糖化酶活力测定
葡萄糖淀粉酶的活力测定
葡萄糖淀粉酶的活力测定一．原理：葡萄糖淀粉酶（糖化酶）在一定的条件下能水解生成葡萄糖，葡萄糖的醛基被弱氧化剂次碘酸钠氧化。
过量的碘用硫代硫酸钠滴定。
从碘的减少量计算葡萄糖的量，从而计算酶活力。
二．试剂与材料：1.2%可溶性淀粉液：称取可溶性淀粉2g，以少许蒸馏水调匀，侵入80ml的沸水中，继续煮至透明状，冷却后，加水定容至100ml2.PH4.6，0.1mol/L醋酸缓冲液：0.1mol/L苏酸溶液与0.1mol/L醋酸钠溶液等体积混合。
3.0.1mol/L碘液：称取36g碘化钾，溶于100ml蒸馏水中，加入14g碘，逐渐溶解，加3滴盐酸，定容至1000ml4.0.1mol/L氢氧化钠溶液：称取4g NAOH，用水溶解，定容至1000ml5.1mol/L硫酸溶液。
量取56ml浓硫酸，倒入适量水中，用水稀释至1000ml6.0.05mol/L硫代硫酸钠溶液：称取25g硫代硫酸钠，0.2g碳酸钠，溶于1000ml煮沸冷却后的水中，存于棕色瓶。
放置一周后，用0.1mol/L重络酸钾滴定。
7.0.5%淀粉指示剂：称取0.5g可溶性淀粉用少量水调匀。
倒入80ml沸水中，继续煮至透明，冷却后，定溶100ml三．操作方法：1.吸取2%可溶性淀粉液10ml，加入PH4.6醋酸缓冲液5ml，混匀后于40℃水浴中预热10min2.加入酶液1ml，于40℃，反应10min。
反应结束时，沸水中煮10min，以终止酶反应。
3.吸取上述反应液5ml于碘量瓶中，加入0.1mol/L碘液5ml及0.1mol/L NAOH溶液5ml，混匀，于室温下暗处放置15min，加入2mol/L硫酸酸化。
4.以0.5%可溶性淀粉液作为指示剂，用0.05mol/L硫代硫酸钠滴定至蓝色消失为终点。
记录0.05mol/L硫代硫酸钠消耗的毫升数（A），以及空白试验消耗的硫代硫酸钠毫升数。
四．结果计算：在上述条件下，每小时催化淀粉水解生成1mg葡萄糖的酶量定义为一个酶力单位。
测定糖化酶活性的方法
酶活力单位（U/ml）=（B－A）×10-3 ×（N/2）× （8/5）×106×2 ×（1/10） 式中符号与前式相同， 其中： 10-3—— ml换算成L。 106—— μ mol换算成mol。
反应试剂配制方法
（1）2%可溶性淀粉 称取可溶性淀粉2g（预先100℃烘干约2h至恒重），用少量 蒸馏水调匀，徐徐倾入巳沸的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却定容至 l00ml，此溶液需当天配制。 （2）0.2mol/L pH4.6 醋酸钠缓冲液 称取醋酸钠(CH3COONa·3H2O)2.722g，用蒸馏水溶解，定容 至100m1。冰醋酸(CH3COOH) 1.17m1定容至100ml。分别取醋酸钠49ml 和醋酸51ml混匀。缓冲液以酸度计或精密试纸校正pH。 （3）0.1mol/L碘液 称取13g碘及35g碘化钾，溶于100mL水中，稀释定容至1000mL， 摇匀，贮存于棕色瓶中。
操作步骤
1. 取7个带塞的试管（其中3个测今年批次的酶 活、另外3个测去年批次的酶活、1个作空白 对照），分别吸取2%可溶性淀粉液5ml，加 入pH4.6醋酸缓冲液2.5ml，混匀后于40 ℃水 浴中预热10min。 2. 加入酶液0.5ml（空白对照组以煮沸失活的酶 液代替）于40 ℃，反应10min；反应结束时， 立即于沸水浴加热5min使酶失活(此时应将试 管的塞子打开）。
糖化酶是由一系列微生物分泌的具有外切酶活性的胞外 酶。糖化酶的主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的 非还原性末端（整个碳链只有一个还原端，与之相对的都 是非还原端）依次水解a- 1,4 糖苷键, 切下一个个葡萄糖 单元，并像β- 淀粉酶一样, 使水解下来的葡萄糖发生构型 变化，形成β- D- 葡萄糖。对于支链淀粉，当遇到分支点 时，它也可以水解a- 1,6 糖苷键，由此将支链淀粉全部水 解成葡萄糖。糖化酶也能微弱水解a- 1,3 连接的碳链，但 水解a- 1,4 糖苷键的速度最快，它一般都能将淀粉百分之 百地水解生成葡萄糖。
糖化酶发酵、提取及活力测定
SHANDONGＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ发酵工艺学实验报告糖化酶发酵、提取及活力测定实验学院：生命科学学院专业班级：生物工程1602项目组成员：刘松良、张金中、蔡超、何建雨、周钻钻指导教师：王丽娟2018年6月糖化酶发酵、提取及活力测定实验何健雨王丽娟生命科学学院生工1602班1. 实验目的(1)了解黑曲霉生长特性,学习糖化酶发酵工艺；(2)了解黑曲霉生长特性,学习糖化酶发酵工艺。
(3)学习并掌握糖化酶活力测定方法2. 实验原理葡萄糖淀粉酶( glucoamylase,EC.3.3.13)系统名为淀粉a-1,4-葡聚糖葡萄糖水解酶,俗称糖化酶,是国内酶制剂中产量最大的品种。
糖化酶对淀粉分子的作用是从非还原性末端切开a-1,4键,也能切开a-1,3键和a-1,6键,生成葡萄糖。
生产糖化酶常用的菌种是黑曲霉,将活化好的黑曲霉制成孢子悬浮液,转接接到三角瓶直接进行发酵,或转接到三角瓶作为种子,进行一次扩大培养后,再转接到发酵罐进行糖化酶发酵。
黑曲霉糖化酶是一种胞外酶。
首先采用过滤法将菌体等杂质除去,继而对滤液进行浓缩,最后用有机溶剂如乙醇将酶沉淀出来,对沉淀物进行干燥,加工成成品。
糖化酶有催化淀粉水解的作用,能从淀粉分子非还原性末端开始,分解a-1,4键,生成葡萄糖。
葡萄糖分子中含有的醛基能被次碘酸钠氧化,过量的次碘酸钠钠,酸化后析出碘,再用硫代硫酸钠标准溶液标定,计算酶活力。
酶活力定义:1g固体酶粉(或1mL液体酶),于559CpH4.6的条件下,1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖,即为一个酶活力单位,以U/mL(U/g)表示。
3. 实验材料优质大麦芽粉、大米粉、酒花；耐高温-α淀粉酶、糖化酶；乳酸（磷酸）；0.025 mol/L碘液；温度计（100℃）、恒温水浴锅、糖度计、布氏漏斗、分析天平、纱布、玻璃仪器。
4. 方法步骤待测酶液的制备:称取酶粉1-2g,精确至0.0002g,先用少量的乙酸缓冲液溶解,并用玻璃棒捣研,将上请液小心倾入容量瓶中。
实验十四糖化酶活力的测定
实验十四糖化酶活力的测定一、实验目的1、学习糖化型淀粉酶(或液体曲)酶活力的测定方法。
2、了解糖化型淀粉酶活力大小对工艺生产的指导意义。
二、实验原理糖化型淀粉酶可催化淀粉水解生成葡萄糖。
本实验在一定条件下用一定量的糖化型淀粉酶作用于淀粉，然后用碘量法测定所生成的葡萄糖的含量来计算淀粉酶的活力。
碘量法定糖原理：淀粉经糖化酶水解生成葡萄糖，葡萄搪具有还原性，其羰基易被弱氧化剂次碘酸钠所氧化：I2+2NaOH=NaIO+NaI+H2ONaIO+C6H12O6=NaI+CH2OH(CHOH)4COOH+NaI体系中加入过量的碘，氧化反应完成后用硫代替硫酸钠滴定过量的碘，即可推算出酶的活力。
I2＋2Na2S2O3 = Na2S4O6＋2NaI三、仪器、原料和试剂仪器吸管(25mL，5mL，2mL，10mL)、定碘瓶(500mL)、碱式滴定管、烧杯、恒温水浴锅、分析天平。
原料：AS3.4309黑曲霉斜面试管菌；麸皮、稻壳。
试剂1. 2％可溶性淀粉溶液：准确称取2克可溶性淀粉(预先于100~105℃烘干至恒重约2小时)，加少量蒸馏水调匀。
倾入80毫升左右的沸蒸馏水中，继续煮沸至透明，冷却后用水定容至100毫升。
2. 0.05 mol/L碘液：称取25克碘化钾溶于少量水中，加入12.7克碘，溶解后定容至1000毫升。
3. pH4.5的1mol/L醋酸缓冲液：称取8.204克无水醋酸钠，先在少量水中溶解，定容至1000毫升。
取分析纯冰醋酸5.78毫升定容至1000毫升。
以上两种溶液按醋酸和醋酸钠的体积比为25：22混合即为所要求之缓冲液。
4. 0.1 mol/L氢氧化钠溶液：称取分析纯氢氧化钠4克溶解并定容至1000毫升。
5. 1 mol/L硫酸：吸取分析纯浓硫酸(比重1.84)55.5毫升，缓缓如入944.5毫升水定容至1000毫升。
6. 0.01 mol/L硫代硫酸钠：称取26克硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)和0.4克碳酸钠，用煮沸冷却的蒸馏水溶解并定容至1000毫升，配制后放置三天再标定。
测定糖化酶活性的方法
对照组
I2 NaIO
完全歧化反应， 无葡萄糖
NaIO3 I2
实验组
I2
NaIO
NaIO另一部分 歧化反应 生成NaIO3
NaIO一部分与 葡萄糖反应
I2
试剂与器材
1.糖化酶试剂；
2.微量滴定管、滴定台、试剂瓶、试管、三角瓶、 pH计、电子天平；
3.试剂
2%可溶性淀粉溶液；pH4.6、0.1mol/L的醋 酸缓冲液； 0.1mol/L碘液；0.1mol/L氢氧化钠 溶液； 2mol/L硫酸溶液； 0.1N硫代硫酸钠溶 液；0.5%淀粉指示剂。
式中:
B——空白滴定消耗的硫代硫酸钠毫升（ml）数；
A——酶液滴定消耗的硫代硫酸钠毫升（ml）数（取3次滴定的平 均值）；
N——硫代硫酸钠的当量浓度。
180.1——葡萄糖的摩尔质量。
8/5——表示从8ml酶反应体系取出5ml反应液。
2——所加酶液为0.5ml，按定义为1ml。
60/10——表示酶反应时间为10min，按定义为1h。
（2）在上述条件下， 1ml酶液每分钟催化2% 淀粉溶液水解生成1μmol葡萄糖的酶量定义 为1个酶活力单位（U）：
酶活力单位（U/ml）=（B－A）×10-3 ×（N/2）× （8/5）×106×2 ×（1/10）
式中符号与前式相同，
其中：
10-3—— ml换算成L。
106—— μmol换算成mol。
4.以0.5%可溶性淀粉为指示剂（4-5滴即可）， 用0.1N硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色消失为终 点。记录0.1N硫代硫酸钠消耗的毫升数：酶 液样品（A）、空白对照（B）；
计算
(1)在上述条件下，1ml酶液每小时催化2%淀粉溶液生 成1mg葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位：
糖化酶活力测定实验报告
华南农业大学综合实验报告实验项目名称：糖化酶活力测定实验项目性质：综合实验计划学时：2学时所属课程名称：食品与发酵工业分析班级：10级生物工程1班姓名：肖佩学号：************指导老师：沈玉栋徐振林一．实验原理采用可溶性淀粉为底物，在一定的pH值与温度下，使之水解为葡萄糖(还原糖)，以直接滴定法测定。
二．试剂及仪器（1）碱性酒石酸铜甲溶液（使用时等体积混合甲、乙溶液）：甲液：称取15.693g硫酸铜(Cu2SO4·5H2O)，0.05g次甲基蓝，用水溶解并稀释定容至1000mL；乙液：称取50g酒石酸钠钾，54g氢氧化钠，4g亚铁氰化钾，用水溶解并稀释定容至1000mL（2）0.1%标准葡萄糖溶液：准确称取1g无水葡萄糖（预先在100-1050C 烘干），用水溶解，加5mL浓盐酸，用水定容至1000mL。
（3）pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲溶液：0.2mol/L乙酸溶液：量取11.8mL冰乙酸，用水稀释至1000mL；0.2mol/L 乙酸钠溶液：称取27.2g乙酸钠（CH3COONa·3H2O），用水定容至1000mL；pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲液：取0.2mol/L的乙酸溶液和0.2mol/L的乙酸钠溶液等体积混合。
（4）0.1mol/L氢氧化钠溶液：称取4g氢氧化钠，用水溶解并定容至1000mL。
（5）2%可溶性淀粉溶液：准确称取2g可溶性淀粉（预先于10-105 0C烘干），加少量水调匀，倾入80mL沸水中，继续煮沸至透明，冷却后用水定容至100mL。
（6）固体曲（7）滴定管、电子天平、烧杯、恒温水浴锅、脱脂棉、容量瓶、移液管、三角瓶三．测定步骤（1）5%固体曲浸出液制备：称取5.0g固体曲（以绝干曲计），置于250mL 烧杯中，加90mL水和10mL pH4.6乙酸－乙酸钠缓冲溶液，搅匀，于30℃水浴中保温浸1小时，每隔15min 搅拌一次。
用脱脂棉过滤，滤液为5％固体曲浸出液。
糖化酶活力测定
3.取上述反应液5ml于三角瓶中，加入0.1N碘液 5ml，缓慢加入0.1N NaOH溶液 5ml ，(注意： 加碱速度不能过快,否则过量NaIO 来不及氧 化C6H12O6 而歧化为不与C6H12O6反应的 NaIO3 和NaI ,使测定结果偏低) 摇匀，在暗处 放置15min后加入1N硫酸2ml；
测定糖化酶的方法有次碘酸钠法、兰–爱 农法（ＳＰ法） 、Schoorl法（ＤＵ法）和 对硝基苯酚葡萄糖法（ＮＰＧ法）等方法。 本试验测定糖化酶活力采用次碘酸钠法。糖 化酶以可溶性淀粉为底物在一定条件下进行 反应,反应生成得葡萄糖用次碘酸钠法定量测 定。以单位时间内分解α–１，４糖苷键生 成葡萄糖所需的酶量为酶的活力单位。当酶 的反应条件不相同时,酶活力单位定义也有所 差别。糖化酶的最适pH范围是4～5,最适应温 度范围是50～60℃。
因此，1mol葡萄糖与1molI2 相当。
6.析出的;2Na2S2O3 =Na2S4O6 +2NaI
没有葡萄糖的情况
1.I2 与 NaOH作用: I2 +2 NaOH=NaIO +NaI +H2O
2、NaIO在碱性条件下发生歧化反应:
3 NaIO=NaIO3 +2 NaI 3、总反应
6.析出的I2 可用标准Na2S2O3 溶液滴定之: I2 +2Na2S2O3 =Na2S4O6 +2NaI
三、试剂与器材
1.糖化酶试剂； 2.微量滴定管、滴定台、试剂瓶、试管、三角
瓶、pH计、电子天平； 3.试剂
2%可溶性淀粉溶液；pH4.6、0.1mol/L的醋 酸缓冲液； 0.1N碘液；0.1N氢氧化钠溶液； 1N硫酸溶液； 0.1N硫代硫酸钠溶液；0.5% 淀粉指示剂。
固体曲糖化酶活力的测定
固体曲糖化酶活力的测定实验原理：1.固体曲在酿造过程中将原料淀粉转化为可发酵糖类的重要酶源。
其中其主要作用的是糖化酶，它可将淀粉水解为葡萄糖供微生物发酵，生成酒精及其它各种相应的白酒成分。
固体曲质量好，糖化活力高，原料淀粉利用率高，出酒率也高。
故糖化酶活力的高低是衡量固体曲质量的重要指标。
2.固体曲糖化酶活力定义为：1g绝干固体曲，在30℃、PH=4.6条件下，1h内水解可溶性淀粉为葡萄糖的毫克数。
其测定的方法可用修正的蓝-艾农法.实验试剂：1. 斐林试剂2. 0.1%葡萄糖标准溶液（准确称取1g无水葡萄糖(预先烘干)，用水溶解，加5ml浓盐酸，用水稀释至1000ml3. 乙酸-乙酸钠缓冲溶液（PH=4.6）4. 0.01mol/L NaOH溶液称取4g NaOH ,用水溶解并稀释至1000ml5. 2%可溶性淀粉溶液准确称取2g可溶性淀粉（预先于100～105℃烘干），加少量水调匀，倾入80ml沸水中，继续煮沸至透明，冷却后用水稀释至100ml.实验步骤：1. 5%固体曲沁出液的提取 称取5.6702g 固体曲（以绝干曲计），置于250ml 烧杯中，加入90ml 水和10ml,PH=4.6的缓冲溶液，摇匀，于30℃水浴中保温沁取1h ，每隔15min 搅拌一次，有脱脂棉过滤，滤液为5%固体曲沁出液。
2. 固体曲糖化液的制备 吸取25ml 2%可溶性淀粉溶液，置于50ml 容量瓶中，于30℃水浴中预热10min.准确加入5ml 5%固体曲沁出液，摇匀，立即计时。
于30℃水浴中准确保温1h 。
迅速加入15ml 0.1mol/LNaOH 溶液，终止酶解反应。
冷却至室温，用水定容至刻度。
同时制作一空白液：准确吸取25ml 2%可溶性淀粉溶液，置于50ml 容量瓶中，先加入15ml 0.1mol/LNaOH 溶液，然后准确加入5ml 空白液，用水定容至刻度。
3. 测定 吸取斐林甲液、乙液各5ml ，置于锥形瓶中，准确加入5ml 空白液，并用滴定管预先加入适量的0.1%葡萄糖标准溶液（使后滴定时消耗0.1%葡萄糖标液在1ml 以内，且在1min 时间以内），摇匀，于电炉上加热至沸腾，立即用0.1%葡萄糖标准溶液滴定至蓝色消失，此次滴定操作需在1min 内完成。
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（2）在上述条件下， 1ml酶液每分钟催化2%淀 1ml酶液每分钟催化2%淀 粉溶液水解生成1 mol葡萄糖的酶量定义为1 粉溶液水解生成1μmol葡萄糖的酶量定义为1个 酶活力单位（U 酶活力单位（U）：
酶活力单位（U/ml） 酶活力单位（U/ml）=（B－A）×10-3 ×（N/2）×（8/5） N/2） 8/5） 1/10） ×106×2 ×（1/10） 式中符号与前式相同， 式中符号与前式相同， 其中： 其中： 10-3—— ml换算成L。 106—— μmol换算成mol。 μmol换算成mol。
次碘酸钠法： 次碘酸钠法：
碘 与 NaOH 作 用 能 生成 NaIO ， 而 葡 萄 糖 能 定 量地(1:1)被NaIO氧化 在酸性条件下，未与 C6H12O6 作 用 的 NaIO可 转变成I2 析出,因此只 要用Na2S2O3 标准溶液 滴定析出的I2 ，便可 计算出 未 参 与 反 应 的 NaIO ，由此推导出糖 化酶催化所产生的 C6H12O6 的含量。 1.I2 与 NaOH作用: NaOH作用: I2 +2 NaOH=NaIO +NaI +H2O 2.C6H12O6 与NaIO定量作用: NaIO定量作用: C6H12O6 +NaIO =C6H12O7 + NaI 3. C6H12O6反应完后,剩余的NaIO 反应完后,剩余的 碱性条件下发生歧化反应: 在碱性条件下发生歧化反应: 3 NaIO=NaIO3 +2 NaI 4.歧化产物在酸性条件下进一步 歧化产物在酸性条件下进一步 作用生成I 作用生成I2: NaIO3 +5NaI +6H2SO4=3I2 +6Na2SO4+3H2O 5.析出的I2 可用标准Na2S2O3 溶液 析出的I 可用标准Na 滴定之: 滴定之: I2 +2Na2S2O3 =Na2S4O6 +2NaI
① 糖化酶的应用与生产
糖 化 酶 ， 全 名 葡 萄 糖 淀 粉 酶 （ Glucoamylase EC. EC.3.2.1.3 ） ， 又名淀粉葡萄糖苷（ Amyloglucosidase ） 又名淀粉葡萄糖苷 （ Amyloglucosidase） 或γ-淀粉酶（γ-amylase），是一种含有甘露糖、葡萄糖、 淀粉酶（ amylase） 半乳糖和糖醛酸的糖蛋白，分子量在60～1000kDa 之间。 因发酵工业中大量用作淀粉糖化剂，习惯上简称糖化酶。 因发酵工业中大量用作淀粉糖化剂，习惯上简称糖化酶。
七、注意事项
1. 注意操作安全; 注意操作安全; 2. 滴定操作时要仔细和准确。糖化酶水解可 溶性粉溶液与滴定后至蓝色消失的溶液两 者色泽的对比。 3. 实验完成以后及时清扫整理； 实验完成以后及时清扫整理； 4. 认真完成实验报告 。
反应试剂配制方法
（1）2%可溶性淀粉 2%可溶性淀粉 称取可溶性淀粉2g（预先100℃烘干约2h至恒重），用少量蒸馏水调匀，徐徐倾入巳沸 称取可溶性淀粉2g（预先100℃烘干约2h至恒重），用少量蒸馏水调匀，徐徐倾入巳沸 的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却定容至l00ml，此溶液需当天配制。 的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却定容至l00ml，此溶液需当天配制。 （2）0.2mol/L pH4.6 醋酸钠缓冲液 称取醋酸钠(CH COONa· 称取醋酸钠(CH3COONa·3H2O)2.722g，用蒸馏水溶解，定容至100m1。冰醋酸 O)2.722g，用蒸馏水溶解，定容至100m1。冰醋酸 (CH3COOH) 1.17m1定容至100ml。分别取醋酸钠49ml和醋酸51ml混匀。缓冲液以酸度计或精 1.17m1定容至100ml。分别取醋酸钠49ml和醋酸51ml混匀。缓冲液以酸度计或精 密试纸校正pH。 密试纸校正pH。 （3）0.1mol/L碘液 称取13g碘及35g碘化钾，溶于100mL水中，稀释定容至1000mL，摇匀，贮存于棕色瓶中。 （4）0.1mo1/L氢氧化钠溶液 称取4g氢氧化钠加蒸馏水溶解，定容至1000ml。 （5）2mol/L硫酸溶液 量取浓硫酸5.6ml，慢慢加入于80 m1蒸馏水中，冷却后定容至l00ml，摇匀。 （ 6）0.1mol/L硫代硫酸钠溶液 配制：称取结晶硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O) 24.82g和碳酸钠约0.2g（硫代硫酸钠溶液在 pH9-10时最稳定）溶于煮沸后冷却的蒸馏水中（无CO2），定容至1000ml，即得0.1 mol/L硫 代硫酸钠溶液。贮于棕色瓶中密封保存，配制后应放置一星期标定使用。 （7）0.5%可溶性淀粉：称取0.5 g可溶性淀粉，用少许水调匀，倾入80 ml沸水中，继续煮 沸至透明，冷却后定容至100 ml。
注释： 注释：
在这一系列的反应中，1mol葡萄糖与1mol 在这一系列的反应中，1mol葡萄糖与1mol NaIO作用，而1molI 产生1molNaIO，因此， NaIO作用，而1molI2产生1molNaIO，因此， 1mol葡萄糖与1molI 1mol葡萄糖与1molI2 相当。只要得出对照
5.计算： 5.计算： (1)在上述条件下，1ml酶液每小时催化2%淀粉溶 (1)在上述条件下，1ml酶液每小时催化2%淀粉溶 液生成1mg葡萄糖的酶量定义为1 液生成1mg葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位：
酶活力单位（U/ml）=（B－A）×（N/2）× 180.1×（8/5） （ ） （ － ） ） × ） ×2×（60/10） × ）
组和实验组所消耗的硫代硫酸钠体积， 两者相减就可以得出与葡萄糖反应的那 部分次碘酸钠的量，从而可以确定酶解 生成的葡萄糖的量，从而计算出酶活。
对 照 验
实
组
I2 组
Байду номын сангаасI2
NaIO NaIO
完全歧化反应， 无葡萄糖
NaIO 歧化反应 NaIO
NaIO 葡萄糖反应
NaIO
I2
I2
三、试剂与器材
1.糖化酶试剂； 1.糖化酶试剂； 2.微量滴定管、滴定台、试剂瓶、试管、三角 2.微量滴定管、滴定台、试剂瓶、试管、三角 瓶、pH计、电子天平； 瓶、pH计、电子天平； 3.试剂 3.试剂 2%可溶性淀粉溶液；pH4.6、0.1mol/L的醋 2%可溶性淀粉溶液；pH4.6、0.1mol/L的醋 酸缓冲液； 0.1mol/L碘液；0.1mol/L氢氧化 0.1mol/L碘液；0.1mol/L氢氧化 钠溶液； 2mol/L硫酸溶液； 0.1N硫代硫酸 2mol/L硫酸溶液； 0.1N硫代硫酸 钠溶液；0.5%淀粉指示剂。 钠溶液；0.5%淀粉指示剂。
实验三
糖化酶活力的测定
指导老师： 孙运军 研 究 生： 赵 渊 徐 妙
一、目的和内容
目的：学习测定糖化酶活力的原理并掌握 测定糖化酶活力的方法 内容：１. 内容：１. 学习糖化酶活力的原理． ２. 测定并计算糖化酶活力．
二、糖化酶简介以及其活性的测定原理
① 糖化酶的应用及生产 ② 糖化酶的催化原理 ③ 酶活测定方法
3.取上述反应液5ml于三角瓶中，加入0.1N碘液 3.取上述反应液5ml于三角瓶中，加入0.1N碘液 5ml，缓慢加入0.1mol/L NaOH溶液 5ml，缓慢加入0.1mol/L NaOH溶液 5ml (注意: (注意: 加碱速度不能过快,否则过量NaIO 加碱速度不能过快,否则过量NaIO 来不及氧化 C6H12O6 而歧化为不与C6H12O6反应的NaIO3 和 而歧化为不与C 反应的NaIO NaI ,使测定结果偏低) ，摇匀后在暗处放置 ,使测定结果偏低) 摇匀后在暗处放置 15min后加入2mol/L硫酸2ml； 15min后加入2mol/L硫酸2ml； 2mol/L 2ml 4.以0.5%可溶性淀粉为指示剂（4-5滴即可），用 4.以0.5%可溶性淀粉为指示剂（4 0.1N硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色消失为终点。 0.1N硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色消失为终点。 记录0.1N硫代硫酸钠消耗的毫升数：酶液样品 记录0.1N硫代硫酸钠消耗的毫升数：酶液样品 （A）、空白对照（B）； ）、空白对照（B
②糖化酶的作用机制
糖化酶是由一系列微生物分泌的具有外切酶活性的 胞外酶。糖化酶的主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳 链上的非还原性末端（整个碳链只有一个还原端，与之 相对的都是非还原端）依次水解a- 1,4 糖苷键, 切下一个 个葡萄糖单元，并像β- 淀粉酶一样, 使水解下来的葡萄 糖发生构型变化，形成β- D- 葡萄糖。对于支链淀粉， 当遇到分支点时，它也可以水解a- 1,6 糖苷键，由此将 支链淀粉全部水解成葡萄糖。糖化酶也能微弱水解a- 1,3 连接的碳链，但水解a- 1,4 糖苷键的速度最快，它一般 都能将淀粉百分之百地水解生成葡萄糖。
还 原
端
③酶活测定方法测定糖化酶的方法有次碘 酶活测定方法测定糖化酶的方法有次碘 酸钠法、兰– 酸钠法、兰–爱农法（ＳＰ法） 、Schoorl 法（ＤＵ法）和对硝基苯酚葡萄糖法（ＮＰ Ｇ法）、3,5-二硝基水杨酸(DNS) Ｇ法）、3,5-二硝基水杨酸(DNS) 等方法。 本试验测定糖化酶活力采用次碘酸钠法。 本试验测定糖化酶活力采用次碘酸钠法。 糖化酶以可溶性淀粉为底物在一定条件下 （pH范围是4～6, 温度范围是40～60℃）进 pH范围是4 温度范围是4 60℃）进 行反应 行反应，生成的葡萄糖用次碘酸钠法定量测 定。以单位时间内分解α 定。以单位时间内分解α–１，４糖苷键生 成葡萄糖所需的酶量为酶的活力单位。
五、实验报告
将重复3 将重复3次测定的糖化酶活力结果记录在 实验报告中，并按提供的两种计算公式分 别计算出酶活力。
六、问题和思考
1. 糖化酶的作用有何特点？ 2. 你认为实验过程中哪些步骤关键，应注意 些什么问题？ 3. 为什么用失活酶液作为空白对照而不用蒸 馏水？ 4. 两个计算糖化酶活力的公式中各项的意义 及两者各有何特点？
糖化酶在工业生产中的应用：
糖化酶是淀粉糖化发酵生产酒精和葡萄糖浆的主 要酶类。 特别是酿酒酵母利用淀粉原料发酵时 ， 要酶类 。 特别是酿酒酵母利用淀粉原料发酵时， 淀粉液化后的糖化作用是必不可少的工序， 淀粉液化后的糖化作用是必不可少的工序 ， 因为 大多数酿酒酵母只能利用可发酵的糖进行酒精发 酵。