原核诱导表达汇总
IPTG诱导表达
IPTG诱导表达IPTG 诱导表达1.原核表达系统将外源基因引⼊原核细胞，并使其在原核细胞中⾼效地表达、合成基因产物的体系。
2.原核⽣物基因表达特点原核⽣物中功能相关的基因串联在⼀起，形成操纵⼦。
操纵⼦（operon）是⼀组功能上相关，受同⼀调控区控制的基因组成的⼀个遗传单位3.原核基因的表达调控原核⽣物绝⼤多数基因按功能相关性成簇地串联、密集于染⾊体上，共同组成⼀个转录单位──操纵⼦（元），如乳糖（lac）操纵⼦、阿拉伯糖（ara）操纵⼦及⾊氨酸（trp）操纵⼦（元）等。
操纵⼦（元）机制在原核基因调控中具有较普遍的意义。
4.乳糖（lac）操纵⼦（元）调节机制糖操纵⼦4.乳糖操纵⼦的结构5.阻遏蛋⽩的负性调节阻遏蛋⽩的负性调节在没有乳糖存在时，lac操纵⼦（元）处于阻遏状态。
此时，I序列在P启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋⽩与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。
当有乳糖存在时，lac操纵⼦（元）即可被诱导。
在这个操纵⼦（元）体系中，真正的诱导剂并⾮乳糖本⾝。
乳糖进⼊细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。
后者作为⼀种诱导剂分⼦结合阻遏蛋⽩，使蛋⽩构象变化，导致阻遏蛋⽩与O序列解离、发⽣转录。
异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是⼀种作⽤极强的诱导剂，不被细菌代谢⽽⼗分稳定.6.乳糖操纵⼦的结构及阻遏作⽤7.外源基因在原核表达系统中表达的必要条件1.删除内含⼦和5’⾮编码区2.外源基因置于强启动⼦和SD顺序控制下3.维持正确开放阅读框架（ORF）4.mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋⽩质不被降解8.影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素1、启动⼦：建⽴表达载体时，选择强启动⼦2、基因剂量3、核糖体结合位点9.常见原核强启动⼦Plac：受Lac阻遏蛋⽩负调，受IPTG的诱导Ptrp：取⾃⼤肠杆菌⾊氨酸操纵⼦。
Ptac :Lac启动⼦和Trp启动⼦的杂合启动⼦。
P L和P R启动⼦：噬菌体早期左/右向启动⼦，受λ噬菌体CI基因负调控。
原核表达总结
原核表达之目的基因克隆1.了解实验课题对目的蛋白的要求，包括：目的蛋白分子量有多大，表达目的（是蛋白结晶、药剂结合还是制备抗体，不同目的对蛋白要求不同）；是否要其可溶；是胞内表达还是分泌表达，是组成型表达还是诱导型表达；另外，还要了解蛋白表达后需要采用什么样的方式进行纯化，纯化标签有多大，蛋白纯化后是否需要将标签去除（即标签的存在是否会影响蛋白的活性）。
还要对目的蛋白进行稀有密码子（仅限于真核生物基因通过原核表达系统表达时参考，注意稀有密码子的多少，位置5位或3位，稀有密码子是否成串出现等）和可溶性网上预测等。
稀有密码子预测网址：.ru/eng/scripts/01_11.html/~mmaduro/codonusage/usage.htm/RACC//~sumchan/caltor.html原核表达蛋白可溶性预测网址：/综合以上，选取合适的表达载体及宿主菌（做原核表达前对各种载体及宿主菌的充分了解是必须的，建议首先应阅读《默克原核表达宝典》）。
注意：不是所有的标签都是用来纯化蛋白的，有的标签有促进蛋白溶解的作用，有的则是二硫键形成或利于表达后蛋白的检测。
一般我们最常用的是胞内诱导型表达（即蛋白翻译后是存在于细胞内，通过加诱导物的方法来控制表达水平）。
2.搜索要表达的目的基因的序列，根据其编码区序列来设计引物；注意：要注意在引物上加入限制性内切酶识别位点（首先应分析蛋白编码区内是否含有相同的内切酶识别位点），并通过查阅资料看两种酶（上下游引物分别加入酶切位点）是否可以在同一反应体系中起作用，并注意标签序列是在N端还是在C端，若要在C 端保留标签，则需要将下游引物的终止密码子替换掉；若要在引物上引入标签序列，则引物上应加入标签序列碱基（即在上游引物或下游引物处引入His的密码子）；另外，还要注意引物不能造成蛋白的编码框发生改变；1，2步的分析至关重要，只有在完成前两步的工作后才可以进行后续的实验操作。
大肠杆菌的原核表达实验过程结果
大肠杆菌的原核表达实验过程结果
大肠杆菌的原核表达实验一般分为以下几个步骤：
1. 构建表达载体：将待表达的基因克隆到适当的表达载体上,如常用的pET、pGEX等载体中。
2. 转化大肠杆菌：将表达载体转化到大肠杆菌细胞中。
可以通过化学方法、电转化、冷冻复苏、热激转化等方法进行。
3. 诱导表达：在大肠杆菌细胞进行生长至适当时期后,添加适宜浓度的诱导剂,如IPTG等,诱导待表达基因蛋白的合成。
4. 细胞收获和破碎：诱导一定时间后,收获大肠杆菌细胞并进行破碎,以获得待表达蛋白。
5. 蛋白提取：对细胞破碎物进行离心、超滤等步骤,去除残余细胞构成和杂质,得到含有待表达蛋白的上清液。
6. 纯化和分析：将上清液进行分离、纯化、鉴定,以确定表达蛋白相应的分子量、酶活性等。
在以上步骤中,实验者需要进行质控和评估,确认实验步骤是否正确和表达蛋白是否达到预期,以确保实验结果的可靠性和准确性。
原核表达(原理、材料与实验方案)
原核表达（原理、材料与实验方案）一、原理1、E . coli表达系统E . coli是重要的原核表达体系。
在重组基因转化入E . coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。
2、外源基因的诱导表达提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。
常用的有温度诱导和药物诱导。
本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。
不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。
二、材料1、诱导表达材料( 1 ) LB （Luria—Bertani）)培养基酵母膏(Yeast extract) 5g 蛋白胨(Peptone) 10gNaCl 10g 琼脂(Agar) 1-2%蒸馏水(Distilled water) 1000ml pH 7.0适用范围：大肠杆菌( 2 ) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20 ℃保存。
( 3 ) l×凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )50 mmol / L DTT2 % SDS （电泳级）0.1 ％溴酚蓝10 ％甘油2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1 ）酶溶法（1）裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaCI（2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。
（3）10 mg / mL 溶菌酶。
（4）脱氧胆酸。
（5）1 mg / mL DNase I。
2 ）超声破碎法( 1 ) TE 缓冲液。
( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液：100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )100 mmol / L DTT4 %SDS0.2 ％溴酚蓝20 ％甘油三、实验方案1、外源基因的诱导表达( 1 ）用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因。
原核诱导表达
原核诱导表达的标准操作程序（SOP）一．目的：使本实验室工作人员了解诱导表达的操作过程，并能实际动手进行原核诱导表达一系列实验。
二．适用范围：本SOP适用于对新基因克隆的表达，并针对新基因产生的可溶性蛋白。
三．实验原理：E.coli的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。
I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子受阻遏而处于关闭状态。
在启动序列P 上游还有一个代谢物基因激活蛋白（CAP）结合位点。
由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。
在没有乳糖存在时，lac操纵子处于阻遏状态。
此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。
当有乳糖存在时，lac操纵子即可被诱导。
在这个操纵子体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。
乳糖进入细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。
后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。
异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。
四、试剂准备:（一）实验器材的灭菌：枪头的灭菌：1mL，200µL，20µL的枪头放入枪头盒，用报纸包住（2层），放入高压灭菌锅中灭菌，121℃，20min。
80℃烘箱中烘干，常温放置。
螺口管及离心管的灭菌：将螺口管和离心管分别放入铝制饭盒中（盖子要拧松，离心管的管盖打开），放入高压灭菌锅中灭菌，121℃，20min。
80℃烘箱中烘干，常温放置。
50mL离心管的灭菌：将50mL离心管用报纸包住（2层），放入高压灭菌锅中灭菌，121℃，20min。
80℃烘箱中烘干，常温放置。
（二）LB培养基的配制液体LB培养基（1L）：蛋白胨 10g氯化钠 10g酵母提取物 5g 调PH值到7.5，高压灭菌，4℃保存。
原核表达总结
原核表达之目的基因克隆1.了解实验课题对目的蛋白的要求，包括：目的蛋白分子量有多大，表达目的（是蛋白结晶、药剂结合还是制备抗体，不同目的对蛋白要求不同）；是否要其可溶；是胞内表达还是分泌表达，是组成型表达还是诱导型表达；另外，还要了解蛋白表达后需要采用什么样的方式进行纯化，纯化标签有多大，蛋白纯化后是否需要将标签去除（即标签的存在是否会影响蛋白的活性）。
还要对目的蛋白进行稀有密码子（仅限于真核生物基因通过原核表达系统表达时参考，注意稀有密码子的多少，位置5位或3位，稀有密码子是否成串出现等）和可溶性网上预测等。
稀有密码子预测网址：.ru/eng/scripts/01_11.html/~mmaduro/codonusage/usage.htm/RACC//~sumchan/caltor.html原核表达蛋白可溶性预测网址：/综合以上，选取合适的表达载体及宿主菌（做原核表达前对各种载体及宿主菌的充分了解是必须的，建议首先应阅读《默克原核表达宝典》）。
注意：不是所有的标签都是用来纯化蛋白的，有的标签有促进蛋白溶解的作用，有的则是二硫键形成或利于表达后蛋白的检测。
一般我们最常用的是胞内诱导型表达（即蛋白翻译后是存在于细胞内，通过加诱导物的方法来控制表达水平）。
2.搜索要表达的目的基因的序列，根据其编码区序列来设计引物；注意：要注意在引物上加入限制性内切酶识别位点（首先应分析蛋白编码区内是否含有相同的内切酶识别位点），并通过查阅资料看两种酶（上下游引物分别加入酶切位点）是否可以在同一反应体系中起作用，并注意标签序列是在N端还是在C端，若要在C 端保留标签，则需要将下游引物的终止密码子替换掉；若要在引物上引入标签序列，则引物上应加入标签序列碱基（即在上游引物或下游引物处引入His的密码子）；另外，还要注意引物不能造成蛋白的编码框发生改变；1，2步的分析至关重要，只有在完成前两步的工作后才可以进行后续的实验操作。
原核表达及纯化方法
原核表达及纯化-His tag一、原核表达1.挑取一个单菌落（重组表达载体），接种到10mL LB培养基中（注意抗生素抗性）。
37℃，过夜摇菌。
2.次日，将菌液接种到1L LB培养基中（1:50~1:100），继续培养至OD600=0.6时（0.6~0.8），加1×IPTG诱导4h。
（加IPTG前留样（诱导前全菌蛋白）200μL做SDS-PAGE）3.收菌：(1)200μL诱导后全菌；(2)小量表达：收集5mL诱导后全菌，12000g离心1min，裂解沉淀，分别收集上清（可溶性）和沉淀（包涵体）中的蛋白。
大量表达：收集1L诱导后全菌，4℃，4500g离心15~30min。
二、可溶性分析目的：重组蛋白是否表达，是可溶性的还是包涵体形式。
根据这个结果选择纯化方法。
（1）各用30μL 4×SDS Loading buffer重悬诱导前和诱导后的菌体（200μL）；用500μL 1×Binding Buffer重悬菌体（5mL），超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）；4℃，19000g离心15min，分离上清和沉淀；（2）用30μL 4×SDS Loading buffer重悬沉淀；（3）取10μL上清蛋白加10μL 4×SDS Loading buffer；（4）将诱导前全菌，诱导后全菌，上清蛋白和包涵体蛋白煮沸5~10min。
（5）各取10μL 用于SDS-PAGE检测（12%的胶）。
三、小量富集实验样品制备：取5mL诱导全菌，用500μL 1×Binding Buffer（8M Urea）溶解，超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）。
4℃，19000g离心15min，取上清用于富集实验。
（留样做SDS-PAGE）富集：1.装柱：取30μL~50μL体积的Ni柱料（纯柱料）于1.5mL离心管中。
第九章原核表达总结
诱导物： 与阻遏物或激活物结合，从而启动操
纵子转录的效应物，称作该操纵子的诱导物。
乳糖操纵子模型的建立(Jacob and Monod,1961)
Jacquces Monod(1910-67)
Francois Jacob(1920-)
第一节 操纵子学说
操纵基因受一种叫作阻遏蛋白的蛋白质的调控。 当阻遏蛋白结合到操纵基因之上时，乳糖会起诱导作用，它 与阻遏蛋白结合，使之从操纵基因上脱落下来。这时，操纵 基因开启，相邻的结构基因也表现活性，细菌就能分解并利 用乳糖了，这样，乳糖便成了诱导半乳糖苷酶产生的诱导物。
乳糖操纵子 半乳糖操纵子 色氨酸操纵子 阿拉伯糖操纵子 麦芽糖操纵子
乳糖操纵子(lactose operon)
操纵子（operon）：
原核生物中几个功能相关的结构基因成簇串联排列
组成的一个基因表达的协同单位（DNA序列）.
一个操纵子
= 编码序列（2-6） +启动序列+操纵序列+(其他调节序列)
转录衰减机制
前导DNA
RNA聚合酶
前导mRNA
4
UUUU 3’
衰减子结构 就是终止子 可使转录 终止
5’
1
核糖体
2
3
3
UUUU 3’ UUUU……
4
trp 密码子
前导肽
1.当色氨酸浓度高时
前导DNA
Trp合成酶系相关 结构基因被转录
RNA聚合酶 结构基因
前导mRNA
2 3 2 4
5’
核糖体 1
3
分解底物的酶只有在底物存在时才出现。
无乳糖： 有乳糖： 〈５个分子的半乳糖苷酶 ５０００个半乳糖苷酶分子 ／２－３分钟 ５％－１０％（蛋白总量）
原核表达步骤总结
原核表达步骤原核表达先要将基因克隆到原核表达载体上，然后通过转化到JM109或BL21等菌株中，诱导表达蛋白，然后进行蛋白纯化。
本实验方案的前提是，目的基因已克隆到载体，并已转进入JM109菌株中。
一．鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌JM109或BL21中大量表达（一）制样1 . 挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于700ul LB培养基，加入0.7ul Amp （100mg/mL），37o C200r/min摇床培养，过夜活化。
2. 以1：50比例（200ul），将活化的过夜培养物加入10mL LB液体培养基中，加入10uLAmp（100mg/ml），37o C200r/min摇床扩大培养2h-3h，期间取样监控菌液的OD值，控制菌液OD600在0.6-1.0之间，以使大肠杆菌处于最适合表达外源蛋白的生长状态。
(一般3h时，菌液浓度及达到标准，但是不同的基因对菌的影响不同，所以第一次实验时需要确定这个最佳时间)3. 从10ml扩大培养物中取3ml菌液作为不加IPTG的空白对照（CK），其余7ml菌液加入7ul IPTG（储存浓度为0.5mol/l），使IPTG终浓度达到0.5mmol/l。
以200r/min的转速，37o C摇床培养3h。
4. 以5000r/min离心2min收集菌体，倾倒上清，每个离心管收集3ml培养物。
5. 加入1ml dH2O，将管底沉淀用振荡器打散以充分洗涤，8000r/min离心2min，倾倒上清。
6. 重复步骤5。
将离心管中的水倒干净。
（二）菌落SDS-PAGE1. 在收集的菌体中加入200ul 1×SDS PAGE loading buffer(可根据沉淀的量增加或减少loading buffer的量，一般200ul比较合适)。
用漩涡器剧烈震荡，确保将管底沉淀震散。
2. 将样品于100℃恒温加热器上开盖加热10min（Marker也要加热）。
样品凉后，12000r/min离心3min，取每管的上清点样。
IPTG诱导原理原核表达原理及实验步骤
IPTG诱导原理原核表达原理及实验步骤在原核蛋⽩表达体系中，如E.coli（⼤肠杆菌表达系统），外源基因通常需要诱导剂的诱导才能进⾏表达，本⽂详细讲述了常⽤诱导剂IPTG诱导原理，对外源蛋⽩诱导表达原理以及实验步骤。
下载原核⽣物绝⼤多数的基因按功能相关性成簇地排列，且密集于染⾊体上，共同形成⼀个转录单位——操纵⼦，也称基因表达的协同单位。
E.coli的乳糖操纵⼦含Z、Y及A三个结构基因，分别编码β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）、通透酶（permease）和⼄酰基转移酶（transacetylase)；此外还有调控基因：操纵序列O（operator）、启动序列P（promoter）；⽽I(编码Lac阻遏物，Lac repressor)不属于乳糖操纵⼦。
乳糖操纵⼦结构基因IPTG诱导原理Lac阻遏物是⼀种具有4个相同亚基的四级结构蛋⽩，都有⼀个与诱导剂结合的位点。
在没有乳糖存在时，lac操纵⼦（元）处于阻遏状态，Lac阻遏物（即下图中的阻遏蛋⽩）能与操纵基因O 结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，阻⽌了转录的路径，从⽽抑制转录启动。
⽽当有诱导剂（这⾥指IPTG）存在时，诱导剂可与阻遏蛋⽩结合，使阻遏蛋⽩构象发⽣变化，导致阻遏物从操纵基因O上解离下来，RNA聚合酶不再受阻碍，启动⼦P开始发⽣转录，启动反应开始发⽣转录。
在这个操纵⼦（元）体系中，真正的诱导剂并⾮乳糖本⾝。
乳糖进⼊细胞，经β-半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖——即⽣理上的诱导剂。
⽽在实验中，通常选⽤异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）作为诱导剂，IPTG是⼀种作⽤极强的诱导剂，不被细菌代谢⽽⼗分稳定，因此被实验室⼴泛应⽤。
IPTG诱导表达原理图IPTG诱导表达实验⽅法材料试剂和培养基配料LB（Luria—Bertani）培养基酵母膏(Yeast extract) 5g蛋⽩胨(Peptone) 10gNaCl 10g琼脂(Agar) 1-2%蒸馏⽔(Distilled water) 1000ml pH 7.0IPTG 贮备液2g IPTG溶于10mL蒸馏⽔中，0.22µm滤膜过滤除菌，分装成1mL/份，-20℃保存凝胶电泳加样缓冲液50mmol/L Tris-CL(pH6.8) 50mmol/L DTT2%SDS（电泳级）0.1％溴酚蓝10％⽢油原核表达鉴定详细实验步骤1. 表达鉴定第⼀天的任务，常⽤抗性选择根据感受态细胞选择拿到质粒，离⼼（3000r/min；2min)在质粒中加⼊TE【使质粒最终加⼊到110µL感受态细胞中的量为80-100ng，据此确定加⼊TE的量】，⼀般为(1µg质粒加20µLTE；2µg质粒加50µLTE；5µg质粒加100µL TE)将质粒与TE混匀，吸取2µL混液与感受态细胞混匀将感受态细胞放⼊冰箱（4℃）中，30min取出后⽴即放⼊⽔浴锅中（42℃），热激90s,再次放⼊冰箱（4℃）中，3min拿出后取200µL的LB液体培养基加⼊到已转⼊质粒的感受态细胞中放⼊摇床（37℃; 195r) 中, 30nim⾄60min; (最佳45min)取出离⼼（3000r/min；2min)去掉200µL的上清，留100µL左右上清悬浮沉淀，吸取50µL悬液涂平板，【先将对应抗性的平板放⼊培养箱（37℃）中预热20min】把平板放⼊培养箱（37℃），过夜（12h⾄16h）2. 表达鉴定第⼆天的任务，注意Pcold表达载体的表达温度每个平板挑取单菌落⾄4⽀对应抗性的LB(4ml)试管中，编号为“0”“1”“2”“3”将试管放⼊摇床（37℃；195r) 中，【单抗3h左右；双抗4h左右；刚开始⽤可见分光光度计测OD值；熟练后可⽬测（背光下，以试管中的枪头为例，刚刚看不见枪头即可）】，测OD值（0.6⾄0.8）从“0”号管中取700µL悬液加⼊到100µL（C=80%）的保种⽢油中，震匀，放⼊冰箱（-20℃）冻存在每组菌的“1”“2”“3”号试管中分别加⼊2µL的IPTG【终浓度0.5mM最适，可根据⽇后表达摸索】视不同的载体选择适合的表达环境【PET/PGEX：15℃表达过夜；25℃表达6h；37℃表达3h ⾄4h（4⽀试管，“0”“1”号试管15℃表达过夜；“2”“3”试管37℃表达3h⾄4h）。
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原核诱导表达的标准操作程序（SOP）一．目的：使本实验室工作人员了解诱导表达的操作过程，并能实际动手进行原核诱导表达一系列实验。
二．适用范围：本SOP适用于对新基因克隆的表达，并针对新基因产生的可溶性蛋白。
三．实验原理：E.coli的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。
I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子受阻遏而处于关闭状态。
在启动序列P上游还有一个代谢物基因激活蛋白（CAP）结合位点。
由P序列、O序列和CAP 结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。
在没有乳糖存在时，lac操纵子处于阻遏状态。
此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P 序列结合，抑制转录起动。
当有乳糖存在时，lac操纵子即可被诱导。
在这个操纵子体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。
乳糖进入细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。
后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。
异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。
四、试剂准备:（一）实验器材的灭菌：枪头的灭菌：1mL，200µL，20µL的枪头放入枪头盒，用报纸包住（2层），放入高压灭菌锅中灭菌，121℃，20min。
80℃烘箱中烘干，常温放置。
螺口管及离心管的灭菌：将螺口管和离心管分别放入铝制饭盒中（盖子要拧松，离心管的管盖打开），放入高压灭菌锅中灭菌，121℃，20min。
80℃烘箱中烘干，常温放置。
50mL离心管的灭菌：将50mL离心管用报纸包住（2层），放入高压灭菌锅中灭菌，121℃，20min。
80℃烘箱中烘干，常温放置。
（二）LB培养基的配制液体LB培养基（1L）：蛋白胨10g氯化钠10g酵母提取物5g 调PH值到7.5，高压灭菌，4℃保存。
固体LB培养基（1L）：蛋白胨10g氯化钠10g酵母提取物5g琼脂粉15g高压灭菌，不烫手的情况下加入抗性，抗性：培养基=1：1000（氨苄，卡那通常浓度），混匀。
马上在无菌操作台中倒平板，并开大风吹干。
用封口膜封住，倒置放于4℃保存。
（三）1M IPTG的配制：经过计算，10g IPTG可以配42ml的1M IPTG。
买来的粉末状的IPTG一般全部配成1M IPTG。
1、无菌操作台紫外线照射，后通风。
2、用少量去离子水将IPTG溶解完全，并定容。
3、在无菌操作台中，用0.22µm的滤器将配好的IPTG滤入灭菌后的1.5ml离心管中，过滤除菌，-20℃保存。
注意事项：在用滤器将IPTG滤入离心管时，先用针头吸IPTG，然后将枪头拔掉，排出气体，滤头加入IPTG液，在使针管与滤器相连，保证整个装置无气体进入。
滤的过程中，手不能碰滤头。
（四）3×SDS-PAGE loading buffer的配制：1．将除BPB以外的药品完全溶解。
SDS常温下很难溶解，可以在37℃水浴溶解。
完全溶解后，再加入BPB，进行溶解。
2．把溶好的buffer分装到1.5ml的离心管中，1ml/管，常温放置。
3．使用前，每管加入30µL巯基乙醇。
注意事项：巯基乙醇为危险品，加入的过程在通风橱中完成，并且带好手套。
（五）10×PBS的配制：用去离子水将以上药品进行溶解。
（溶解的非常慢，可能需要过夜）调PH值到7.2，用0.4µm的滤膜过滤。
常温保存。
工作时用的是1×PBS。
1．用200ml去离子水将Tris溶解。
2．用浓盐酸调PH值到8.8。
3．调好PH的Tris-Hcl定容到250ml。
4．0.4µm的滤膜过滤，常温保存。
注意事项：Tris的缓冲能力很强，调PH值时，费些时间，但不要调过。
1．用200ml去离子水将Tris溶解。
2．用浓盐酸调PH值到6.83．调好PH的Tris-Hcl定容到250ml。
4．0.4µm的滤膜过滤，常温保存。
1．把药品用去离子水溶解后定容到250ml。
2．用滤纸过滤，放在棕色瓶子中，4℃保存。
注意事项：两种药品有毒性，配制过程要带手套和口罩。
（九）10%SDS的配制：1．1g SDS加入10ml去离子水进行溶解。
2．分装到1.5ml离心管中，-20℃保存。
（十）10%过硫酸铵的配制：1．1g 过硫酸铵加入10ml去离子水进行溶解。
2．分装到1.5ml离心管中，-20℃保存。
（十一）5×SDS-PAGE电泳缓冲液的配制：将以上药品用去离子水溶解后定容到1L，常温保存。
工作时用的是1×SDS-PAGE 电泳缓冲液。
（十二）考马斯亮蓝R-250染色液的配制：考马斯亮蓝R-250染色液1L1．往1g考马斯亮蓝R-250中加入250ml异丙醇，在磁力搅拌器上搅拌六小时以上。
2．加入650ml去离子水，磁力搅拌器搅拌过夜。
3．再加入100ml冰醋酸进行溶解，磁力搅拌器搅拌。
4．在通风橱内用滤纸进行过滤。
常温保存。
染色液只能反复用两次。
注意事项：在磁力搅拌器上搅拌时，要把容器封口。
（十三）脱色液的配制：常温保存。
四．实验步骤：（一）：质粒的转化1．使用无菌操作台之前先用75%的酒精擦拭，然后将灭菌的培养基以及所有要用到的器具放到超净台上，在开紫外照射30min左右。
操作之前，关掉紫外，打开通风橱，将手用酒精擦拭后开始操作。
2．从-80℃的冰箱中取出表达菌（BL21）的感受态细胞（每管100µL），在-80℃冰水中融化。
3．载体（PET32a等）与基因片段的连接后质粒1µL，缓慢的加入到100µL BL21感受态中，冰置15min。
（无菌操作）3．42℃下热激90s，随后在冰水中冰置5min。
4．涂板：先将涂布棒用酒精棉球擦，然后用酒精灯火焰烧，放置等它凉却。
把处理后的感受态点在含有抗性的固体培养基（氨苄或卡那等）上。
用冷却的涂布棒进行涂布，左手把该盖拿起，小指轻轻转动培养基，右手来涂，涂到培养基表面快干。
（无菌操作）5．放在37℃培养箱中，倒置培养过夜。
注意事项：1．质粒的转化时，质粒是冻在-20℃的冰箱中，等它完全化了在进行吸取，往感受态中加入质粒时，一定要缓慢，因为感受态非常脆弱，防止感受态受伤。
2．质粒的转化时，热激的时间90s，一定要控制好时间。
3．质粒的转化时，涂布棒在涂布前，一定要晾凉涂布棒。
防止感受态被烫死，或固体培养基的损坏。
（二）：挑菌与接菌：1．无菌操作台紫外线照射，后通风。
将转化后的平板取出。
2．在无菌操作台中，把消毒后的螺口管（一般一个基因取四个螺口管，进行平行实验）取出，在酒精灯的外焰上灼烧螺口管管口。
3．灭菌后的LB培养基从冰箱中取出，在酒精灯的外焰上烧一下培养基瓶口。
吸取LB 培养基（一般5.5mL）加入螺口管中，后加入抗性（氨苄霉素、卡那等）。
氨苄霉素（卡那）：LB培养基=1:1000（5.5µL），抗性由载体决定。
4．镊子用酒精棉球擦拭，并在酒精灯的外焰上灼烧，将镊子晾凉。
用晾凉的镊子，夹取20µL小枪头，在转化后的平板上挑取单菌落，扔到培养基中。
5．接好菌的螺口管，进行摇菌。
37℃，180rpm。
摇到菌的对数期（OD600值0.4-0.6），时间大概2-3h。
可以模糊看到手即可。
（注意不要摇过）6．用完的平板用封口膜封住，倒置放于4℃保存。
7．若直接用菌液进行接菌，接菌比例为，菌液：LB培养基=1：100。
注意事项：1．接菌吸培养基时，把放置培养基的三角瓶倾斜才吸取培养基，移液枪尽量不要插进三角瓶中。
2．接菌时一定要加入抗性，挑菌落时，要挑单个的菌落，且不要把培养基也扣起来。
3．摇菌不要过了它的对数期，2小时后随时注意其生长状态。
（三）小量保菌：1．无菌操作台紫外线照射，后通风。
2．将摇到标准OD值的菌液进行小量保菌，先在酒精灯的外焰上灼烧螺口管管口。
3．保菌：从灭菌的饭盒中取出4个1.5ml的灭菌的离心管，加入50µL的灭菌后的80%的甘油，并分别加入相应的350µL菌液。
一个基因的四个平行实验菌都要进行保菌。
（若不保菌，实验不能进行重复，只能从头做）4．标清保菌的类别，名称，时间，如“BL21 PET32a V A V 1号2010.7.14”,其中的1号是平行对照中它排几号。
5．混匀，-20℃保存。
注意事项：1．在小量保菌中，一个基因的四个平行对照都要保菌，否则得重新摸条件。
2．在小量保菌中，菌液与甘油一定要混匀在保存，否则菌会被冻死。
（四）蛋白诱导表达条件摸索1．无菌操作台紫外线照射，后通风。
2．小量保菌后的四个平行实验组，分别加入不同终浓度的IPTG，在不同的温度条件下进行诱导（如下图）：（五）小量收菌1．将诱导完成的四个平行实验组菌液，分别取出1mL，对应装于4个不同的1.5ml离心管中并做好标记。
剩余的平行实验组菌液放入4℃保存。
2．离心7000rpm，2min，使菌沉淀。
3．把上层培养基倒掉，用1ml 1×PBS把表达菌重悬，再次离心7000rpm，2min，使菌沉淀。
4．把上层1×PBS倒掉，再次离心同步骤3。
5．用80µL 1×PBS把表达菌体重悬。
6．在四个平行的重悬液中，分别加入80µL 3×SDS-PAGE loading buffer。
（把3×SDS-PAGE loading buffer当成2×SDS-PAGE loading buffer用）7．煮样8min。
（打开锅盖煮）8．离心13000rpm,10min。
吸上清。
9．进行SDS-PAGE电泳。
注意事项：在煮样时要打开锅盖煮，防止小样进水，若样进水，则不能再用。
（六）SDS-PAGE胶的配制1．分离胶的配制（1）找出配套的胶板，用擦镜纸擦干净，并固定在配胶器上。
随后用去离子水试漏。
（2）若胶板不漏水，就进行分离胶的配制。
依次将水、30%丙烯酰胺、1.5M Tris-Hcl（PH 8.8）、10%SDS、10%过硫酸铵加到干净的小烧杯中（如下图），混匀。
（1mm的胶板，一般配一块胶用5ml。
所配的胶浓度一般为12%，但浓度也要视情况而定。
蛋白越小，胶的浓度越大。
）（3）将胶板中的水倒掉，并用滤纸吸干水分（不要将滤纸塞到胶板底部）。
（4）小烧杯中再加入TEMED，混匀。
（TEMED可使胶凝固，所以最后加）（5）灌胶：混匀的分离胶沿着胶板边缘轻轻灌下，防止产生气泡。
（6）用水将分离胶压平。
（用水灌满，同时加水时要缓慢加入，防止把胶吹起）2．浓缩胶的配制（1）待分离胶与水中间形成明显的横线，即分离胶凝固。