糖化酶发酵、提取及活力测定
糖化酶活力测定实验报告
华南农业大学综合实验报告实验项目名称：糖化酶活力测定实验项目性质：综合实验计划学时：2学时所属课程名称：食品与发酵工业分析班级：10级生物工程1班姓名：肖佩学号：************指导老师：沈玉栋徐振林一．实验原理采用可溶性淀粉为底物，在一定的pH值与温度下，使之水解为葡萄糖(还原糖)，以直接滴定法测定。
二．试剂及仪器（1）碱性酒石酸铜甲溶液（使用时等体积混合甲、乙溶液）：甲液：称取15.693g硫酸铜(Cu2SO4·5H2O)，0.05g次甲基蓝，用水溶解并稀释定容至1000mL；乙液：称取50g酒石酸钠钾，54g氢氧化钠，4g亚铁氰化钾，用水溶解并稀释定容至1000mL（2）0.1%标准葡萄糖溶液：准确称取1g无水葡萄糖（预先在100-1050C 烘干），用水溶解，加5mL浓盐酸，用水定容至1000mL。
（3）pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲溶液：0.2mol/L乙酸溶液：量取11.8mL冰乙酸，用水稀释至1000mL；0.2mol/L 乙酸钠溶液：称取27.2g乙酸钠（CH3COONa·3H2O），用水定容至1000mL；pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲液：取0.2mol/L的乙酸溶液和0.2mol/L的乙酸钠溶液等体积混合。
（4）0.1mol/L氢氧化钠溶液：称取4g氢氧化钠，用水溶解并定容至1000mL。
（5）2%可溶性淀粉溶液：准确称取2g可溶性淀粉（预先于10-105 0C烘干），加少量水调匀，倾入80mL沸水中，继续煮沸至透明，冷却后用水定容至100mL。
（6）固体曲（7）滴定管、电子天平、烧杯、恒温水浴锅、脱脂棉、容量瓶、移液管、三角瓶三．测定步骤（1）5%固体曲浸出液制备：称取5.0g固体曲（以绝干曲计），置于250mL 烧杯中，加90mL水和10mL pH4.6乙酸－乙酸钠缓冲溶液，搅匀，于30℃水浴中保温浸1小时，每隔15min 搅拌一次。
用脱脂棉过滤，滤液为5％固体曲浸出液。
测定糖化酶活性的方法
酶活力单位（U/ml）=（B－A）×10-3 ×（N/2）× （8/5）×106×2 ×（1/10） 式中符号与前式相同， 其中： 10-3—— ml换算成L。 106—— μ mol换算成mol。
反应试剂配制方法
（1）2%可溶性淀粉 称取可溶性淀粉2g（预先100℃烘干约2h至恒重），用少量 蒸馏水调匀，徐徐倾入巳沸的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却定容至 l00ml，此溶液需当天配制。 （2）0.2mol/L pH4.6 醋酸钠缓冲液 称取醋酸钠(CH3COONa·3H2O)2.722g，用蒸馏水溶解，定容 至100m1。冰醋酸(CH3COOH) 1.17m1定容至100ml。分别取醋酸钠49ml 和醋酸51ml混匀。缓冲液以酸度计或精密试纸校正pH。 （3）0.1mol/L碘液 称取13g碘及35g碘化钾，溶于100mL水中，稀释定容至1000mL， 摇匀，贮存于棕色瓶中。
操作步骤
1. 取7个带塞的试管（其中3个测今年批次的酶 活、另外3个测去年批次的酶活、1个作空白 对照），分别吸取2%可溶性淀粉液5ml，加 入pH4.6醋酸缓冲液2.5ml，混匀后于40 ℃水 浴中预热10min。 2. 加入酶液0.5ml（空白对照组以煮沸失活的酶 液代替）于40 ℃，反应10min；反应结束时， 立即于沸水浴加热5min使酶失活(此时应将试 管的塞子打开）。
糖化酶是由一系列微生物分泌的具有外切酶活性的胞外 酶。糖化酶的主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的 非还原性末端（整个碳链只有一个还原端，与之相对的都 是非还原端）依次水解a- 1,4 糖苷键, 切下一个个葡萄糖 单元，并像β- 淀粉酶一样, 使水解下来的葡萄糖发生构型 变化，形成β- D- 葡萄糖。对于支链淀粉，当遇到分支点 时，它也可以水解a- 1,6 糖苷键，由此将支链淀粉全部水 解成葡萄糖。糖化酶也能微弱水解a- 1,3 连接的碳链，但 水解a- 1,4 糖苷键的速度最快，它一般都能将淀粉百分之 百地水解生成葡萄糖。
测定糖化酶活性的方法
对照组
I2 NaIO
完全歧化反应， 无葡萄糖
NaIO3 I2
实验组
I2
NaIO
NaIO另一部分 歧化反应 生成NaIO3
NaIO一部分与 葡萄糖反应
I2
试剂与器材
1.糖化酶试剂；
2.微量滴定管、滴定台、试剂瓶、试管、三角瓶、 pH计、电子天平；
3.试剂
2%可溶性淀粉溶液；pH4.6、0.1mol/L的醋 酸缓冲液； 0.1mol/L碘液；0.1mol/L氢氧化钠 溶液； 2mol/L硫酸溶液； 0.1N硫代硫酸钠溶 液；0.5%淀粉指示剂。
式中:
B——空白滴定消耗的硫代硫酸钠毫升（ml）数；
A——酶液滴定消耗的硫代硫酸钠毫升（ml）数（取3次滴定的平 均值）；
N——硫代硫酸钠的当量浓度。
180.1——葡萄糖的摩尔质量。
8/5——表示从8ml酶反应体系取出5ml反应液。
2——所加酶液为0.5ml，按定义为1ml。
60/10——表示酶反应时间为10min，按定义为1h。
（2）在上述条件下， 1ml酶液每分钟催化2% 淀粉溶液水解生成1μmol葡萄糖的酶量定义 为1个酶活力单位（U）：
酶活力单位（U/ml）=（B－A）×10-3 ×（N/2）× （8/5）×106×2 ×（1/10）
式中符号与前式相同，
其中：
10-3—— ml换算成L。
106—— μmol换算成mol。
4.以0.5%可溶性淀粉为指示剂（4-5滴即可）， 用0.1N硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色消失为终 点。记录0.1N硫代硫酸钠消耗的毫升数：酶 液样品（A）、空白对照（B）；
计算
(1)在上述条件下，1ml酶液每小时催化2%淀粉溶液生 成1mg葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位：
糖化酶活力测定
次碘酸钠法： 次碘酸钠法：
碘 与 NaOH 作 用 能 生成 NaIO ， 而 葡 萄 糖 能 定 量地(1:1)被NaIO氧化 在酸性条件下，未与 C6H12O6 作 用 的 NaIO可 转变成I2 析出,因此只 要用Na2S2O3 标准溶液 滴定析出的I2 ，便可 计算出 未 参 与 反 应 的 NaIO ，由此推导出糖 化酶催化所产生的 C6H12O6 的含量。 1.I2 与 NaOH作用: NaOH作用: I2 +2 NaOH=NaIO +NaI +H2O 2.C6H12O6 与NaIO定量作用: NaIO定量作用: C6H12O6 +NaIO =C6H12O7 + NaI 3. C6H12O6反应完后,剩余的NaIO 反应完后,剩余的 碱性条件下发生歧化反应: 在碱性条件下发生歧化反应: 3 NaIO=NaIO3 +2 NaI 4.歧化产物在酸性条件下进一步 歧化产物在酸性条件下进一步 作用生成I 作用生成I2: NaIO3 +5NaI +6H2SO4=3I2 +6Na2SO4+3H2O 5.析出的I2 可用标准Na2S2O3 溶液 析出的I 可用标准Na 滴定之: 滴定之: I2 +2Na2S2O3 =Na2S4O6 +2NaI
实验三
糖化酶活力的测定
指导老师： 孙运军 研 究 生： 赵 渊 徐 妙
一、目的和内容
目的：学习测定糖化酶活力的原理并掌握 测定糖化酶活力的方法 内容：１. 内容：１. 学习糖化酶活力的原理． ２. 测定并计算糖化酶活力．
二、糖化酶简介以及其活性的测定原理
① 糖化酶的应用及生产 ② 糖化酶的催化原理 ③ 酶活测定方法
（2）在上述条件下， 1ml酶液每分钟催化2%淀 1ml酶液每分钟催化2%淀 粉溶液水解生成1 mol葡萄糖的酶量定义为1 粉溶液水解生成1μmol葡萄糖的酶量定义为1个 酶活力单位（U 酶活力单位（U）：
糖化酶的生产工艺
糖化酶的生产工艺糖化酶是一种催化糖化反应的酶，可以将淀粉、纤维素等多糖分解成简单的糖类。
由于其广泛的应用于食品、饲料、制糖、生物燃料等领域，糖化酶的生产工艺变得越来越重要。
糖化酶的生产工艺一般分为以下几个步骤：1. 酶源的筛选和培养糖化酶可以从多种微生物中获得，如真菌、细菌、酵母等。
首先需要筛选出具有高效酶活性的酶源，并进行毒力测试排除可能的有害物质。
接着，将所选的酶源进行大规模培养，为后续酶的提取和纯化做准备。
2. 酶的提取和纯化培养出的菌液会经过离心等操作将酶从菌体中分离出来。
接下来，可以利用重组工程技术将酶基因引入适当的宿主细胞进行表达和分泌。
经过多次过滤、层析、浓缩等步骤，可以获得纯化后的糖化酶产品。
3. 酶活力的测试和调整酶的活力是衡量其催化能力的重要指标，因此需要对纯化后的酶进行活力测定。
如果发现酶活力较低或不稳定，可以通过改变培养条件、酶提取和纯化过程中的参数来进行调整，如改变pH值、温度、金属离子浓度等。
4. 酶的固定化处理（可选）为了提高酶在反应体系中的稳定性和重复使用性，可以将酶固定在某种载体上，如多孔陶瓷、聚合物凝胶或生物膜等。
固定化酶可以增加酶的使用寿命和催化效率，减少废液处理的复杂性。
5. 酶活性的保存和包装为了保持酶活性和延长保存期限，酶产品通常会经过冷冻干燥或冷藏等工艺进行保存。
同时，酶产品还需要进行适当的包装，以便在运输和储存过程中保护酶的完整性和稳定性。
总结起来，糖化酶的生产工艺包括酶源的筛选和培养、酶的提取和纯化、酶活力的测试和调整、酶的固定化处理以及酶活性的保存和包装等步骤。
每个步骤都需要进行精确控制，以确保酶产品的质量和稳定性。
随着科技的发展，糖化酶的生产工艺也在不断改进，可以预见未来糖化酶的生产将更加高效、环保和经济。
糖化酶活力测定
3.取上述反应液5ml于三角瓶中，加入0.1N碘液 5ml，缓慢加入0.1N NaOH溶液 5ml ，(注意： 加碱速度不能过快,否则过量NaIO 来不及氧 化C6H12O6 而歧化为不与C6H12O6反应的 NaIO3 和NaI ,使测定结果偏低) 摇匀，在暗处 放置15min后加入1N硫酸2ml；
测定糖化酶的方法有次碘酸钠法、兰–爱 农法（ＳＰ法） 、Schoorl法（ＤＵ法）和 对硝基苯酚葡萄糖法（ＮＰＧ法）等方法。 本试验测定糖化酶活力采用次碘酸钠法。糖 化酶以可溶性淀粉为底物在一定条件下进行 反应,反应生成得葡萄糖用次碘酸钠法定量测 定。以单位时间内分解α–１，４糖苷键生 成葡萄糖所需的酶量为酶的活力单位。当酶 的反应条件不相同时,酶活力单位定义也有所 差别。糖化酶的最适pH范围是4～5,最适应温 度范围是50～60℃。
因此，1mol葡萄糖与1molI2 相当。
6.析出的;2Na2S2O3 =Na2S4O6 +2NaI
没有葡萄糖的情况
1.I2 与 NaOH作用: I2 +2 NaOH=NaIO +NaI +H2O
2、NaIO在碱性条件下发生歧化反应:
3 NaIO=NaIO3 +2 NaI 3、总反应
6.析出的I2 可用标准Na2S2O3 溶液滴定之: I2 +2Na2S2O3 =Na2S4O6 +2NaI
三、试剂与器材
1.糖化酶试剂； 2.微量滴定管、滴定台、试剂瓶、试管、三角
瓶、pH计、电子天平； 3.试剂
2%可溶性淀粉溶液；pH4.6、0.1mol/L的醋 酸缓冲液； 0.1N碘液；0.1N氢氧化钠溶液； 1N硫酸溶液； 0.1N硫代硫酸钠溶液；0.5% 淀粉指示剂。
固体曲糖化酶活力的测定
固体曲糖化酶活力的测定实验原理：1.固体曲在酿造过程中将原料淀粉转化为可发酵糖类的重要酶源。
其中其主要作用的是糖化酶，它可将淀粉水解为葡萄糖供微生物发酵，生成酒精及其它各种相应的白酒成分。
固体曲质量好，糖化活力高，原料淀粉利用率高，出酒率也高。
故糖化酶活力的高低是衡量固体曲质量的重要指标。
2.固体曲糖化酶活力定义为：1g绝干固体曲，在30℃、PH=4.6条件下，1h内水解可溶性淀粉为葡萄糖的毫克数。
其测定的方法可用修正的蓝-艾农法.实验试剂：1. 斐林试剂2. 0.1%葡萄糖标准溶液（准确称取1g无水葡萄糖(预先烘干)，用水溶解，加5ml浓盐酸，用水稀释至1000ml3. 乙酸-乙酸钠缓冲溶液（PH=4.6）4. 0.01mol/L NaOH溶液称取4g NaOH ,用水溶解并稀释至1000ml5. 2%可溶性淀粉溶液准确称取2g可溶性淀粉（预先于100～105℃烘干），加少量水调匀，倾入80ml沸水中，继续煮沸至透明，冷却后用水稀释至100ml.实验步骤：1. 5%固体曲沁出液的提取 称取5.6702g 固体曲（以绝干曲计），置于250ml 烧杯中，加入90ml 水和10ml,PH=4.6的缓冲溶液，摇匀，于30℃水浴中保温沁取1h ，每隔15min 搅拌一次，有脱脂棉过滤，滤液为5%固体曲沁出液。
2. 固体曲糖化液的制备 吸取25ml 2%可溶性淀粉溶液，置于50ml 容量瓶中，于30℃水浴中预热10min.准确加入5ml 5%固体曲沁出液，摇匀，立即计时。
于30℃水浴中准确保温1h 。
迅速加入15ml 0.1mol/LNaOH 溶液，终止酶解反应。
冷却至室温，用水定容至刻度。
同时制作一空白液：准确吸取25ml 2%可溶性淀粉溶液，置于50ml 容量瓶中，先加入15ml 0.1mol/LNaOH 溶液，然后准确加入5ml 空白液，用水定容至刻度。
3. 测定 吸取斐林甲液、乙液各5ml ，置于锥形瓶中，准确加入5ml 空白液，并用滴定管预先加入适量的0.1%葡萄糖标准溶液（使后滴定时消耗0.1%葡萄糖标液在1ml 以内，且在1min 时间以内），摇匀，于电炉上加热至沸腾，立即用0.1%葡萄糖标准溶液滴定至蓝色消失，此次滴定操作需在1min 内完成。
05-01-037DNS法测定糖化酶活力(精)精选全文
可编辑修改精选全文完整版3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定糖化酶活力一、原理糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。
在煮沸条件下，葡萄糖在碱性介质中被3,5-二硝基水杨酸(DNS)氧化成葡萄糖酸，而3,5-二硝基水杨酸被还原成红褐色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出淀粉经糖化酶水解后产生的葡萄糖总量。
由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。
反应过程如下：二、仪器、试剂1、仪器1)具塞玻璃刻度比色管：25mL×19；2)烧杯：100mL×4；3)三角瓶：100mL×1；4)容量瓶：100mL×3，50mL×3；5)刻度吸管：1mL×4；2mL×3；10mL×1；6)沸水浴；7)冰浴；8)扭力天平；9) UV —2802SH 型紫外可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司； 2、试剂1) 1mg/mL 葡萄糖标准液准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg ，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL ，混匀，4℃冰箱中保存备用。
2) 3,5-二硝基水杨酸（DNS ）试剂将6.3g DNS 和262mL 2M NaOH 溶液，加到500mL 含有185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g 结晶酚和5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL ，贮于棕色瓶中备用。
三、操作步骤1、葡萄糖标准曲线的绘制取7支25mL 具塞刻度比色管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL 的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS ）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
SHANDONGＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ
发酵工艺学实验报告
糖化酶发酵、提取及活力测定实验
学院：生命科学学院
专业班级：生物工程1602
项目组成员：刘松良、张金中、蔡超、何建雨、周钻钻
指导教师：王丽娟
2018年6月
糖化酶发酵、提取及活力测定实验
何健雨王丽娟
生命科学学院生工1602班
1. 实验目的
(1)了解黑曲霉生长特性,学习糖化酶发酵工艺；
(2)了解黑曲霉生长特性,学习糖化酶发酵工艺。
(3)学习并掌握糖化酶活力测定方法
2. 实验原理
葡萄糖淀粉酶( glucoamylase,EC.3.3.13)系统名为淀粉a-1,4-葡聚糖葡萄糖水解酶,俗称糖化酶,是国内酶制剂中产量最大的品种。
糖化酶对淀粉分子的作用是从非还原性末端切开a-1,4键,也能切开a-1,3键和a-1,6键,生成葡萄糖。
生产糖化酶常用的菌种是黑曲霉,将活化好的黑曲霉制成孢子悬浮液,转接接到三角瓶直接进行发酵,或转接到三角瓶作为种子,进行一次扩大培养后,再转接到发酵罐进行糖化酶发酵。
黑曲霉糖化酶是一种胞外酶。
首先采用过滤法将菌体等杂质除去,继而对滤液进行浓缩,最后用有机溶剂如乙醇将酶沉淀出来,对沉淀物进行干燥,加工成成品。
糖化酶有催化淀粉水解的作用,能从淀粉分子非还原性末端开始,分解a-1,4键,生成葡萄糖。
葡萄糖分子中含有的醛基能被次碘酸钠氧化,过量的次碘酸钠钠,酸化后析出碘,再用硫代硫酸钠标准溶液标定,计算酶活力。
酶活力定义:1g固体酶粉(或1mL液体酶),于559CpH4.6的条件下,1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖,即为一个酶活力单位,以U/mL(U/g)表示。
3. 实验材料
优质大麦芽粉、大米粉、酒花；耐高温-α淀粉酶、糖化酶；乳酸（磷酸）；
0.025 mol/L碘液；温度计（100℃）、恒温水浴锅、糖度计、布氏漏斗、分析天平、纱布、玻璃仪器。
4. 方法步骤
待测酶液的制备:
称取酶粉1-2g,精确至0.0002g,先用少量的乙酸缓
冲液溶解,并用玻璃棒捣研,将上请液小心倾入容量瓶
中。
沉渣部分再加入少量缓冲液,如此捣研3-4次,最后
全部移入容量瓶中,用缓冲液定容至刻度(估计酶活力
在100-250U/mL范围内),摇摇匀。
通过4层纱布过滤滤,滤液供测定用。
4. 实验结果
发酵液
110 干酶泥0.03
上清
发酵液上清干酶泥
A 5.3 6.9
B 3.7 6.0
酶活92.84 52.1
5.结论与讨论
结论：干酶泥所需剂量普遍高于发酵液上清，干酶泥酶活更高。
讨论：实验过程中PH调节无法做到精准，可能会造成误差。
实验总结（含实验体会、关键步骤、注意事项等）
实验体会：通过本次实验，了解了糖化酶发酵、提取及活力测定的方法；关键步骤：鲜酶泥一定要完全转移，不可有浪费，否则会导致测量不准注意事项：将鲜酶泥转移到称量纸上进行干燥,勿用滤纸,滤纸会吸附。