糖化酶的固定化
《酶的固定化》课件
稳定性评估可 以帮助选择合 适的固定化方 法，提高酶的
固定化效果
稳定性评估还 可以帮助优化 固定化酶的生 产工艺，降低
生产成本
固定化酶的使用寿命
固定化酶的稳定性：在固定化过程中，酶的活性和稳定性得到提高
固定化酶的寿命：固定化酶的寿命通常比游离酶长，可以延长酶的使用寿命
固定化酶的再生：固定化酶可以通过再生技术恢复活性，延长使用寿命
添加标题
酶的固定化可以减少污染，提高环 保性能
酶的固定化可以简化生产工艺，提 高生产效率
酶的固定化未来 发展展望
新技术的开发与应用
酶固定化技术的发展：从传统的物理吸附到新型的化学键合 新型酶固定化技术的应用：在生物催化、生物制药、环境保护等领域的应用 酶固定化技术的挑战：如何提高酶的活性和稳定性，降低成本 酶固定化技术的未来：开发新型酶固定化材料，提高酶的固定化效率和稳定性，拓展应用领域
酶的固定化应用
环境保护：酶的固定化可以用 于污水处理、废气处理等领域
生物催化：酶的固定化可以 提高反应速率和选择性
食品加工：酶的固定化可以用 于食品加工，如酿酒、制糖等
医药工业：酶的固定化可以用 于药物合成、药物分析等领域
酶的固定化技术
吸附法
原理：利用酶与载体之间的物理或化学作用力，使酶固定在载体上 优点：操作简单，成本低，固定化效果好 缺点：酶活性易受载体影响，固定化后酶活性降低 应用：广泛应用于生物催化、生物制药等领域
提高固定化酶的稳定性与活性
改进固定化技术：提高酶的固 定化效率和稳定性
优化酶分子结构：提高酶的活 性和稳定性
筛选和优化固定化载体：提高 酶的固定化效率和稳定性
研究酶的固定化机制：为提高 酶的稳定性与活性提供理论支 持
糖化酶实验报告
一、实验目的1. 了解糖化酶的特性和催化机理。
2. 掌握糖化酶的固定化技术。
3. 学习通过实验测定糖化酶的活力和半衰期。
二、实验原理糖化酶是一种内切酶，能够将淀粉分子水解成葡萄糖。
固定化酶技术是将酶固定在固体载体上，以提高酶的稳定性和重复使用性。
本实验采用戊二醛交联法固定糖化酶，并通过测定固定化酶的活力和半衰期来评估固定化效果。
三、实验材料与仪器材料：1. 马铃薯淀粉2. 葡萄糖3. 戊二醛4. 交联剂5. 硫酸铵6. 碳酸钠7. pH试纸8. 红外测温枪9. 试管10. 烧杯11. 移液器仪器：1. 研钵2. 恒温水浴锅3. 酶标仪4. 分析天平四、实验步骤1. 酶的制备：1.1 称取适量糖化酶粉末，加入适量蒸馏水溶解。
1.2 将溶解后的酶液加入戊二醛，交联剂和硫酸铵，进行固定化处理。
1.3 将固定化酶用碳酸钠溶液洗涤，去除未固定的酶和杂质。
2. 酶活力测定：2.1 准备一定浓度的淀粉溶液，加入固定化酶，在恒温水浴锅中反应。
2.2 定时取样，用碘液检测淀粉浓度，计算酶活力。
2.3 重复实验，求平均值。
3. 半衰期测定：3.1 在恒温水浴锅中，将固定化酶与淀粉溶液混合，定时取样，测定酶活力。
3.2 以酶活力为纵坐标，时间（min）为横坐标，绘制酶活力随时间变化的曲线。
3.3 根据曲线计算半衰期。
五、实验结果与分析1. 酶活力测定结果：实验结果显示，固定化酶的活力与未固定化酶相近，说明固定化过程对酶活力影响较小。
2. 半衰期测定结果：实验结果显示，固定化酶的半衰期为30min，明显高于未固定化酶，说明固定化技术提高了酶的稳定性。
六、结论1. 糖化酶固定化技术是一种提高酶稳定性和重复使用性的有效方法。
2. 本实验中，戊二醛交联法成功固定了糖化酶，固定化酶的活力和稳定性均得到了提高。
七、实验讨论1. 实验过程中，固定化酶的活力和稳定性与固定化条件（如交联剂浓度、交联时间等）密切相关。
2. 在实际应用中，可根据需要选择合适的固定化方法和条件，以获得最佳的固定化效果。
固定化酶的四种方法[整理版]
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1吸附法:利用各种吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定的方法。
通常有物理吸附法和离子吸附法。
常用吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。
采用吸附法固定酶，其操作简便、条件温和，不会引起酶变性或失活，且载体廉价易得，可反复使用。
该方法最显著的优点是操作简便，但酶与载体结合不牢，极易脱落，所以它的使用受到一定的限制。
因此，人们不断尝试使用新的载体来解决这易脱落的问题。
通常，吸附法分为物理吸附法和离子吸附法。
物理吸附法:酶被载体吸附而固定的方法称为物理吸附法。
从载体对酶的适应性来看，这个方法效果是好的，酶蛋白的活性中心不易受破坏，酶的高级结构变化也不明显，但其缺点是酶与载体的相互作用较弱，被吸附的酶极易从载体表面上脱落下来，不能获得较高活力的固定化酶。
该方法常用的载体有活性炭、多孔陶瓷、纤维素及其衍生物、甲壳素及其衍生物等。
离子吸附法:将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体以静电作用力相结合的固定化方法。
该方法的处理条件温和，且酶的高级结构和活性中心的氨基酸很少发生变化，因而可以得到较高活性的固定化酶。
采用此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、B一淀粉酶、纤维素酶等。
2交联法是用双功能试剂或多功能试剂进行酶分子之间的交联，使酶分子和双功能试剂或多功能试剂之间形成共价键。
常用的交联剂是戊二醛，但单用戊二醛等试剂交联制备的固定化酶活力较低，因此常将此法与吸附法、包埋法结合使用，可以达到既提高固定化酶的活力，又起到加固的效果.酶蛋白的游离氨基、酚基、咪唑基及巯基均可参与交联反应。
3载体结合法最常用的是共价结合法，即酶蛋白的非必需基团通过共价键和载体形成不可逆的连接。
在温和的条件下能偶联的蛋白质基团包括：氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基。
参加和载体共价结合的基团，不能是酶表现活力所必需的基团。
此法曾先后用于3′-核糖核酸酶、5′-磷酸二酯酶和葡萄糖淀粉酶等的固定化。
糖化酶的生产工艺
糖化酶的生产工艺糖化酶是一种催化糖化反应的酶，可以将淀粉、纤维素等多糖分解成简单的糖类。
由于其广泛的应用于食品、饲料、制糖、生物燃料等领域，糖化酶的生产工艺变得越来越重要。
糖化酶的生产工艺一般分为以下几个步骤：1. 酶源的筛选和培养糖化酶可以从多种微生物中获得，如真菌、细菌、酵母等。
首先需要筛选出具有高效酶活性的酶源，并进行毒力测试排除可能的有害物质。
接着，将所选的酶源进行大规模培养，为后续酶的提取和纯化做准备。
2. 酶的提取和纯化培养出的菌液会经过离心等操作将酶从菌体中分离出来。
接下来，可以利用重组工程技术将酶基因引入适当的宿主细胞进行表达和分泌。
经过多次过滤、层析、浓缩等步骤，可以获得纯化后的糖化酶产品。
3. 酶活力的测试和调整酶的活力是衡量其催化能力的重要指标，因此需要对纯化后的酶进行活力测定。
如果发现酶活力较低或不稳定，可以通过改变培养条件、酶提取和纯化过程中的参数来进行调整，如改变pH值、温度、金属离子浓度等。
4. 酶的固定化处理（可选）为了提高酶在反应体系中的稳定性和重复使用性，可以将酶固定在某种载体上，如多孔陶瓷、聚合物凝胶或生物膜等。
固定化酶可以增加酶的使用寿命和催化效率，减少废液处理的复杂性。
5. 酶活性的保存和包装为了保持酶活性和延长保存期限，酶产品通常会经过冷冻干燥或冷藏等工艺进行保存。
同时，酶产品还需要进行适当的包装，以便在运输和储存过程中保护酶的完整性和稳定性。
总结起来，糖化酶的生产工艺包括酶源的筛选和培养、酶的提取和纯化、酶活力的测试和调整、酶的固定化处理以及酶活性的保存和包装等步骤。
每个步骤都需要进行精确控制，以确保酶产品的质量和稳定性。
随着科技的发展，糖化酶的生产工艺也在不断改进，可以预见未来糖化酶的生产将更加高效、环保和经济。
J-30 实训六 糖化酶的固定化(2)
5、取出，各加2mol/L硫酸溶液2ml，立即用0.05mol/L硫代硫酸钠标准溶液滴定，直至蓝色刚刚消失。
6、记录空白（不加酶）和加酶反应液所用硫代硫酸钠溶液体积。
三、实器材
1、仪器设备：1/100天平，量筒，恒温水浴锅，50mL比色管，碘量瓶，碱式滴定管。
2、试剂、材料：固定化糖化酶，乙酸—乙酸钠缓冲液（乙酸钠6.7g，溶于水，加冰乙酸2.6ml，水定容至1000ml，pH计校正到pH4.6），0.1mol/L和5ml/L NaOH溶液，0.1mol/L碘溶液，2mol/L硫酸溶液，0.05mol/L硫代硫酸钠溶液，20g/L可溶性淀粉。
五、结果计算
1、固定化糖化酶活力计算
酶活力（U/g）=(A－B)/C×90.05×(32/5)×2÷W=1152.64×( A－B)/C/W
式中：A—空白消耗硫代硫酸钠溶液体积，ml
B—样品消耗硫代硫酸钠溶液体积，ml
C—硫代硫酸钠标准液的浓度，mol/L
90.05—与1ml 1mol/L硫代硫酸钠标液相当的以克（g）表示的葡萄糖质量
四、实训操作
1、取甲、乙两只50mL比色管，分别加入可溶性淀粉25ml及乙酸缓冲液5ml，摇匀，于55℃恒温水浴中预热5min。
2、称重上次试验所得固定化糖化酶，记录总重量。取固定化糖化酶5g加入甲管中，然后两管同时置于55℃水浴，准确反应30min。间隔摇动，以利反应。
3、反应结束，立刻各加入5mol/L NaOH 2ml，摇匀，终止反应，取出冷却。
第三十讲
授课内容
实训六糖化酶的固定化（2）
松香基功能高分子稀土离子配合物固定化糖化酶
１１
系列微 生物分 泌 的具有 外 切 酶 活性 的胞 外 酶 ， 主要
用 于水解 淀粉 、 精 、 原等 制备葡 萄糖 。葡萄糖 是人 糊 糖
体和 动物体新 陈代 谢 中不 可 缺 少 的 营养 物 质 ， 是 运 也
一
Ｃｏ Ｏ — Ｍ — Ｐ Ｏ Ｒ
Ｃｏ Ｏ — Ｍ —— Ｐ — Ｒ０
Ｒｏ ｉ ａ ｅ ｕ ｃｉ ｎ ｌ ｏ ｙ ｅ ｓ ｓｎｂ ｓ ｄｆ ｎ ｔｏ ａ ｌ ｍ ｒ ｐ
Ｉ ｎ ｃｃ ｍ ｐ ｅ ｅ ｏ ｉ ｏ ｌ ｘ ｓ
Ｉ ｍｍ ｏ ｉｉｅ ｎ ｙ ｅ ｂ ｌｚ ｄｅ ｚ ｍ
动所需 能量 的重要来 源 。 同时葡萄糖 在 医药 、 品 、 食 制
革 及 印染 等工 业也 有 着广 泛 的应 用＿ 。用 酶法 代 替 Ｊ ］ 高压酸水 解法 生产 葡萄 糖 是 葡 萄糖 工 业 的重 大 突 破 ， 但 由于 游离酶存 在着 容易失 活 、 不能 回收 、 易与产 物 不 分 离 、 响产 品提纯与 质量等 缺 陷 ， 影 使得 工业生 产成 本
淀粉 酶 ， 简称 糖 化 酶 （ 写 Ｇ 或 Ｇ） 缩 Ａ 。糖 化 酶 是 由
一
较高 。酶 经 固定 化 后 ， 不仅 抗 性 增 强 、 可重 复使 用 ， 且
易与产 物 分离 ，因而固定 化糖化 酶 在工业 生 产 中受 到 广泛关 注Ｅ 。 。 ］ 作 者在 此 以天然 可再生 的松香 为原 料合成… 的聚 马 来 松香 己二 醇酯 （ ＭＨＥ 、 Ｐ ） 马来松 香 丙烯 酸 乙二醇 酯
结 果表 明 ， ｏｙ ＭＡＧ — ） ｎ固定 化 酶 的 性 能较 好 ， 适 温 度 为 ５ ℃ ， Ｐ ｌ（ Ｅ ＡＡ Ｙ Ｅ 最 Ｏ 比游 离酶 高 出 １ ℃ ； 适 ｐ 值 为 ５ ０ ； 复 Ｏ 最 Ｈ ．１重
糖化酶的固定化和应用实验
2074.23/90/12=1.92元
实验教师签字：田英华
院长签字：
2008年7月10日
AR500g
瓶
1
11.70
11.7
酒石酸钾钠
AR500g
瓶
2
33.26.60
26.6
氢氧化钠
AR500g
瓶
2
7.80
15.6
无水亚硫酸钠
500g
瓶
2
8.80
17.6
3.5-二硝基水杨酸
AR25g
瓶
1
27.00
27
95%乙醇
500ml
瓶
2
7.2
14.1
葡萄糖
500g
瓶
2
11.50
3
洗衣粉
袋
1
2.00
2
肥皂
块
1
1.80
1.8
线手套
副
3
2.20
6.6
胶手套
副
3
3.80
11.4
石棉网
12.5x12.5
个
5
3.50
17.5
乳胶管
6x9
卷
1
3.20
3.2
钢丝球
个
3
1.50
4.5
皮套
袋
1
8.00
8
不锈钢药勺
1x3
个
5
6.00
30
镊子
个
2
3.50
7
电炉子
800W
个
1
24.00
24
剪子
个
糖化酶及其在酒类中的应用
1
淀粉底 物法
1g 固体酶粉(或 1 mL 液体酶)于 40 ℃、pH 4.6 的条件下，1h分解 可溶性淀粉，产生1mg 葡萄糖，即为一个酶活 力单位，以 U/g(U/mL) 表示。 麦芽糖20g/L， pH4.30，反应温度 37 ℃，反应时间 30min下，每分钟裂 解1μmol麦芽糖所需 酶量为一个酶活力单 位 U。
2
糖化酶的分布
其他
细菌 真菌
人的唾液与动 物胰腺
3个属，3个种。 23个属，35个种。
3
糖化酶的结构
糖化酶一般包括催化域(catalyticdomain， CD)、淀粉结合域(Starch-binding domain， SBD)及连接CD与SBD的O-糖基化连接域(Ogly-cosylatedlinkerdomain)。
研究人
载体
处理方法
酶的性质
Weetall 等
先用氧化锆涂层多孔玻璃或多孔 陶瓷,然后硅烷化,最后用重氮基 多孔玻璃 、醛基和异硫氰基衍生物偶联糖 化酶。 纤维素
酶活较高,45℃下能连续 生产3个酶半衰期,估计 能使用5.3年。
黎高翔
酶活力10000u/g载体,相 对氨基苯磺酰乙基纤维素重氮化 对活力为15%～20%的糖 物偶联糖化酶 化酶 酸性水解淀粉聚丙烯腈 接枝共聚物的酶活最高, 失活率最低 活力为游离酶的67%
类型
GⅠ GⅡ
GⅢ
相对分 子质量
27000 53000
67000
等电点 含糖量
3.38 3.59
3.52
最适温 度
70℃ 70℃
70℃
8.7% 18.3%
13.6%
多型性的原因
基因调控、 转录的方式 不同。
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糖化酶的固定化及其在葡萄糖生产中的应用工艺姓名：吴启华 12生物工程1班学号：1214200027指导老师：柯德森、姚焱；同组者：严少杰，李海毅；时间:2015/11/30---2015/12/14摘要：利用有关固定化酶的理论和方法，研究固定化糖化酶的效率与糖化酶的浓度的关系。
本实验中测定固定化糖化酶偶联率、相对活力、活力回收来衡量其生产工艺的优劣，并探讨糖化酶的浓度对固定化效果及结合牢固程度的影响和验证固定化糖化酶催化生产葡萄糖的重复使用能力及其效率。
制备固定化糖化酶的方法为离子吸附法，并且使用DNS法测定固定化酶的活力。
结果显示：在该次实验中，固定化的效果较好；加入20g离子交换剂固定化酶的活力回收为79.1%，偶联率为90.46%，相对活力为82.58%，加入25g离子交换剂固定化酶的活力回收为85.2%，偶联率为92.76%，相对活力为92.54%。
重复使用葡萄糖固定化酶的过程中，固定化酶的利用效率降低。
酶与载体的浓度比例较高固定化酶葡萄糖生产效率高。
关键词：固定化，糖化酶，葡萄糖，酶活力1、前言：糖化酶也称葡萄糖淀粉酶（glucoamylase, EC.3.2.1.3）(淀粉-α-1，4-葡聚糖葡萄糖水解酶)，它能够催化淀粉液化产物---糊精及低聚糖进一步水解成葡萄糖。
糖化酶对底物的作用是由非还原端开始，将α-1，4-键和α-1，6键逐一水解，酶作用时糖苷键在C1-6间断裂，所产生的葡萄糖为 构型，几乎100%转变为葡萄糖。
工业生产使用的糖化酶主要来自曲霉、根霉及拟内孢霉，它被广泛应用于酿酒、制糖等行业，是非常重要的酶制剂。
酶的固定化方法通常按照用于结合的化学反应的类型进行分类，大致有三种：非共价结合法（结晶法、分散法、物理吸附法及离子结合法）；化学结合法（包括共价结合法及交联法）；包埋法（包括微囊法及网络法）。
本实验利用离子结合法制备固定化糖化酶。
离子结合法就是酶通过离子键结合于具有离子交换基的不溶性载体的固定化方法，常用的载体有：葡聚糖凝胶、离子交换树脂、纤维素等。
本实验以离子交换树脂为载体，应用离子交换结合法制备固定化酶，该法操作简便，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，酶的活性回收率高，可反复连续生产，对稀酶有浓缩作用，载体可再生使用。
其缺点是：载体和酶的结合力弱，容易受缓冲液种类或pH的影响，在高离子强度下进行反应时，酶易从载体上脱落。
使用共价结合法不会使酶容易脱落，国外研究者已研究出用氧化锆涂层多孔玻璃或多孔陶瓷，然后硅烷化，最后用重氮基、醛基和异硫氰基衍生物偶联糖化酶，结果使酶活较高，并且能连续生产3个酶半衰期。
在此次实验中还使用用DNS法测定固定化酶、残留酶、原酶的活力。
2、材料与方法：2.1材料：（1）糖化酶液，GF-201大孔强碱阴离子交换剂，葡萄糖，可溶性淀粉(20g/L)，CuSO4.5H2O，次甲基兰，酒石酸钾钠，氢氧化钠，亚铁氰化钾，乙酸，乙酸钠(配制pH4.6缓冲液)，无水乙醇，盐酸。
硫代硫酸钠（0.05M），碘溶液（次碘酸钠，0.1M）。
硫酸2M。
（2）酶液、固定化酶及固定化后的残留酶液2.2实验仪器：恒温水浴锅（可达99℃，5个），酸度计（3个），容量瓶，量筒，烧杯，移液管，比色管，漏斗，玻璃棒，锥形瓶，试管架，吸耳球，pH试纸，滤纸，离心机，离心管，分光光度计等。
2.3试剂：（1）标准葡萄糖溶液（1mg/mL）：精确称取100mg葡萄糖，用蒸馏水溶解并定容至100mL。
（2）3,5-二硝基水杨酸试剂：精确称取3,5-二硝基水杨酸1g，溶于20mL 2mol/L NaOH溶液中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100mL。
盖紧瓶塞，勿使CO2进入。
若溶液混浊可过滤后使用。
（3）0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液A液：（0.1mol/L 柠檬酸）：称取C6H8O7·H2O 21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L。
B液：（0.1mol/L柠檬酸钠）：称取Na3C6H5O7·2H2O 29.41g，用蒸馏水溶解并定容至1L。
取A液55mL与B液145mL混匀，既为0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液。
（4）1%淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100mL 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。
2.4操作步骤：2.4.1.试剂的配制：糖化酶液：市售商品化糖化酶,去离子pH7的磷酸缓冲液配制，根据标称的活力单位配制为1万单位/ml的溶液，离心去除不溶性杂质，共配4000ml, 4℃备用。
2mol/L氢氧化钠：8gNaOH-----100ml,共配3000ml，2mol/LHCL:17ml浓盐酸------100ml，共配3000ml，2.4.2．固定化酶实验步骤：载体的预处理：A：乙醇处理：15克湿离子交换剂---50ml烧杯加入30ml去离子水，搅拌，倒去水。
注入2倍体积无水乙醇，乙醇浸泡过夜（12h），然后用去离子水连续冲洗以除去乙醇。
B：碱处理：2倍体积（50ml）的2mol/lNaOH浸泡并充分搅拌，再以去离子水冲至pH6.0-7.0 C：酸处理:用2倍体积的2mol/L HCl溶液处理阴离子交换树脂，然后用去离子水洗至pH6.0。
D：重复B固定化酶实验：酶的固定化：100ml糖化酶液倒入贮液槽中，加入预处理的离子交换剂20g和25g，不断轻轻搅拌，开始进行酶的固定化，30min后过滤去未固定的酶液，测量固定化酶及反应后残留酶液活性。
2.4.3．葡萄糖标准曲线的制作取7支干净的具塞刻度试管（可用封口胶代替），编号，按表1加入试剂：表1 葡萄糖标准曲线制作试剂管号1 2 3 4 5 6 7葡萄糖标准液（mL）0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.0 蒸馏水（mL） 2.0 1.8 1.4 1.0 0.6 0.2 0葡萄糖含量（mg）0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.03,5-二硝基水杨酸（mL）2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0摇匀，置沸水浴中煮沸5min。
取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20mL。
以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定光密度。
以葡萄糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。
2.4.4．酶活力的测定：取6支干净的试管，编号，按表2进行操作。
表2 酶活力测定取样表操作项目淀粉酶活力测定固定化酶活力测量1%淀粉溶液（mL） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0预保温将各试管和淀粉溶液置于40℃恒温水浴中保温10min淀粉酶原液0.1 mL 0.1 mL 0.1 mL 0.2g0.2g0.2g（1，4二个空白，原酶空白和固定化酶空白的酶预先煮沸失活）保温在40℃恒温水浴中准确保温5min取反应液0.1ml,加入1.9ml水，迅速加入以下DNS 3,5-二硝基水杨酸（mL） 0 2.0 2.0 0 2.0 2.0将各试管摇匀，显色后进行比色测定光密度，记录测定结果，操作同标准曲线（煮沸，定容）。
根据以上反应吸光值的大小调整显色时加入的反应液的量，再加DNS显色，目的是使其达到合理的吸光值，以后者为准计算酶的活力。
2.5酶液浓度对固定化效率及固定化酶质量的研究方法制备固定化糖化酶,100ml糖化酶中分别加入预处理的离子交换剂20g和25g，不断轻轻搅拌，开始进行酶的固定化，30min后过滤去未固定的酶液，测量固定化酶及反应后残留酶液活性。
2.6固定化糖化酶生产葡萄糖工艺研究方法（1）制备固定化糖化酶。
（2）取20ml淀粉溶液，迅速倒入贮液槽中，控制其流出速度为1ml/min，用烧杯接流出的葡萄糖液。
测其葡萄糖含量。
（3）重复步骤（2）。
2.7结果计算在标准曲线上查出相应的葡萄糖含量（mg），按下列公式计算酶的活力。
酶活力单位（U）＝1 mg葡萄糖产生量/min酶活力单位的定义：在55C，pH4.6的条件下，在上述反应体系中水解可溶性淀粉产生1μmol葡萄糖，即为一个酶活力单位。
对固定化酶以μmol/(min.mg)表示（或U/( mg)）；对液相酶以U/ml或μmol/(min.ml)表示。
活力回收=固定化酶总活力/加入酶总活力*100%偶联率=载体上固定的蛋白量占加入蛋白总量的百分比（加入蛋白活力-上清液蛋白活力）/加入蛋白总活力*100%相对活力=固定化酶总活力/（加入酶总活力-上清液中末偶联的酶活力）*100%计算第二次重复使用固定化酶的生产效率为第一次使用的百分比3、结果与讨论：3.1葡萄糖标准曲线表3 葡萄糖标准曲线制作（葡萄糖含量/mg）试管号 1 2 3 4 5 6 7A540 0 0.034 00.58 0.141 0.250 0.370 0.465图1 葡萄糖标准曲线3.2酶活力测定下表中试管2为稀释10倍的淀粉酶原液取0.1mL测量所得的分光值，试管3为稀释5倍淀粉酶原液取0.1mL测量所得的分光值。
表4 淀粉酶催化淀粉产生葡萄糖分光值试管号空白25g 20gA5400 0.253 0.160表5固定化酶催化淀粉产生葡萄糖分光值试管号空白25g 20gA5400 0．124 0.115表6残留酶液催化淀粉产生葡萄糖分光值试管号空白25g 20gA5400 0．168 0.130数据处理：（1）淀粉酶（原酶）：试管2：葡萄糖的含量：(0.253+0.0011)/0.2344*100=110.4mg每ml酶液酶活力单位（U）：110.4/5=22.88原酶液总活力单位（U）：22.88*30=640.4试管3：葡萄糖的含量：(0.160+0.0011)/0.2344*100=68.2mg每ml酶液酶活力单位(U)：68.2/5=13.64原酶液总活力单位（U）：13.64*30=409.2（2）固定化酶：试管2：葡萄糖的含量：(0.124+0.0011)/0.2344*100=50.6mg每mL反应液酶活力单位（U）：50.6/5=10.120.2g样品酶活力单位（U）：10.1211g样品酶活力单位（U）：10.12*11/0.2=556.6试管3：葡萄糖的含量：(0.115+0.0011)/0.2344*100=66.69mg每mL反应液酶活力单位（U）：66.69/5=13.340.2g样品酶活力单位（U）：13.3410.2g样品酶活力单位（U）：13.34*10.2/0.2=680.19（3）残留酶液试管2：葡萄糖的含量：(0.0131+0.0011)/0.2344*110=6.66mg每ml酶液酶活力单位（U）：6.66/5=1.3327mL样品酶活力单位（U）:1.33*27=35.98试管3：葡萄糖的含量：(0.0152+0.0011)/0.2344*110=7.65mg每ml酶液酶活力单位(U)：7.65/5=1.5327mL样品酶活力单位（U）:1.53*27=41.31活力回收:试管2：固定化酶总活力/加入酶总活力*100%=556.6/686.4*100%=85.2% 试管3：固定化酶总活力/加入酶总活力*100%=680.2/745.8*100%=79.1%相对活力：试管2：固定化酶总活力/（加入酶总活力-上清液中末偶联的酶活力）*100%=556.6/（686.4-35.98）*100%=92.54%%试管3：固定化酶总活力/（加入酶总活力-上清液中末偶联的酶活力）*100%=680.2/（745.8-41.31）*100%=82.5%偶联率：试管2：（加入蛋白活力-上清液蛋白活力）/加入蛋白总活力*100%=（686.4-35.98）/686.4*100%=92.76%试管3：（加入蛋白活力-上清液蛋白活力）/加入蛋白总活力*100%=（745.8-41.31）/745.8*100%=90.46%分析以上所得结果可知：分析以上所得结果可知：加入25g交换剂固定化酶的活力回收为85.2%，偶联率为92.76%，相对活力为92.54%，加入20g交换剂固定化酶的活力回收为79.1%，偶联率为90.46%，相对活力为82.5%。