糖化酶活力测定

1.I2 与 NaOH作用: I2 +2 NaOH=NaIO +NaI +H2O 2.C6H12O6 与NaIO定量作用: C6H12O6 +NaIO =C6H12O7 + NaI 3. C6H12O6反应完后,剩余的NaIO 在碱性条件下发生歧化反应: 3 NaIO=NaIO3 +2 NaI 4.歧化产物在酸性条件下进一步 作用生成I2: NaIO3 +5NaI +6H2SO4=3I2 +6Na2SO4+3H2O 5.析出的I2 可用标准Na2S2O3 溶液 滴定之: I2 +2Na2S2O3 =Na2S4O6 +2NaI
反应试剂配制方法
（1）2%可溶性淀粉 称取可溶性淀粉2g（预先100℃烘干约2h至恒重），用少量蒸馏水调匀，徐徐倾入巳沸 的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却定容至l00ml，此溶液需当天配制。 （2）0.2mol/L pH4.6 醋酸钠缓冲液 称取醋酸钠(CH3COONa· 3H2O)2.722g，用蒸馏水溶解，定容至100m1。冰醋酸 (CH3COOH) 1.17m1定容至100ml。分别取醋酸钠49ml和醋酸51ml混匀。缓冲液以酸度计或精 密试纸校正pH。 （3）0.1mol/L碘液 称取13g碘及35g碘化钾，溶于100mL水中，稀释定容至1000mL，摇匀，贮存于棕色瓶中。

目前，工业中广泛使用黑曲霉(Aspergillus niger)、 泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、米根霉(Rhizopus oryzae)和臭曲霉(Aspergillus foetidus)为生产菌株来 发酵生产糖化酶。
今天的实验用酶就是利用黑曲霉变异菌株进行液体 深层通风发酵后提取获得。

糖化酶在工业生产中的应用： 糖化酶是淀粉糖化发酵生产酒精和葡萄糖浆的主 要酶类。特别是酿酒酵母利用淀粉原料发酵时， 淀粉液化后的糖化作用是必不可少的工序，因为 大多数酿酒酵母只能利用可发酵的糖进行酒精发 酵。 糖化酶不仅用于酒类、酒精生产和葡萄糖浆的制 取，还广泛地用于抗生素、氨基酸、有机酸的生 产。糖化酶是我国产量最大、应用最广的酶制剂 之一。
（4）0.1mo1/L氢氧化钠溶液
称取4g氢氧化钠加蒸馏水溶解，定容至1000ml。 （5）2mol/L硫酸溶液 量取浓硫酸5.6ml，慢慢加入于80 m1蒸馏水中，冷却后定容至l00ml，摇匀。 （ 6）0.1mol/L硫代硫酸钠溶液 配制：称取结晶硫代硫酸钠(Na2S2O3· 5H2O) 24.82g和碳酸钠约0.2g（硫代硫酸钠溶液在 pH9-10时最稳定）溶于煮沸后冷却的蒸馏水中（无CO2），定容至1000ml，即得0.1 mol/L硫 代硫酸钠溶液。贮于棕色瓶中密封保存，配制后应放置一星期标定使用。
次碘酸钠法：
碘与 NaOH 作 用 能 生成 NaIO ， 而 葡 萄 糖 能 定 量地 (1:1) 被 NaIO 氧化 在酸性条件下，未与 C6H12O6 作用 的 NaIO 可 转变成I2 析出,因此只 要用 Na2S2O3 标准溶液 滴定析出的 I2 ，便可 计算出 未 参 与 反 应 的 NaIO ，由此推导出糖 化酶催化所产生的 C6H12O6 的含量。



②糖化酶的作用机制
糖化酶是由一系列微生物分泌的具有外切酶活性的 胞外酶。糖化酶的主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳 链上的非还原性末端（整个碳链只有一个还原端，与之 相对的都是非还原端）依次水解a- 1,4 糖苷键, 切下一个 个葡萄糖单元，并像β- 淀粉酶一样, 使水解下来的葡萄 糖发生构型变化，形成β- D- 葡萄糖。对于支链淀粉， 当遇到分支点时，它也可以水解a- 1,6 糖苷键，由此将 支链淀粉全部水解成葡萄糖。糖化酶也能微弱水解a- 1,3 连接的碳链，但水解a- 1,4 糖苷键的速度最快，它一般 都能将淀粉百分之百地水解生成葡萄糖。
四、操作步骤
1. 取7个带塞的试管（其中3个测今年批次的酶活、 另外3个测去年批次的酶活、1个作空白对照）， 分别吸取2%可溶性淀粉液5ml，加入pH4.6醋酸 缓冲液2.5ml，混匀后于40 ℃水浴中预热10min。 2. 加入酶液0.5ml（空白对照组以煮沸失活的酶液 代替）于40 ℃，反应10min；反应结束时，立 即于沸水浴加热5min使酶失活(此时应将试管的 塞子打开）。
N——硫代硫酸钠的当量浓度。 180.1——葡萄糖的摩尔质量。
8/5——表示从8ml酶反应体系取出5ml反应液。幻灯片 12
2——所加酶液为0.5ml，按定义为1ml。 60/10——表示酶反应时间为10min，按定义为1h。
（2）在上述条件下， 1ml酶液每分钟催化2%淀 粉溶液水解生成1μ mol葡萄糖的酶量定义为的应用与生产

糖 化 酶 ， 全 名 葡 萄 糖 淀 粉 酶 （ Glucoamylase EC.3.2.1.3 ），又名淀粉葡萄糖苷（ Amyloglucosidase ） 或γ-淀粉酶（γ-amylase），是一种含有甘露糖、葡萄糖、 半乳糖和糖醛酸的糖蛋白，分子量在60～1000kDa 之间。 因发酵工业中大量用作淀粉糖化剂，习惯上简称糖化酶。
3.取上述反应液5ml于三角瓶中，加入0.1N碘液 5ml，缓慢加入0.1mol/L NaOH溶液 5ml (注意: 加碱速度不能过快,否则过量NaIO 来不及氧化 C6H12O6 而歧化为不与C6H12O6反应的NaIO3 和 NaI ,使测定结果偏低) ，摇匀后在暗处放置 15min后加入2mol/L硫酸2ml； 4.以0.5%可溶性淀粉为指示剂（4-5滴即可），用 0.1N硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色消失为终点。 记录0.1N硫代硫酸钠消耗的毫升数：酶液样品 （A）、空白对照（B）；
酶活力单位（U/ml）=（B－A）×10-3 ×（N/2）×（8/5） ×106×2 ×（1/10） 式中符号与前式相同， 其中： 10-3—— ml换算成L。 106—— μ mol换算成mol。
五、实验报告
将重复3次测定的糖化酶活力结果记录在 实验报告中，并按提供的两种计算公式分 别计算出酶活力。
5.计算： (1)在上述条件下，1ml酶液每小时催化2%淀粉溶 液生成1mg葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位：
酶活力单位（U/ml）=（B－A）×（N/2）× 180.1×（8/5）
×2×（60/10）
式中: B——空白滴定消耗的硫代硫酸钠毫升（ml）数；
A——酶液滴定消耗的硫代硫酸钠毫升（ml）数（取3次滴定的平均值）；
六、问题和思考
1. 糖化酶的作用有何特点？ 2. 你认为实验过程中哪些步骤关键，应注意 些什么问题？ 3. 为什么用失活酶液作为空白对照而不用蒸 馏水？ 4. 两个计算糖化酶活力的公式中各项的意义 及两者各有何特点？
七、注意事项
1. 注意操作安全; 2. 滴定操作时要仔细和准确。糖化酶水解可 溶性粉溶液与滴定后至蓝色消失的溶液两 者色泽的对比。 3. 实验完成以后及时清扫整理； 4. 认真完成实验报告 。
（7）0.5%可溶性淀粉：称取0.5 g可溶性淀粉，用少许水调匀，倾入80 ml沸水中，继续煮 沸至透明，冷却后定容至100 ml。
对 照
I2
组
NaIO
实 验 组
I2
NaIO
完全歧化反应， 无葡萄糖
NaIO3
NaIO另一部分 歧化反应 生成NaIO3
NaIO一部分与 葡萄糖反应
I2
I2
三、试剂与器材
1.糖化酶试剂； 2.微量滴定管、滴定台、试剂瓶、试管、三角 瓶、pH计、电子天平； 3.试剂 2%可溶性淀粉溶液；pH4.6、0.1mol/L的醋 酸缓冲液； 0.1mol/L碘液；0.1mol/L氢氧化 钠溶液； 2mol/L硫酸溶液； 0.1N硫代硫酸 钠溶液；0.5%淀粉指示剂。
端
还 原
③酶活测定方法测定糖化酶的方法有次碘 酸钠法、兰–爱农法（ＳＰ法） 、Schoorl 法（ＤＵ法）和对硝基苯酚葡萄糖法（ＮＰ Ｇ法）、3,5-二硝基水杨酸(DNS) 等方法。 本试验测定糖化酶活力采用次碘酸钠法。 糖化酶以可溶性淀粉为底物在一定条件下 （pH范围是4～6, 温度范围是40～60℃）进 行反应，生成的葡萄糖用次碘酸钠法定量测 定。以单位时间内分解α –１，４糖苷键生 成葡萄糖所需的酶量为酶的活力单位。
实验三
糖化酶活力的测定
指导老师： 孙运军
研 究 生： 赵 渊
徐 妙
一、目的和内容
目的：学习测定糖化酶活力的原理并掌握 测定糖化酶活力的方法 内容：１. 学习糖化酶活力的原理． ２. 测定并计算糖化酶活力．
二、糖化酶简介以及其活性的测定原理

① 糖化酶的应用及生产 ② 糖化酶的催化原理 ③ 酶活测定方法
注释：
在这一系列的反应中，1mol葡萄糖与1mol NaIO作用，而1molI2产生1molNaIO，因此， 1mol葡萄糖与1molI2 相当。只要得出对照
组和实验组所消耗的硫代硫酸钠体积， 两者相减就可以得出与葡萄糖反应的那 部分次碘酸钠的量，从而可以确定酶解 生成的葡萄糖的量，从而计算出酶活。