胰蛋白酶分离工艺
磁性亲合分离法纯化胰蛋白酶
胰蛋 白酶 （ ｒｐ ｉ， Ｃ３ ２ ．）是一种 蛋 白水解 Ｔｙ ｓ Ｅ ． １ ｎ ４ ４ 酶（ｒｔ ｓ） Ｐｏ ａｅ，具有 蛋 白水解 酶的通性 。胰 蛋 白酶的专 ｅ
一
能共价键 结合亲和 配基 ，还 因具有磁性 ，在 外加磁场 的作用 下，进行快速 运动或分 离， 因而 引起众 多研究 人员 的广泛 关注Ｌ 。 ２ 本文采用 简单、 易行 的方法，制备 出具活性 基团的 高磁性 壳聚 糖微粒 、共价 偶联抑肽 酶 ，应用于胰 蛋 白 酶的亲和纯化 ， 纯化倍 数为 １ ２ 活 性回收率为４ ． ．， ７ １ ２％， 实验结果表 明，高磁性壳聚糖微 粒可用作亲和 吸附剂 。
胰蛋白酶的制备
一、猪胰蛋白酶制备（一）猪胰蛋白酶原的提取∙猪胰脏1.0Kg（新鲜的或杀后立即冷藏的），除去脂肪和结缔组织后，绞碎。
∙加入2倍体积预冷的乙酸酸化水（pH2.5）于10～15℃搅拌提取24小时，四层纱布过滤得乳白色滤液，用2.5M H2SO4调pH至2.5～3.0，放置3～4小时后用折迭滤纸过滤得黄色透明滤液（约1.5升）。
∙加入固体硫酸铵（予先研细），使溶液达0.75饱和度（每升滤液加492克）放置过夜后抽滤（挤压干），得猪胰蛋白酶原粗制品。
（二）胰蛋白酶原激活∙向胰蛋白酶原粗制品滤饼分次加入10倍体积（按饼重计）冷的蒸馏水，使滤饼溶解，得胰蛋白酶原溶液。
将研细的固体无水氯化钙慢慢加入酶原溶液中（滤饼中硫酸铵的含量按饼重的四分之一计），使Ca2+与SO42-结合后，边加边搅拌均匀，边加边搅拌，使溶液中最终仍含有0.1M CaCl2。
2．用5M NaOH调pH至8.0，加入极少量猪胰蛋白酶（约2-5mg）轻轻搅拌，于室温下活化8～10小时，（2～3小时取样一次，并用0.001M HCl稀释），测定酶活性增加的情况。
3．活化完成（比活约3500～4000BAEE单位）后，用2.5M H2SO4调pH至2.5～3.0，抽滤除去CaSO4沉淀。
（三）胰蛋白酶的分离1．将已激活的胰蛋白酶溶液按242克/升加入细粉状固体硫酸铵，使溶液达到0.4饱和度，放置数小时后，抽滤，弃去滤饼。
2．滤液按250克/升加入研细的硫酸铵，使溶液饱度达到0.75，放置数小时，抽滤，弃去滤液。
（四）胰蛋白酶的结晶1．将上述胰蛋白酶滤饼（粗胰蛋白酶）溶解后进行结晶：按每克滤饼溶于1.0ml pH9.0的0.4M硼酸缓冲液的量计加入缓冲液，小心搅拌溶解。
2．用2M NaOH调pH至8.0，注意要小心调节，偏酸不易结晶，偏碱易失活，存放于冰箱。
3．放置数小时后，应出现大量絮状物，溶液逐渐变稠呈胶态，再加入总体积的1/4～1 /5的pH8.0的0.2M硼酸缓冲液，使胶态分散，必要时加入少许胰蛋白酶晶体。
胰蛋白酶的配制、过滤除菌与分装
20ml0.25%胰蛋白酶的配制、过滤除菌与分装（1ml）
准备样品：Try干粉，PBS缓冲液，离心管两个、冻存管20个、盒子一个、枪头1盒、灭菌器、注射器。
准备工作：将离心管、冻存管装载盒子中高温高压灭菌。
配制：
1.称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂50mg溶入离心管PBS（PH到7.2左右）液中。
搅拌混匀，置于4℃内过夜。
2.用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。
3.分装：将除菌之后的胰蛋白酶用移液枪分装到冻存管中，每个冻存管1ml，于-20℃保存以备使用。
实验三 亲和层析法纯化胰蛋白酶
实验三亲和层析法纯化胰蛋白酶（二）姓名：mangogola利用亲和层析（affinity of chromatography）技术纯化胰蛋白酶是一个综合性实验。
本次的实验内容是：以上次分离的鸡卵粘蛋白为配基，偶联到琼脂糖凝胶（sepharose-4B）上，制成鸡卵粘蛋白的亲和吸附剂，然后通过亲和层析方法对粗胰蛋白酶进行纯化。
亲和层析是由吸附层析发展起来的，主要是根据生物分子与特定的固相化配基之间的亲和力而使生物分子得到分离的。
本实验采用的是猪胰蛋白酶的天然抑制剂——鸡卵粘蛋白作为配基的。
在pH7.6-8.0范围内，猪或牛的胰蛋白酶能牢固的吸附在鸡卵粘蛋白亲和吸附剂上，在pH2.5-3.0的条件下，又能从鸡卵粘蛋白亲和吸附剂上洗脱下来。
本实验选用的载体是琼脂糖凝胶（sepharose-4B），使用溴化氰活化载体。
一．实验过程1.溴化氰活化载体将琼脂糖凝胶先用0.5mol/LNaCl溶液洗，再用蒸馏水洗，抽干后称取20g放入250ml 烧杯中。
（以下操作在通风橱中进行。
）加入1.5mol/LNa2CO3150ml，将此烧杯放置在一冰浴中，在电磁搅拌器缓缓搅拌下10min内加入溴化氰——乙腈溶液6ml（含2g溴化氰），而后继续反应10min。
停止反应，将凝胶迅速转移至玻璃烧结漏斗内抽滤，用200ml预冷的蒸馏水淋洗，再用20ml0.2 mol/L，pH9.5的Na2CO3缓冲液洗，抽干后立即偶联。
2.鸡卵粘蛋白的偶联将活化好的凝胶取10g装入小三角瓶中，按1:1的比例加入0.2mol/L，pH9.5的Na2CO3缓冲液和鸡卵粘蛋白溶液，4℃搅拌偶联24h左右。
（注意不要晃动三角瓶，以免凝胶沾在容器壁上，影响偶联量。
）3.上样前凝胶处理偶联结束后，将琼脂糖凝胶转移至玻璃烧结漏斗内，抽去Na2CO3母液并收集记录体积及A280nm。
然后用约100ml0.5mol/LNaCl溶液洗去未被偶联的蛋白（最后一次滤液A280nm 小于0.02即可），收集滤液记录体积及A280nm。
实验六 用反胶束萃取技术提取胰蛋白酶
实验六用反胶束萃取技术提取胰蛋白酶Ⅰ反胶束萃取法提取胰蛋白酶一、实验目的和要求1、加深对反胶束萃取基本原理的理解。
2、了解反胶束萃取的工艺过程及影响因素。
3、了解胰蛋白酶酶话的测定方法和原理。
4、研究pH对萃取率和反胶束率的影响规律，求出适宜的萃取pH值。
二、实验原理反胶束萃取技术是近年来发展的具有开发前景的新型分离技术。
他是由表面活性剂分散在有机溶剂（连续相）中，自发形成纳米级的聚集体，称反胶束（或称反胶团）。
在反胶束溶液中，组成反胶束的表面活性剂定向排列，其非极性尾向外伸入非极性有机溶剂的有机主体中，而极性头向内排列，形成一个极性核，核内充满水溶液，具有溶解蛋白质之类大分子物质的能力。
当含有反胶束的有机溶剂与蛋白质水溶液接触时，蛋白质在静电引力、疏水作用或亲和力等推动作用力下溶入极性核，从而被萃取，然后再控制适当的条件使蛋白质从负载有机相中重新反萃取到水相，达到纯化的目的。
影响反胶束萃取的因素很多，主要有水相溶液的pH、离子强度、表面活性剂和有机溶剂的种类、浓度和温度等。
胰蛋白酶（trypsin）广泛存在于动物的胰中，是由胰腺腺泡细胞合成的肽链内切酶，分Ⅰ型和Ⅱ型两种，其相应前体分别胰蛋白酶原Ⅰ（CTN）和胰蛋白酶原Ⅱ（ATN）。
正常胰液中胰蛋白酶原占总蛋白质含量的19%，CTN 是AT N 的2倍.胰蛋白酶为白色或类白色结晶性粉末，等电点pI = 10.8。
胰蛋白酶是生物化学尤其是蛋白质组学研究的重要试剂。
它具有分解肽链的作用，能消化溶解变性蛋白质，对未变性的蛋白质无作用，因此能使浓痰液、血凝块等消化变稀，易于引流排除，加速创面净化，促进肉芽组织新生，而不损伤正常组织或损伤极微（因血清内有胰蛋白酶抑制物）。
可帮助创伤或手术后伤口愈合，治疗烧伤，具有多种药用价值。
此外，还有抗炎作用。
临床上可用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、瘘管等所产生的局部水肿、血肿、脓肿等。
喷雾吸入，用于治疗呼吸道疾病。
胰蛋白酶存放于密闭，阴凉处保存。
胰蛋白酶的提取
胰蛋白酶的提取原理和方法步骤2010-03-29 14:21:31 来源：易生物实验浏览次数：404 网友评论0 条在动物胰脏中除了存在胰蛋白酶外，还有另外两种与胰蛋白酶性质相似的蛋白水解酶：胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶。
在胰蛋白酶提取过程中，三者彼此很难分开。
需采用合适的方法进一步分离纯化。
关键词：胰蛋白酶trypsin［原理］在动物胰脏中除了存在胰蛋白酶外，还有另外两种与胰蛋白酶性质相似的蛋白水解酶：胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶。
在胰蛋白酶提取过程中，三者彼此很难分开。
需采用合适的方法进一步分离纯化。
从动物胰脏中提取胰蛋白酶，一般是用稀酸将胰腺细胞中含有的胰蛋白酶原提取出来，然后根据等电点沉淀的原理将提取液的pH值调至酸性（pH3.0左右），使大量的酸性蛋白沉淀出来。
经硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原和弹性蛋白酶原沉淀。
沉淀物经水溶解并调至pH8.0，用极少量的胰蛋白酶将胰蛋白酶原激活，同时溶液中的胰凝乳蛋白酶原和弹性蛋白酶原也被激活，三种酶原相互作用过程如下：也可采用从胰脏中提取出胰蛋白酶原，利用合适的提取溶液的pH值促使胰蛋白酶原部分自溶，并通过溶液中Ca2+的环境，使胰蛋白酶原被开始自溶的少量具有活性的胰蛋白酶所激活，转变为具有活性的胰蛋白酶（胰凝乳蛋白酶原及弹性蛋白酶原亦同时被胰蛋白酶激活成有活性的酶）。
激活后的酶溶液再进一步分离纯化。
［试剂和器材］1、试剂（1）pH2.5～3.0乙酸化的水溶液（2）10%（体积分数）乙酸（3）2mol/L硫酸（4）固体硫酸铵（5）无水CaCl2（6）结晶胰蛋白酶（7）25%乙醇溶液(含0.015mol/ＬHCl 、0.05mol/ＬCaCl2)（8）95%（体积分数）乙醇（9）5mol/ＬNaOH（10）丙酮2、器材（1）胰脏（2）组织捣碎机（3）离心机（4）磁力搅拌器（5）透析袋、20目筛网、纱布、水浴锅（6）烧杯、量筒、刻度吸管、试管、玻璃漏斗（7）布氏漏斗、抽滤瓶、温度计、滴管、玻璃搅棒、纱布、pH试纸等［方法和步骤］方法一1、胰蛋白酶原的提取取新鲜胰脏约150g，剥去结缔组织和脂肪，取净重100g，切成碎块，在组织捣碎机中捣碎，并加入2倍体积预冷的pH2.5～3.0 乙酸化水溶液，制成匀浆。
胰蛋白酶的纯化实验报告
一、实验目的1. 学习和掌握胰蛋白酶的纯化方法。
2. 了解胰蛋白酶的理化性质和生物学功能。
3. 培养实验操作技能和数据分析能力。
二、实验原理胰蛋白酶是一种广泛存在于胰腺中的丝氨酸蛋白酶，具有水解蛋白质的能力。
本实验采用硫酸铵盐析法对胰蛋白酶进行纯化，该方法具有操作简便、成本低廉、纯度较高等优点。
三、实验材料1. 胰蛋白酶粗品：由动物胰腺提取。
2. 硫酸铵：分析纯。
3. 氯化钠：分析纯。
4. 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）：0.1 mol/L。
5. 其他试剂：三氯乙酸、硫酸、氢氧化钠等。
四、实验方法1. 胰蛋白酶粗品预处理：将胰蛋白酶粗品溶解于磷酸盐缓冲液（pH 7.0），搅拌使其充分溶解。
2. 盐析：向胰蛋白酶溶液中加入硫酸铵，使其饱和，充分搅拌，室温静置过夜。
3. 沉淀收集：用布氏漏斗抽滤，收集沉淀，并用磷酸盐缓冲液（pH 7.0）洗涤沉淀。
4. 脱盐：将沉淀溶于适量的水，加入适量的三氯乙酸，使蛋白质变性，去除杂质。
5. 纯化：将变性后的蛋白质溶液透析，去除三氯乙酸和硫酸铵。
6. 蛋白质复性：将透析后的蛋白质溶液加入适量的磷酸盐缓冲液（pH7.0），使蛋白质复性。
7. 检测：采用SDS-PAGE方法检测纯化后的胰蛋白酶。
五、实验结果与分析1. 盐析：在胰蛋白酶溶液中加入硫酸铵后，溶液出现白色沉淀，说明胰蛋白酶已经盐析。
2. 沉淀收集：通过抽滤，收集到白色沉淀，表明胰蛋白酶已经沉淀。
3. 脱盐：加入三氯乙酸后，沉淀溶解，表明蛋白质已经变性。
4. 纯化：透析后的蛋白质溶液中，SDS-PAGE电泳结果显示，只有一个明显的条带，说明胰蛋白酶已经纯化。
5. 蛋白质复性：复性后的胰蛋白酶溶液中，SDS-PAGE电泳结果显示，蛋白条带清晰，说明蛋白质已经复性。
六、实验结论本实验采用硫酸铵盐析法对胰蛋白酶进行纯化，成功地将胰蛋白酶从粗品中分离出来，并通过SDS-PAGE电泳检测，证明纯化后的胰蛋白酶具有较高的纯度。
用胰蛋白酶酶解蛋白的基本方法
附件1：用胰蛋白酶酶解蛋白的基本方法基本原理：将蛋白样品还原并烷基化后，用胰蛋白酶把蛋白酶解成肽段，然后用液相色谱/质谱仪对其进行分析。
试剂、生产厂家以及产品编号：使用方法：1.取约1毫克的总蛋白样品放入离心管中，加入1毫升6M的Guanidine(配制在100mMNH4HCO3中，PH 8.0)溶液，得到1mg/mL的蛋白溶液。
2.加入20微升1M的DTT到上述离心管中，震荡混合5秒钟。
3.将上述离心管恒温在37℃条件下反应1小时(以还原蛋白中的双硫键)。
4.加入25微升1M新鲜配制在1M NaOH中的Iodoacetic acid，在避光、室温条件下放置30分钟。
5.将以上样品平均注入两个(每个约注入500mL)具有分离10kDa以下蛋白的Centriconfilter，以12000rpm离心50分钟。
6.在以上离心管中分别加入200mL 0.1M的NH4HCO3，并离心30分钟。
多次重复此操作，以使蛋白样品中的Guanidine含量降到0.5M左右。
7.将以上两个离心管滤层上的蛋白样品，分别、多次加入总量约500mL 0.1M的NH4HCO3溶液以完全溶解，并将这些含有蛋白样品的溶液转移到装有20mL的Trypsin试管中，再加入500mL 0.1M的NH4HCO3溶液。
使试管中液体的总量为1000mL，Trypsin约占总量的1/50。
8.将上述试管恒温在37℃水浴中反应16小时。
9.分别吸取上述样品500mL到两个Centricon filter中，以13400rpm离心50分钟。
这样可以除去多余的Trypsin，终止酶切反应。
(为节省时间，这里的过滤步骤可省略)10.将上述两个离心管下部的滤出液收集到一个离心管中，在35℃下真空干燥浓缩60分钟。
此过程有助于NH4HCO3的分解并挥发，降低样品中盐的浓度。
继续干燥浓缩至样品量到100mL左右。
11.加0.1%的甲酸溶液定量到所需要的样品浓度，并注意观察样品溶液是否澄清。
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1、集落刺激因子（G-CSF ）组成结构：是一种含有二硫键的单链糖蛋白，由175个氨基酸残基组成的单链非糖基化多肽链理化性质：①性状：无色澄明液体②分子量：20000，等电点为5.8～6.6③溶解度：④稳定性：生理作用与临床适应症：作用于造血祖细胞，促进其增殖和分化，其重要作用是刺激粒、单核巨噬细胞成熟，促进成熟细胞向外周血释放，并能促进巨噬细胞及噬酸性细胞的多种功能 ，主要用于预防和治疗肿瘤放疗或化疗后引起的白细胞减少症， 分离纯化工艺：G-CSF 为无菌冻干粉剂，由含有10mM 醋酸钠pH 为4的蛋白溶液经0.2um 过滤后分装冻干。
由含有高效表达人G-CSF 的原核表达系统（E.coli ）经发酵、分离和高度纯化后经冻干制成。
纯化液聚乙二醇浓缩洗脱液柱层析透析液透析缓冲液溶解沉淀沉淀蛋白质盐析洗脱液纤维素柱层析透析液透析缓冲液溶解沉淀饱和度至加入硫酸铵透析液透析滤液超滤浓缩正常成人尿液150ephadexG -%8020000 S DEAE 2、超氧化物歧化酶（SOD ）：组成结构：理化性质：①性状：淡蓝色冻干粉结晶体②分子量：32000左右③溶解度：④稳定性：耐热性强，90℃ 环境120分钟酶活几乎没有损失，100℃环境60分钟酶活保持90%以上；稳定性高，在pH4.0—11.0范围内酶活稳定。
生理作用与临床适应症：是一种能够催化超氧化物通过歧化反应转化为氧气和过氧化氢的酶，是一种重要的抗氧化剂，保护暴露于氧气中的细胞分离纯化工艺：血液预处理,洗涤红细胞和溶血;去除大部分杂蛋白得SOD 粗品;再经柱层析分离得到精品。
猪血经血液预处理、洗涤红细胞、溶血、乙醇一氯仿混合液除去血红蛋白，然后用坟柳043HZO 萃取、丙酮沉淀、55一65℃热变性得到粗酶液。
粗酶液上阴离子DEAE 一Cellulose52交换层析柱、分子筛SephadexG-75柱,最终获得了纯化的铜锌超氧化物歧化酶。
冻干粉末冻干纯化液凝胶层析洗脱液柱柱层析上清液离心透析液磷酸钾缓冲液透析粗提液，后冰浴℃热处理重蒸水溶解沉淀离心加入预冷过的丙酮上清液离心上层液萃取加入上清液离心仿加入预冷过的乙醇，氯溶血液细胞溶胀沉淀离心清洗红细胞去血浆离心匀浆液草酸钾组织匀浆新鲜猪血7552min 1565-5542l a %5.2--SphadexG Cellulose DEAE HPO K C N 3、胰蛋白酶： 组成结构：理化性质：①性状：白色或米黄色结晶性粉末②分子量：24000左右pI10.5③溶解度：溶于水，不溶于乙醇、甘油、氯仿和乙醚④稳定性：最适pH 值7.8～8.5左右pH>9.0不可逆失活 生理作用与临床适应症：本品为蛋白质水解酶，能选择地水解蛋白质中由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，能消化溶解变性蛋质，对未变性的蛋白质无作用，因此，能使脓、痰液、血凝块等分解、变稀，易于引流排除，加速创面净化，促进肉芽组织新生，此外还有抗炎症作用。
临床上用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤、瘘管等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等。
喷雾吸入，用于呼吸道疾病。
也可用于治疗毒蛇咬伤。
还常用于动物细胞培养前对组织的处理。
分离纯化工艺：鸡卵类粘蛋白是一种专一性很强的胰蛋白酶的抑制剂，对猪和牛的胰蛋白酶有很强的抑制作用（而对胰凝乳蛋白酶无抑制作用）。
在pH7.6～8.0的范围内，猪或牛胰蛋白酶能牢固地吸附在鸡卵类粘蛋白上，在 pH2.5～3.0的范围内，能从鸡卵类粘蛋白上被洗脱下来。
因此，采用鸡卵类粘蛋白作为配基制成亲和吸附剂，可以从胰蛋白酶粗品直接获得高纯度的胰蛋白酶。
反应的基本原理如下：纯化液浓缩透析液脱盐透析洗脱液离子交换层析洗脱液凝胶层析浓缩液聚乙二醇浓缩透析液透析洗脱液离子交换层析液F SepharoseF Q Sephacryl F SepharoseF Q ---300鳀鱼粗酶 4、蚓激酶：组成结构：理化性质：①性状：微黄色粉末②分子量：③溶解度：④稳定性：在碱性环境中则相对稳定生理作用与临床适应症：是一种多分子重组口服制剂，与血栓（纤维蛋白）有特殊的亲和力，能够跟踪溶栓，有效溶解微栓，改善微循环，加强心、脑血管侧支循环，开放性修复血管受损内皮细胞，增加血管弹性，改善血管供氧功能，降低血液粘度，降低血小板聚集率，抑制血栓再次形成。
修复血栓发生后周边坏死脑细胞，挽救半暗区。
目前已广泛用于临床，并越来越多地用在心、脑血管、内分泌，呼吸系统等疾病的预防和治疗中心。
分离纯化工艺：（一）鲜蚓清洗 在筐中或地面上将蚯蚓上部泥土层层除去，把蚯蚓铺成薄层，光照10～18小时，让蚯蚓排出污物，用自来水在槽中冲洗二遍，洗去泥和粘浮物，用塑料桶装盛，贮存于冷库中备用； （二）磨浆 用胶体磨将蚯蚓磨成浆液，蚯蚓与按（V ／V ）1∶3～5的比例加入低浓度乙醇的pH5．0～5．3的柠檬酸钠制成匀浆； （三）除渣 用沉降离心机将料液中的粗渣去除，制得上清液； （四）盐析 上清液中按30％饱和浓度加入硫酸铵，搅拌完全溶解后静置1小时； （五）离心 用立式高速离心机经高速离心将料液中细渣去除，制得清液； （六）超滤 取上清液用50，000dt 膜超滤，得超滤液； （七）柱层析分离 将超滤液用泵送到下料桶，混合上样，上样完毕，用洗涤液，洗至流出液呈淡黄色，pH7．0～8．0，略呈碱性，再用洗脱液洗脱，洗脱液变混浊，颜色由黄变红，流出液电导率比洗脱液电导率略高时开始收集，洗脱至料液变清，颜色呈淡橙色，电导率达到洗脱液电导率（不小于9000μs ／cm ）为止； （八）超滤 将收集液倒入贮罐内，开泵，调转速21×12rpm ，调节压力不大于0．1Mpa ，浓缩至1／15，收集料液澄清，澄清完再上柱加去离子水脱盐，至浓缩液呈中性（pH ＝7．0）最后浓缩至1／（16～20）；（九）过滤、除菌 用澄清型、除菌型液净滤板过滤3遍，至滤液澄清，在30万级用0．22um 微孔滤膜进行灭菌过滤； （十）喷干 在干燥塔中，使出口温度控制在80～86℃干燥料液，收集酶粉。
酶粉喷干滤液灭菌过滤滤液超滤脱盐膜分离洗脱液柱层析超滤液膜超滤膜分离上清液去除细渣离心盐析液加硫酸铵盐析上清液去除粗渣离心匀浆乙醇溶解碎片捣碎洗净蚯蚓污物洗净光照，让蚯蚓排出预处理新鲜蚯蚓000dt ，50纯化液疏水色谱层析洗脱液离子交换层析洗脱液凝胶层析上清液离心粗酶液浓缩滤液脱盐超滤上清液℃离心匀浆液匀浆碎片捣碎洗净蚯蚓污物洗净光照，让蚯蚓排出预处理新鲜蚯蚓75k 104 SephadexG D5、细胞色素C ：组成结构：其肽链仅有104个氨基酸，其中赖氨酸含量较高，故为碱性蛋白。
理化性质：①性状：红色冻干粉②分子量：11000-13000③溶解度：易溶于水，在酸性溶液中溶解度更大④等电点10.2-10.8，含铁量0.37-0.43%细胞色素C 对热，酸和碱都比较稳定，但三氯乙酸和乙酸可使之变性，引起部分失活。
生理作用与临床适应症：细胞色素C 与细胞凋亡有关，从线粒体中泄露出的细胞色素C 有诱导细胞凋亡的作用。
本品用于组织缺氧的急救和辅助用药，如一氧化碳中毒、催眠药中毒、新生儿窒息、严重休克缺氧、麻醉及肺部疾病引起的呼吸困难、高山缺氧、脑缺氧、心脏疾病引起的缺氧等。
分离纯化工艺：C HPO N C N C C C CTA SO NH C 精品细胞色素除去氯离子透析洗脱液洗脱树脂吸附细胞色素弱酸性阳离子交换色谱离子交换层析粗品细胞色素除去硫酸根离子透析沉淀红色细胞色素三氯乙酸沉淀盐析滤液加固体硫酸铵盐析洗脱液洗脱沸石吸附细胞色素人造沸石吸附滤液氨水中和提取液酸提取牛心肉末预处理牛心脏4a2-l a %2042)4(%256、肝素钠：组成结构：粘多糖硫酸酯类抗凝血药理化性质：①性状：白色或灰棕色无定性粉末,无臭,无味,有吸湿性②分子量： 12000③溶解度：易溶于水,不溶于乙醇,乙醚,丙酮和苯等有机溶剂④稳定性： 生理作用与临床适应症：治疗各种疾病并发的播散性血管内凝血早期。
2.预防动、静脉血栓和肺栓塞。
3.治疗动、静脉血栓和肺栓塞，缺血性脑卒中，不稳定型心绞痛（减轻症状、预防心肌梗塞），急性心肌梗塞（防止早期再梗塞和梗塞区延展，降低病死率）。
4.人工心肺、腹膜透析或血液透析时作为抗凝血药物。
5.作为溶血栓疗法的维持治疗。
6.用于输血时预防血液凝固及血库保存鲜血等体外抗凝剂分离纯化工艺：一、原料处理：将新鲜的猪肠（或冷冻猪肠自然解冻之后）用清水仔细清洗去除内外污物和外部皮肤脂肪后，绞碎成糜状，并在充分搅拌下，加入等量的水混合后，再加入少许溶度为0.1%的防腐剂混合均匀。
二、酶解提取：先将上述原料在充分搅拌下，用少量稀碱液精细地调节至PH 值为8-9（可用相应的精密PH 试纸进行测定，下同）再加入事先已经绞碎的新鲜胰浆作为酶解剂（所加入的猪胰浆按照原料液实际重量的1%-1.5%为宜），搅匀后，缓慢升温至40度左右，继续搅拌，并保持料液PH=7.5-8，保持液温于37-40度下，酶解3-4小时，然后升温至47-50度，维持PH 值=8.0-8.5，再酌情补加少许猪胰浆后，继续酶解4-5小时，在上述酶解过程中，如果酶解料液的PH 纸复查有所下降之际，就应该及时用少许稀碱液（5%-8%NaOH 溶液）仔细调整。
盐酸调整其PH=5.5-6，然后升温至80度。
在充分搅拌下，加入料液总重量5%左右的精盐（含NaCL ≥95%，钙镁钙盐<0.5%），使之混溶均匀后，再升温90度，保温30分钟，停止搅拌，趁热过滤除去杂质，待滤液冷却至37度时，用稀碱液调整其PH=10.5，精细过滤，滤液回调其PH=9.0-9.5范围内进行离子交换吸附处理。
三、离子交换吸附；先将上述酶解提取液冷却至室温，仔细捞除浮于液面的油脂薄片层，控制升温至45度，停止加热，在搅拌下加入事先预处理好的D-254型树脂已有效的吸附料液中的肝素钠成分，新树脂的用量一般为料液的2.55-3%，用过后的再生树脂应酌情加大其用量，搅拌、吸附处理3个小时后静置过滤，滤液可作为生产治疗冠心病的新药冠心舒的原料。
将上述已经吸附有肝素成分的D-254树脂先用清水充分漂洗，干净后，再用大约一倍的1.2mol/L 氯化钠溶液对洗涤好的D-254树脂进行肝素钠操作：第一次洗脱液为树脂体积的1.5倍左右，大约洗脱4小时，第二次洗脱为树脂体积的0.5倍左右 ，洗脱时间为1小时。
滤干树脂，将洗脱液予以合并。
将上述所得的洗脱液调节到PH=10-11，搅拌30分钟后，静置6小时，然后仔细的析出上层清液，下部沉淀物尽量的抽滤至干。
合并清液和滤液，精细调节PH=6.0-6.5，加入1.5倍量的95%乙醇沉淀过夜，翌日，仔细地烘吸出上层清液，收集下部沉淀物，抽滤至干（母液可套用于调PH 值前的洗脱液中）。