳筛选浓度：
在正常的实验操作规程时，一种细胞最优筛选浓度的确立时间随细胞的生长率和一般生存时间而定，在筛选10～14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。
在第一轮就筛选出最佳G418浓度的可能性不大，最有可能的是出现这种情况：
用某一浓度G418的量在筛选14天后还不能杀死细胞，而用下一个梯度的G418的量在10天前就看不到活细胞了。
假如是400ug/ml不能杀死细胞，而800ug/ml在第5天就把所有细胞都杀死了，则可以再用500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml进一步筛选，以确定最佳筛选浓度。
(二)转染细胞
1.第一天：
在60mm培养皿内种植细胞，细胞密度为能使第二天细胞融合能达到70%-80%的密度，CO2孵箱过夜培养。
2.第二天：
准备3ml无抗生素无血清培养基，加入Polybrene，终浓度为8μg/ml。
将已经制备的病毒颗粒
0.5ml加至上述培养基，轻吹混匀。
去除60mm培养皿内的旧的培养基，加入含病毒培养基。
（Polybrene能够增加病毒感染的效率，然而，有时候Polybrene对细胞有毒性。
这时，可以用Protamine Sulfate代替Polybrene）
3.转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近70％汇合时按1：4密度传代，继续培养，待细胞密度增至50％～70％汇合时开始筛选。
(三)筛选细胞
1.加G418：去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养基（无抗无血清）(实际应用时可以比最佳筛选浓度高一级别)。
2.换液：
根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。
当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。
筛选10～14天后，可见有抗性的克隆出现，停药用完全培养基培养。
3.待其逐渐增大后，挑出xx：
制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1个/10ul。
在96孔板中加入培养基150ul/孔，再加入细胞悬液10ul/孔。
待其逐渐增大后转入到48孔中增殖。
4.xx鉴定：
细胞大量扩增后，提取总RNA，做RT-PCR检测目的基因是否存在。
典型贴壁细胞平板密度
生长面积（cm2）大约细胞数培养基容积（ml）
5-6
组织培养皿（φ60mm）
286．6×105
培养板大小
6xx培养板（φ35mm）
12xx培养板φ
22.6mm）
24xx培养板（φ8mm）
9.54
0．53×105
1．3×105
0．6×1051-2
0．5-1
0．25-
0．5。