酶活力测定

华南农业大学综合实验报告实验项目名称：食品发酵工业中常用系列酶活力测定实验项目性质：综合性实验计划学时：6所属课程名称：食品与发酵工业分析班级：09生物工程2班******学号：************实验课指导老师：沈玉栋摘要测定食品发酵工业中常用酶活力，对于选择酶种类，工艺条件的制定等有重要意义。

本次实验中对工业常用系列酶——糖化酶，淀粉酶，蛋白酶进行了酶活力测定。

其中，测定糖化酶采用直接滴定法，测定淀粉酶采用目测比色法，测定蛋白酶采用福林酚法。

关键词：酶活力糖化酶淀粉酶蛋白酶直接滴定法目测比色法福林酚法1 前言酶，从早期的酿造、发酵食品开始，至今已广泛应用到各种食品上。

随着生物科技进展，不断研究、开发出新的酶制剂，已成为当今新的食品原料开发、品质改良、工艺改造的重要环节。

目前已有几十种酶成功地用于食品工业。

例如，葡萄糖、饴糖、果葡糖浆的生产、蛋白质制品加工、果蔬加工、食品保鲜以及改善食品的品质与风味等。

应用的酶制剂主要有：淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、葡萄糖异构酶、果胶酶、脂肪酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶等。

酶作为生物体内的一种具有催化活性的蛋白质，生物体内几乎所有的反应都离不开没的催化。

作为生物体内的催化剂，催化效率——即酶的活力是酶的一个重要的的指标。

酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。

测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。

酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。

在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。

因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。

糖化酶，又称葡萄糖淀粉酶、γ-淀粉酶。

它能把淀粉从非还原性未端水介a-1，4葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解a-1，6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖。

同时也能水解糊精，糖原的非还原末端释放β-D-葡萄糖。

采用可溶性淀粉为底物，在一定的pH值与温度下，使之水解为葡萄糖(还原糖)，以直接滴定法测定。

淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，通常通过淀粉酶催化水解织物上的淀粉浆料。

淀粉酶的种类很多，根据酶水解产物异构类型的不同可分为α-淀粉酶与β-淀粉酶。

液化型淀粉酶(又称α-1,4糊精酶，俗称α-淀粉酶)能水解淀粉中α-1,4葡萄糖苷键，水解淀粉为分子量不一的糊精，淀粉迅速被液化。

使淀粉与碘呈蓝紫色特征反应逐渐消，以该颜色的消失速度计算酶的活力的高低。

蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。

微生物蛋白酶，主要由霉菌、细菌，其次由酵母、放线菌生产。

福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和钨蓝混合物)，由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。

因此可利用此原理测定蛋白酶活力。

通常以酪蛋白为底物，在一定pH值和温度条件下，同酶液反应，经一段时间后终止酶促反应，经离心或过滤除去酪蛋白筹沉淀物后取上清液，用Na2CO3碱化，再加入福林-酚试剂显色，蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比; 酪氨酸含量用分光光度计在680nm波长处测定，从而计算出蛋白酶的活力。

2 实验材料和仪器2.1实验材料碱性酒石酸铜甲溶液、0.1％标准葡萄糖溶液、pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲溶液、0.1mol/L氢氧化钠溶液、2％可溶性淀粉溶液、固体曲、稀碘液、2％可溶性淀粉溶液、0.02mol/L pH6.0的磷酸氢二钠——柠檬酸缓冲液、标准终点比色液、液化型淀粉酶粉(即α-淀粉酶粉)、福林酚试剂、0.02mol/LpH7.5磷酸缓冲液、标准酪氨酸溶液(50μg/mL)、酪蛋白溶液(0.5％)。

2.2 实验仪器滴定管、电子天平、烧杯、恒温水浴锅、脱脂棉、容量瓶、移液管、三角瓶、试管、三角瓶、滴管、移液管、恒温水浴、白瓷板、纱布、恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。

3 实验步骤3.1 糖化酶活力测定3.1.1 5％固体曲浸出液制备：称取5.0g固体曲（以绝干曲计），置于250mL 烧杯中，加90mL水和10mL pH4.6乙酸－乙酸钠缓冲溶液，搅匀，于30℃水浴中保温浸1小时，每隔15min搅拌一次。

用脱脂棉过滤，滤液为5％固体曲浸出液。

3.1.2 固体曲糖化液的制备：吸取25mL 2％可溶性淀粉溶液，置于50mL容量瓶中，于30℃水浴预热10min。

准确加入5mL 5％固体曲浸出液，摇匀，立即记下时间。

于30℃水浴准确保温糖化1小时。

迅速加入15mL 0.1mol/L氢氧化钠溶液，终止酶解反应。

冷却至室温，用水定容至刻度。

同时作一空白液：吸取25mL 2％可溶性淀粉溶液，置于50mL 容量瓶中，先加入15mL 0.1mol/L 氢氧化钠溶液，然后准确加入5mL 5％固体曲浸出液，用水定容至刻度。

3.1.3 定糖：空白液测定：吸取碱性酒石酸铜甲、乙液各5mL ，置于100-150mL 三角瓶中，准确加入5mL 空白液，并用滴定管预先加入适量的0.1％标准葡萄糖溶液，使滴定时消耗的0.1％标准葡萄糖溶液在1mL 以内，摇匀。

于电炉上加热至沸腾，立即用0.1％标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失，此滴定操作需在1min 内完成。

糖化液测定：准确吸取5mL 糖化液代替5mL 空白液，其余操作同上。

3.1.4 结果计算固体曲糖化酶活力定义：1g 绝干固体曲，在30℃、pH4.6、1小时内水解可溶性淀粉为葡萄糖的毫克数。

100015100550-0⨯⨯⨯⨯⨯=WC V V ）（糖化酶活力 式中：V 0——5mL 空白液消耗0.1％标准葡萄糖溶液的体积（mL ）V ——5mL 糖化液消耗0.1％标准葡萄糖溶液的体积（mL ） C ——标准葡萄糖溶液浓度（g/mL ）50/5——5mL 糖化液换算成50mL 糖化液中的糖量（g ） 100/5——5mL 浸出液换算成100mL 浸出液中的糖量（g ） W ——绝干曲称取量(5.0g) 1000——g 换算成mg3.2.淀粉酶活力测定 3.2.1 待测酶液的制备精确称取酶粉2.0000g ，先用少量的40℃0.02mol/L pH6.0的磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲溶液溶解，并用玻璃棒捣研，将上层液小心倾入500mL 容量瓶中，沉渣部分再加入少量上述缓冲液，如此反复捣研3~4次，最后全部转入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀，40℃浸取30min ，然后，通过四层纱布过滤，滤液供测试用。

3.2.2 测定取2mL 终点标准指示液与白瓷板空穴内，作为颜色的标准。

取20mL2％可溶性淀粉溶液和5mL pH6.0磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液，注入150mL 三角瓶中，在60℃恒温水浴中预热5min ，然后加入预先稀释好的酶液0.5mL ，立即记录时间，充分摇匀，定时用滴管取出反应也约0.5mL 。

滴于预选充满比色稀碘液(约1.5mL)的白瓷板空穴内，当空穴内颜色反应由紫色逐渐变为红棕色，与标准终点指示颜色相同时，即为反应终点，记录时间T (min)。

3.2.3 结果计算以1g 酶粉(或1mL 酶液)于60℃，pH6.0的条件下，1小时液化可溶性淀粉的克数来表示(g/g •h 或g/mL •h)。

5.0/%22060⎪⎭⎫⎝⎛⨯⨯⨯=n T 酶的活力单位 式中 n ------酶粉稀释倍数；2％------淀粉溶液浓度；20------可溶性淀粉吸取体积(mL)； T ------测定记录时间(min)；0.5-----测定时所用酶液体积(mL)；3.3 蛋白酶活力测定 3.3.1 标准曲线的绘制L-酪氨酸标准溶液：按表1配制。

L-酪氨酸稀释液应在稀释液应在稀释后立即进行测定。

表1分别取上述溶液各1.00mL（须做平行试验），各加碳酸钠溶液5.00mL、福林试剂使用溶液1.00mL，振荡均匀，置于40±0.2℃水浴中显色20min，取出，用分光光度计于波长680nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的0管为空白，分别测定其吸光度。

以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线。

利用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（ug），即为吸光常数K值。

其K值应在95-100范围内，如不符合，需重新配制试剂，进行试验。

3.3.2 待测酶液的制备称取酶样品1-2g，精确至0.0002g。

然后用相应的缓冲液溶解并稀释到一定的浓度，推荐浓度范围为酶活力10-15u/mL。

对于粉状的样品，可以用相应的缓冲液充分溶解，然后取滤液（慢速定性滤纸）稀释至适当浓度。

3.3.3 测定步骤3.3.3.1 先将酪蛋白溶液放入40±0.2℃恒温水浴中，预热5min。

3.3.3.2 按下列程序操作：试管A（空白）试管B（酶试样）↓↓加酶液1.00mL 加酶液1.00mL↓40±0.2℃，2min ↓40±0.2℃，2min加三氯乙酸2.00mL（摇匀）加酪蛋白溶液1.00mL（摇匀）↓40±0.2℃，10min ↓40±0.2℃，10min加酪蛋白溶液1.00mL（摇匀）加三氯乙酸2.00mL（摇匀）↓↓取出静置10min，过滤（慢速定性滤纸）取出静置10min，过滤（慢速定性滤纸）↓ ↓取1.00mL 滤液 取1.00mL 滤液 ↓ ↓加碳酸钠溶液5.0mL 加碳酸钠溶液5.0mL ↓ ↓加福林试剂使用溶液1.00mL 加福林试剂使用溶液1.00mL ↓40±0.2℃，显色20min ↓40±0.2℃，显色20min 于680nm 波长，用10mm 比色皿测定吸光度 于680nm 波长，用10mm 比色皿测定吸光度3.3.3 结果计算从标准曲线上读出样品最终稀释液的酶活力，单位为u/mL 。

101m 41111⨯⨯⨯⨯=n V A X其中，Ｘ——样品酶活力，ｕ/gA 1——由标准曲线得出的样品最终稀释液的活力，u/mL V 1——溶解样品所使用的容量瓶体积，单位为mL 4 ——反应试剂的总体积，单位为mL n 1——样品的稀释倍数m 1——样品的质量，单位为克（g ）101——反应时间10min ，以1min 计所得结果表示至整数。

4 数据处理与分析4.1固体曲糖化酶活力测定 4.1.1数据处理表1 糖化酶活力测定实验滴定所用滴定液体积组别 1 2 3 平均值 空白试样（ml ）9.769.7010.129.86样品试剂（ml ）5.45 5.38 5.38 5.41由于V 0=9.86，V=5.41，c=0.001 g/mL ，W=5.0g ，X=178 4.1.2 结果分析实验结果表明试样蛋白酶活力为178，根据查找的资料可知本实验所用酶活力偏低。