bcr_abl融合基因及其检测
BCR-ABL融合基因检测——CML诊断“黄金标准”
BCR/ABL融合基因检测——CML诊断“黄金标准”1 1 11对照阴性杂交结果图（2R2G）BCR/ABL（DF）典型阳性图（1R1G2F）BCR/ABL（SF）典型阳性图（1R1G1F）BCR/ABL（ES）典型阳性图（2R1G1F）慢性粒细胞白血病（chronic myelogenous leukemia, CML)是一种起源于造血干细胞的克隆性骨髓增殖性肿瘤，主要累及粒细胞系，表现为持续、进行性外周血白细胞数量增加，分类中出现不同分化阶段的粒细胞，尤其以中性粒细胞增多为主，90%以上患者白血病细胞中有恒定的、特征性的Ph染色体及其分子标志BCR/ABL融合基因。
本病发病率较高，可见于各年龄组，以20～50岁多见，诊断时中位年龄为45～50岁。
CML起病缓慢，初期症状不明显，逐渐出现乏力、低热、盗汗、食欲减退及消瘦等。
其自然病程是由慢性期进展为加速期，最后发展为急变期，急变后患者常在3～5个月内死亡。
CML患者中易位类型绝大多数为t(9;22)(q34;q11)的典型易位，少数有变异易位，包括22号与非9号染色体间的简单变异易位，3条或更多条染色体间的复杂易位（隐匿易位）。
易位形成的Ph染色体是由位于9q34的ABL原癌基因断裂并易位到22q11的断裂点簇集区BCR形成，并在断点处形成BCR/ABL融合基因。
该基因可转录出一个8.5kb的异常mRNA，最终翻译成210KD蛋白质（P210)。
P210具有较强的酪氨酸蛋白激酶活性，可通过多种信号传导途径来活化癌基因和某些细胞因子，最终导致细胞的恶性转化。
典型易位（NCCN Guidelines for patients TM Version 1.2011）BCR/ABL融合基因检测意义：1.CML辅助诊断90~95%CML患者可检测出典型的t(9;22)(q34;q11)易位，约5%的CML患者通过核型分析难以检测到Ph染色体，但可检测出融合基因存在，仍被归为Ph+ CML分类。
白血病融合基因
白血病融合基因Last revision on 21 December 2020bcr/abl融合基因慢性粒细胞白血病（Chronic Myelogenous Leukemia,CML）是一种发生于造血干细胞的血液系统恶性克隆增生性疾病。
在受累的细胞系中可找到Ph标记染色体或（和）bcr/abl基因重排。
基因结构人abl基因位于9号染色体长臂，有1b、1a和2-11共12个外显子。
转录始自1b或1a，形成的两种mRNA长度分别为7kb和6kb，合成的两种蛋白质分子量均约为145，前者定位于细胞膜，而后者主要在细胞核内。
abl主要结构有N 端的肉瘤同源2(srchomology,SH2）、SH1。
SH2结合磷酸化的酪氨酸残基，SH1具有酪氨酸激酶活性。
近C端富含酸性氨基酸残基，可结合DNA。
abl蛋白参与细胞周期调节。
在G0期，abl-Rb蛋白复合物与DNA结合。
在G1→S转变过程中，Rb被磷酸化，abl与之分离，并激活，使RNA聚合酶磷酸化，促进转录，细胞进入S期。
bcr基因位于22号染色体长臂，有23个外显子。
蛋白产物分子量均为160。
bcr蛋白第1-63个氨基酸是二聚体化结构，参与bcr蛋白多聚体的形成。
bcr蛋白参与细胞周期调节，但详细过程还不十分明确。
bcr基因断裂点集中在三个区域：主要(major bcr,M-bcr）、次要（minor bcr,m-bcr）和μ（μ-bcr）区域。
abl基因断裂位于第1或第2内含子。
因断裂点不一，bcr/abl融合基因及其mRNA和蛋白产物呈多样性。
CML的bcr基因断裂点常位于M-bcr，主要是b2a2和b3a2，蛋白分子量为210kb。
bcr基因在ALL中大约2/3为m-BCR位点。
Ph1染色体和bcr/abl融合基因是CML的分子基础，并可作为区分典型CML 和非典型CML的诊断指标。
由于t(9；22)(q34；而产生的费城染色体（Ph）在血液肿瘤中具有重要的诊断和预后意义，出现于90%以上的CML、30%的成人ALL、2%-10%的儿童ALL、以及少数的AML和MM患者。
慢性粒细胞白血病BCR-ABL融合基因检测及其临床意义
加 人 装 有 E D T A K 2作 为 抗 凝 剂 的 试 管 中 ，混 匀 ，将标 本通过使用红细胞裂解液除去血液（骨髓 ）中的红细 胞 ，获得白细胞；用 RNAprep p u re 血 液 总 R N A 提取 试剂盒从上步获得的白细胞沉淀中提取R N A 。将核 酸 荧 光 P C R 混 合 液 分 别 与 等 人 份 的 R T-P C R 酶混 合 ，震荡混匀数秒，3000r/m in 离 心 5s。将上述配制好 的体系置于P C R 管 中 ，然 后 将 提取好的R N A 、DEPCH 20 、对 照 品 、标 准 品 分 别 加 人 对 应 管 内 。反应管置 于 荧 光 P C R 仪 上 ，设 置 循 环 参 数 ：45°C X 20 min — 95°C X 5 m in ，再按 95 °C X 15s— 58 °C X 30 s— 72 °C X 45 s ，循 环 4 5 次 ；单 点 荧 光 检 测 在 58°C 。利用荧光 信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩 增产物量的变化，通 过 C t值和标准曲线的分析对起始 模板进行定量分析。整个实验操作均严格按照操作规 范 进 行 ，同 时 做 内 参 ，阳 性 和 阴 性 对 照 ，均 在 控 。
bcrabl融合基因的表达水平反应了患者体内白血病细胞的负荷量精确检测bcrabl融合基因表达水平对白血病的临床分型诊断个体化治疗方案的制定治疗效果检测缓解后复发风险的估计和预防干细胞移植后残留细胞的检测和早期干预治疗等方面具有重要作用
陕西医学杂志2017年 3 月 第 46卷 第 3 期
白血病融合基因
bcr/abl融合基因慢性粒细胞白血病（Chronic Myelogenous Leukemia,CML）是一种发生于造血干细胞的血液系统恶性克隆增生性疾病。
在受累的细胞系中可找到Ph标记染色体或（和）bcr/abl基因重排。
基因结构人abl基因位于9号染色体长臂，有1b、1a和2-11共12个外显子。
转录始自1b或1a，形成的两种mRNA长度分别为7kb和6kb，合成的两种蛋白质分子量均约为145，前者定位于细胞膜，而后者主要在细胞核内。
abl主要结构有N 端的肉瘤同源2(srchomology,SH2）、SH1。
SH2结合磷酸化的酪氨酸残基，SH1具有酪氨酸激酶活性。
近C端富含酸性氨基酸残基，可结合DNA。
abl蛋白参与细胞周期调节。
在G0期，abl-Rb蛋白复合物与DNA结合。
在G1→S转变过程中，Rb被磷酸化，abl与之分离，并激活，使RNA聚合酶磷酸化，促进转录，细胞进入S期。
bcr基因位于22号染色体长臂，有23个外显子。
蛋白产物分子量均为160。
bcr蛋白第1-63个氨基酸是二聚体化结构，参与bcr蛋白多聚体的形成。
bcr 蛋白参与细胞周期调节，但详细过程还不十分明确。
bcr基因断裂点集中在三个区域：主要(major bcr,M-bcr）、次要（minor bcr,m-bcr）和μ（μ-bcr）区域。
abl基因断裂位于第1或第2内含子。
因断裂点不一，bcr/abl融合基因及其mRNA和蛋白产物呈多样性。
CML的bcr基因断裂点常位于M-bcr，主要是b2a2和b3a2，蛋白分子量为210kb。
bcr基因在ALL中大约2/3为m-BCR位点。
Ph1染色体和bcr/abl融合基因是CML的分子基础，并可作为区分典型CML和非典型CML的诊断指标。
由于t(9；22)(q34；而产生的费城染色体（Ph）在血液肿瘤中具有重要的诊断和预后意义，出现于90%以上的CML、30%的成人ALL、2%-10%的儿童ALL、以及少数的AML和MM患者。
融合基因知识
PML-RARα融合基因是APL患者特异的分子生物学标志，PML-RARα融合基因表达的融合蛋白干扰了正常RARα在核内的分布和对细胞分化的调控，使大量细胞阻滞在早幼细胞阶段，在APL发病机制中起重要作用。其不同的基因异构体分型的预后有明显不同，S型患者缓解前的死亡率及缓解后的复发率均高于L型
bcr/abl融合基因存在于95%以上的慢性粒细胞白血病患者，是CML最重要的分标志，是疾病状态的决定性因素。在一部分成人急性淋巴细胞性白血病（20%－30%）、儿童急性淋巴细胞白血病（2%－10%）和急性粒细胞性白血病的患者中也可表达bcr/abl融合基因。在bcr/abl阳性B-ALL细胞具有较特殊的表型，更多地表达CD34及CD10等细胞表面抗原，CD38阳性率较低，且IgH 检出率也相对较低，而CD10 /CD34 /CD38-是其独特的免疫表型特点。
CBFβ基因断裂点恒定地位于3′端编码区的17个氨基酸处(nt495)，而MYH11基因的断裂点存在5种不同方式，因此根据MYH11断裂点的不同，CBFβ-MYH11转录本有5种不同的剪接方式， 迄今共发现10余种CBFβ/MYH11融合基因转录本，但最常见的为A型(即MYH11基因的断裂点在于nt1921)，占80%，其余均少见。
（二）AML1/ETO融合基因
t(8；21)(q22；q22)主要见于急性粒细胞白血病部分分化型(AML-M2)，亦可发生于急性粒细胞白血病未分化型(AML-M1)、急性粒-单核细胞白血病(AML-M4)及骨髓增生异常综合征(MDS)-RAEB-T中。这种染色体易位导致21号体上AML1基因(acute myeloblastic leukemia one gene)与8号染色体的ETO基因(eight twenty one gene，也称为MTG8基因)的融合形成AML1/ETO融合基因。AML1/ETO融合蛋白是一种转录抑制因子，可抑制正常AML1蛋白介导的功能，改变造血祖细胞自我更新及成熟过程，同时也产生启动异常造血细胞增殖的信号，引起白血病细胞生长。
BCR-ABL酪氨酸激酶区突变检测实验室规范中国专家共识(最全版)
BCR-ABL酪氨酸激酶区突变检测实验室规范中国专家共识（最全版）慢性髓性白血病（CML）及部分急性淋巴细胞白血病（ALL）具有标志性的细胞遗传学异常––t(9;22）（q34;q11）形成的Ph染色体，分子水平形成BCR-ABL融合基因，导致ABL酪氨酸激酶处于持续活化状态。
伊马替尼等ABL酪氨酸激酶抑制剂（TKI）已成为CML一线治疗及Ph+ ALL 治疗方案的重要组成，大部分患者能够获得满意疗效，但是仍有部分患者发生原发或继发耐药，BCR-ABL酪氨酸激酶区突变是耐药的主要机制。
直接测序法是当前临床工作中ABL突变检测的常规方法，其结果是指导临床治疗的主要指标。
为了实现实验室检测标准化，保证结果准确可靠，现根据BCR-ABL酪氨酸激酶区突变室间比对过程暴露的问题制定检测规范。
各实验步骤分述如下。
1．cDNA的制备：根据白细胞计数采集相应的标本量，以保证足量的有核细胞数，建议白细胞计数正常的患者，抽取4 ml骨髓或8 ml外周血标本。
采用EDTA-Na2或枸橼酸钠抗凝标本。
标本应尽量没有凝块，标本抽取后冷藏储存和运送，24 h内进入处理步骤。
建议采用裂解红细胞的方法获得有核细胞，RNA提取可以采用经典的TRIzol法或过柱法。
逆转录过程建议采用高效逆转录酶及随机六聚体引物或商品化的逆转录试剂盒。
高质量的cDNA样本是突变检测扩增的高成功率及突变结果的可重复性和准确性的保证，建议用于突变检测的样本ABL拷贝数>10 000。
此外，BCR-ABL融合基因检测阳性是实施ABL突变检测的前提。
因此，每份检测突变的样本应首先检测BCR-ABL和ABL的拷贝数，以判断标本质量以及是否能够检测突变。
2．扩增及测序：建议采用巢式PCR扩增以针对BCR-ABL检测突变并提高扩增测序的成功率。
首先扩增BCR-ABL，再扩增BCR-ABL上的ABL。
由于P210、P190及P230型BCR-ABL的上游引物不同，因此扩增前需明确患者BCR-ABL类型。
bcr-abl概述
警告=更仔细的检测，
失败=更改治疗方案
部分患者可能通过换药而获益
3个月 6个月 12个月
Ph+细胞≤95%，或BCR-ABL<10%
Ph+细胞≤35%，或BCR-ABL<10% Ph+细胞 0，或BCR-ABL≤1%
Ph+细胞36%～65%
Ph+细胞>95%, 或BCRABL>10%
Ph+细胞>65%, 或BCRABL>10%
BCR-ABL融合基因定量的意义
1、对BCR-ABL融合基因的检测不仅可以对该类病人进行确诊，而且可以根据 定量的结果制定合适的治疗方案 2、在治疗过程中，根据融合基因的定量情况，对疗效进行评价和预后判断 3、在达临床缓解后，对融合基因进行定量检测还可以对复发进行预测，从 而确定干预性治疗的时间，剂量等，使病人获得一个长的无病生存期
CML-如何进行相关实验室检测
QPCR检测：
1,在诊断时; 2, 当患者对治疗有反应时,每三个月检测一次; 达到CCyR后，3年时间里每三个月检测一次， 之后每3-6个月检测一次； 3，若发现在MMR阶段, BCR-ABL上升（1 Log），应在1-3个月内重复QPCR检测.
CML分子学缓解的评估标准
不典型BCR-ABL融合基因检测
不典型BCR-ABL融合基因
• 除了三类典型的BCR-ABL融合基因外，约有1%的CML患者 其断裂点不在以上常见的位点，从而形成不典型BCR-ABL 融合基因亚型，包括e3a2、e6a2、e8a2、e13a2、e19a2、 e14a3、e1a3、e13a3等。
• 由于BCR-ABL常规检测类型中并不包括少见的不典型BCRABL融合基因亚型，因此容易导致PCR检测结果的假阴性， 延误该类病人的诊断和治疗。
Bcr／abl融合基因在慢性粒细胞白血病中的检测方法及意义
Bcr／abl融合基因在慢性粒细胞白血病中的检测方法及意义bcr/abl 融合基因是慢性粒细胞白血病（CML）发病的分子生物学基础，通过灵敏的检验方法检测此基因对CML的诊断、治疗和预测疾病复发等具有重要临床意义。
标签：bcr/abl 融合基因；慢性粒细胞白血病慢性粒细胞白血病（CML）是一种发生在造血干细胞的以粒系细胞慢性增殖为主要特征的恶性克隆性疾病，分子学水平上形成bcr/abl融合基因。
bcr/abl 融合基因的表达水平反映了患者体内白血病细胞的负荷量。
因此，精确检测bcr/abl融合基因的表达水平，对白血病的临床分型诊断、个体化治疗方案的制定、治疗效果监测、缓解后复发风险的估计和预防、干细胞移植后残留细胞的检测和早期干预治疗等方面具有重要的指导作用。
本文对bcr/abl融合基因的检测方法及意义进行综述。
1 Bcr/abl融合基因的检测方法1.1 Southern Blot和Western BlotSouthern 印迹即DNA印迹，可以对bcr/abl融合基因DNA重排进行分子生物学检测。
Southern Blot可使用从外周血或骨髓细胞提取的DNA对bcr/abl融合基因进行检测，不需要保持细胞的活力和所处周期，灵敏度约1～5%，多适用于科研而不是临床诊断[1]。
Western 印迹的原理类似Southern印迹，它是从混合蛋白质中区分并定量分析某种特殊蛋白质的重要手段[2-3]。
但由于不同蛋白质的电转移效率以及单抗的结合能力不同，Western印迹的敏感性和可重复性较差，其敏感性为0.5%～1%[4]。
另外该法操作繁琐、检测时间长，限制了其在临床上的应用。
1.2 常规RT-PCR1988年RT-PCR被首次应用于CML的bcr/abl基因的检测[5]。
在RT-PCR中，应用随机引物或abl特异引物，mRNA被反转录为cDNA，随后应用针对M-bcr 的bl或b2和abl的a2或a3的引物进行扩增，扩增产物在琼脂糖或聚内烯酰胺凝胶电泳中出现特异的条带，在典型的CML病例中，b3a2和b2a2扩增产物条带相差75bp。