微生物菌种分离和鉴定技术
实验五 微生物的分离、接种及培养法
实验五微生物的分离、接种及培养法一目的要求1.掌握倒平板的方法、划线分离法、稀释平板分离法和菌落（活菌）计数法。
2.熟练掌握微生物的接种技术，学会微生物的一般培养方法和无菌操作技术。
二实验原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
常用的分离方法有： 1) 平板划线分离法；2）稀释平板分离法。
在食品发酵工业中，通过微生物的分离、纯化，选育优良的微生物菌种，以提高产品的质量和产量；在食品卫生管理方面，需要进行微生物检测，必须将微生物单一分离出来，加以鉴别和研究。
土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。
因此土壤是微生物多样性的重要场所，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。
微生物的分离和接种是微生物学中重要的技术之一，需要严格的无菌操作，否则使得微生物实验毫无意义。
三实验材料1.菌种：葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、酵母菌、毛霉、曲霉、青霉等含菌样品。
2.培养基：肉汤蛋白胨培养基（斜面、平板）、肉汤蛋白胨液体培养基、蔡氏琼脂培养基（斜面、平板）。
3.土壤（自带）或其他物品；无菌水，无菌培养基，无菌吸管，无菌三角瓶等。
四实验内容与步骤（一）微生物的分离技术1. 平板划线分离法借助划线使混杂的微生物在平板的表面分散开，以获得单个菌落，从而达到分离的目的。
具体方法如下：倒制平板→制备含菌样品稀释液→划线→倒置适温培养→观察记录（1)倒制平板：将固体培养基熔化→冷却至 50-55℃→注入培养皿内 15ml（无菌操作）→旋匀→静置凝固→即成平板→在皿盖边贴标。
（2)含菌样液制备：样品少许（1-10g），加入盛有无菌水的试管内，摇匀，制成菌悬液即可，能直接划线的样品（如体液、黏液、污水等），可省去这操作。
（3)划线：左手持平板，接种环经灼烧灭菌后，以无菌操作取样，迅速将接种环伸入培养皿，轻轻划线（切勿把平板表面划破）。
然后将培养皿倒置放入恒温培养箱37℃，培养24-48 小时，观察平板上出现的现象，注意菌落的形状，并做记录。
分离培养的操作方法
分离培养的操作方法分离培养是一种常用的微生物学实验技术，它可以将混合菌群中的不同菌种分离出来，单独培养，以便于对不同菌种进行研究和鉴定。
本文将介绍分离培养的操作方法。
一、准备工作1.准备培养基：根据需要分离的菌种选择适当的培养基，如营养琼脂、血琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂等。
2.准备培养器具：培养皿、移液器、灭菌器、无菌吸管、无菌匀板器等。
3.准备消毒液：如70%乙醇、84消毒液等。
4.准备样品：从需要分离的样品中取一定量的菌落或液体悬浮液。
二、分离操作1.表面分离法：将样品涂布在培养基表面，用无菌匀板器均匀涂布，然后在培养皿中培养。
此法适用于分离菌落较大的菌种。
2.液体分离法：将样品加入到含有适当营养物质的液体培养基中，摇晃培养，使菌落分散在培养基中，然后取适量的液体培养基接种到新的培养基中，重复操作数次，直到分离出单一菌种。
3.稀释分离法：将样品加入到含有适当营养物质的液体培养基中，进行逐级稀释，然后取适量的液体培养基接种到新的培养基中，重复操作数次，直到分离出单一菌种。
4.过滤分离法：将样品过滤，将过滤液接种到含有适当营养物质的液体培养基中，摇晃培养，然后取适量的液体培养基接种到新的培养基中，重复操作数次，直到分离出单一菌种。
三、培养条件1.温度：根据菌种的生长特性选择适当的温度，如常温、37℃等。
2.气氛：根据菌种的生长特性选择适当的气氛，如需氧气、需二氧化碳等。
3.时间：根据菌种的生长速度选择适当的培养时间，如24小时、48小时等。
四、鉴定分离菌株1.形态学鉴定：观察菌落形态、大小、颜色等特征。
2.生理生化鉴定：通过菌株的代谢特性、生长条件等进行鉴定。
3.分子生物学鉴定：通过PCR、DNA测序等技术进行鉴定。
分离培养是一种重要的微生物学实验技术，可以将混合菌群中的不同菌种分离出来，单独培养，以便于对不同菌种进行研究和鉴定。
在进行分离培养时，需要注意无菌操作，选择适当的培养基和培养条件，以及对分离出的菌株进行鉴定。
微生物分离鉴定步骤
微生物分离鉴定步骤
微生物的分离和鉴定是微生物学研究中非常重要的步骤，它可
以帮助我们了解微生物的种类和特性。
通常，微生物的分离和鉴定
包括以下步骤：
1. 样品收集，首先需要收集来自环境、生物体表面或其他来源
的微生物样品。
这可能涉及到采集土壤、水样、食品、空气或生物
体组织等样品。
2. 稀释和接种，将样品进行适当的稀释，然后在培养基上进行
接种。
这有助于分离出单一的微生物菌落，以便进行后续的鉴定。
3. 培养，接种后，将培养皿放入恒温培养箱中进行培养。
不同
类型的微生物可能需要不同类型的培养条件，如温度、氧气含量等。
4. 分离，在培养一段时间后，可以观察到菌落的形成。
选择单
一的菌落，进行分离培养，以获得纯培养物。
5. 形态学特征观察，观察微生物的形态学特征，包括细胞形态、大小、颜色等，可以初步了解微生物的特征。
6. 生理生化特性测试，进行一系列生理生化特性测试，如对不同营养物质的利用、酶活性、氧气需求等，以进一步了解微生物的特性。
7. 分子生物学鉴定，利用分子生物学方法，如16S rRNA序列分析，可以对微生物进行更精确的鉴定，包括确定其属种和种的分类位置。
以上是常规的微生物分离和鉴定步骤，通过这些步骤可以全面地了解微生物的特征和分类位置。
值得注意的是，不同的微生物可能需要不同的鉴定方法，有时可能需要结合多种手段进行鉴定，以确保鉴定结果的准确性。
细菌的分离、培养和鉴定
② 加富培养基：在基础培养基中加入某些特殊营养物质 （如血液/血清、酵母浸膏或生长因子等）；用以培养对 营养要求高的微生物（2216E）
③ 选择培养基：利用细菌对某种或某些化学物质的敏感性 不同；在培养基中加入这类物质，利于所需分离的细菌生 长，而抑制不需要的细菌生长，从而达到分离某种微生物 的目的。（中国科学院海洋研究所专利：一种定量检测鳗弧 菌的选择性培养基及其制备）【利用鳗弧菌对氨苄青霉素的抗性 】
④ 鉴别培养基：是一类含有某种特定化合物或试剂的培养
基。某种细菌在这种培养基上培养后，产生某种代谢产物，
能与这种特定化合物或试剂发生某种明显的特征性反应；
从而达到区分不同的微生物.。（TCBS）
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ ❖ 病料在接种培养基后，经过一段时间，应检查其 生长状况。首先用肉眼检查有无细菌生长；若有， 则需进一步检查菌落是否纯一。形态特征包括： 大小、形状、突起或扁平、凹陷、边缘（光滑、 波形、锯齿状、卷发状等）、颜色（红色、灰白 色、黄色等）、表面（光滑、粗糙等）、透明度 （不透明、半透明、透明等）和粘度等
水可直接涂布平板
• 平板置于28℃ 恒温培养箱培养24h，观察细菌生
长状况
（注意：操作台在使用前后都需要用酒精棉球擦拭
台面，保持操作台的整洁）
.
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二、细菌的培养
培养基：培养基是指由人工方法配合而成的，用于微生物 培养、分离、鉴别、研究和保存菌种用的混合营养制品。
培养基的种类
① 基础培养基：含有一般细菌生长繁殖需要的基本营养物 质；可作为一些特殊培养基的基础成分（普通营养琼脂）
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生化鉴定管
各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养 基质的分解能力也不一样，因而代谢产物 或多或少地各有区别，可供鉴别细菌之用
微生物菌种分离和鉴定技术
微生物菌种鉴定技术
表征（表型）特征 形态特征 生理和代谢特征 生态特征
遗传（基因型）特征 蛋白质比较 核酸碱基组成 核酸序列
分子标尺
多相鉴定技术 Polyphasic Identification
新型显色培养基：
利用微生物自身代谢产生的酶与相应显色底物反应显色的原理来检测微生物 的培养基 。
微生物快速分离、计数方法
Petrifilm Plate (3M)
微生物快速分离、计数方法
3M Petrifilm Plate
Aerobic Count Plate Coliform Count Plate Rapid Coliform Count Plate E. coli /Coliform Count Plate Enterbacteriaceae Count Plate Yeast and Mold Count Plate Staph. aureus Express Count Plate Environmental Listeria Plate
单细胞（孢子）分离
选择培养基分离
传统选择性培养基
血平板：适于各类细菌的生长，一般细菌检验标本的分离，都应接种此平板。 巧克力血平板：其中含有V和X因子，适于接种疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的标
本。 中国蓝平板或伊红美蓝平板：可抑制革兰阳性细菌，有选择地促进G-菌生长，
是较好的弱选择性培养基。 麦康凯平板：具中等强度选择性，抑菌力略强，有较少革兰阴性菌不生长。 SS琼脂：有较强的抑菌力，用于志贺菌和沙门菌的分离。 碱性琼脂：用于从粪便中分离霍乱弧菌及其它弧菌。 血液增菌培养基：用于从血液、骨髓中分离常见病原菌。 营养肉汤：用于标本及各类细菌的增菌
菌种的分离与纯化
接种、分离纯化和培养技术一、接种将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。
１、接种工具和方法在实验室或工厂实践中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。
由于接种要求或方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之分。
有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。
在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。
（图３－３）图３－３接种和分离工具1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀常用的接种方法有以下几种：１）划线接种这是最常用的接种方法。
即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。
常用的接种工具有接种环，接种针等。
在斜面接种和平板划线中就常用此法。
２）三点接种在研究霉菌形态时常用此法。
此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。
除三点外，也有一点或多点进行接种的。
３）穿刺接种在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。
做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。
用的培养基一般是半固体培养基。
它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。
４）浇混接种该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45°C左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。
待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。
５）涂布接种与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。
６）液体接种从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。
７）注射接种该法是用注射的方法将待接的微生物转接至活的生物体内，如人或其它动物中，常见的疫苗预防接种，就是用注射接种，接入人体，来预防某些疾病。
分离和鉴定微生物的方法
分离和鉴定微生物的方法微生物是一种充满生命力的生物体，它们无处不在，在自然界中发挥着不可替代的作用。
但是，随着人类活动的不断扩大，人们逐渐认识到微生物对人类生命健康的潜在威胁。
因此，需要分离和鉴定微生物，以了解其特征和功能，从而保护人们的健康与安全。
一、分离微生物的方法分离微生物是微生物学研究的基础，它通常包括以下步骤：1. 采样：根据研究目的和样本来源的不同，可以选择不同的采样方法，如直接采集、培养物、土壤、水和空气等。
2. 稀释涂布：根据采样量的大小和样本来源的不同，可以将样本进行适当的稀释处理，然后涂布在培养基上。
3. 培养：将涂布的样本置于适当的培养条件下，如温度、湿度、氧气含量和营养成分等，培养期间观察和记录微生物的生长情况。
4. 纯化：从培养物中选取单一的菌种，通过传代和筛选的方法，使其获得纯种状态。
5. 保存：对保留的纯菌种进行存储和传承。
二、鉴定微生物的方法鉴定微生物是指对已分离出的微生物进行鉴定和分类，以确定其种属、亚种或生物型。
通常包括以下步骤：1. 形态学特征：通过对微生物形态的观察和描述，如大小、形状、色素、菌落形态等，初步鉴定其种属。
2. 生理生化特征：利用微生物生长与代谢的特性，如对不同碳源、氮源和微量元素的利用，产生的酶类和代谢产物，以及对常见药物的敏感性和抗性等，进一步鉴定其亚种或生物型。
3. 分子生物学特征：利用分子生物学技术，如DNA序列分析、PCR扩增和序列比对等，对微生物进行基因型鉴定，解决传统鉴定技术无法区分的问题。
三、常见的微生物分离和鉴定方法1. 培养方法：是微生物分离和鉴定的最基本和重要方法，主要应用于细菌和真菌的鉴定。
包括富营养培养基和选择性培养基，常用的有Mcleod、MacConkey、Sabouraud等。
2. 快速检测方法：是以快速、高效、准确为主要特点的微生物检测方法。
包括免疫学方法、核酸检测方法、质谱分析方法等。
3. 超微结构分析方法：是通过电子显微镜观察微生物的超微结构，如形态、细胞壁、胞膜、内质网、菌核等，进一步鉴定和分类微生物。
微生物的分离与培养技术原理及其应用-文档资料
微生物的分离与培养技术原理及其应用-文档资料
微生物的分离与培养技术是微生物学实验室中最基本、最重要的实验技术之一。
其主要原理是将混合微生物群落分离为单一的微生物菌落，并在适宜的环境条件下使其生长繁殖形成单一菌种培养物，以便进行鉴定和研究。
1.微生物的分离技术
（1）稀释涂布法：将微生物混合液逐渐稀释，然后取一定量的稀释液涂布在富养基平板上，待菌落形成后，挑取单一菌落进行培养和研究。
（2）过滤法：利用微孔膜或滤纸将混合液过滤，将过滤后留在微孔膜或滤纸上的微生物进行培养和研究。
（1）液体培养：将微生物接种在富足的液体富养基中，置于适当的温度、光照和通气条件下进行培养。
（3）混合培养：将两种或以上的微生物同时接种在同一富养基上进行培养，这一技术可同时培养多种微生物，缩短实验时间。
3.技术应用
微生物的分离与培养技术在微生物学研究、医学诊断、生物工程和食品工业等领域都得到广泛应用。
（1）微生物学研究：分离单一菌种进行研究，为微生物学研究提供基础。
（2）医学诊断：从临床样品中分离出致病微生物进行培养与鉴定，有助于快速准确地诊断、鉴定和治疗病原微生物感染。
（3）生物工程：在微生物培养基中添加营养物质，用微生物进行合成、代谢和分泌等反应。
（4）食品工业：将微生物培养在富有营养的富养基中进行发酵，生产出发酵食品。
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基因型鉴定技术水平
不同指纹图谱和DNA分析技术的鉴定水平
多相鉴定实例
ATCC16404黑曲霉 Aspergillus niger
2007年 Aspergillus brasiliensis sp.nov.新种发表 2008年 ATCC 16404 鉴定为 Aspergillus brasiliensis sp.nov. 2010年 WDCM 将ATCC 16404 更名 2010年 USP 将ATCC 16404 更名
表 ITS序列特殊位点碱基差异 Table Difference of base position in ITS sequence
图：ATCC 16888和ATCC 16404的培养特征和显微形态 a´nos Varga, Sa´ndor Kocsube´ , Bea´ ta To´ th, et al. Aspergillus brasiliensis sp. nov., a biseriate black Aspergillus species with world-wide distribution. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2007, 57: 1925–1932
单细胞（或单孢子）分离法是采取显微分离法
从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进 行培养以获得纯培养。 较大的微生物，可采用毛细管提取单个个体。 个体相对较小的微生物，需采用显微操作仪， 在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取 单个微生物细胞或孢子以获得纯培养 。 单细胞分离法对操作技术有比较高的要求。
2、玻璃三角涂棒浸入酒精 3、沾有酒精的涂棒在火焰上灼烧后使其冷却 4、无菌涂棒将样品均匀涂布琼脂培养基表面，适当条件下培养
平板划线法
斜线法
曲线法
方格法 放射法
四格法
平板划线法
斜线法：
用接种环以无菌操作挑取菌悬液一环，先在 平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条， 再转动培养皿70°角，并将接种环上剩余物 烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二 次平行划线，再用同法通过第二次平行划线 部分作第三次平行划线和通过第三次平行划 线部分作第四次平行划线。
多相分类 （Polyphasic taxonomy）
根据相似性或亲缘关系 确定分类类群（分类单元）
鉴定 （Identificaiton）
确定新的分离物属于 已知分类单元的过程。
微生物菌种鉴定技术
未知菌种鉴定:它是什么菌？
微生物菌种鉴定
常规鉴定
目标菌检验：它是不是某一种菌?
控制菌：
大肠埃希菌（ Escherichia coli） 致病菌：
微生物菌种检验
大肠埃希菌（ Escherichia coli） 大肠菌群（Coliform） 大肠菌群（Coliform） 沙门菌（Salmonella） 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 沙门菌（Salmonella） 单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogene 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa） 阪岐肠杆菌（Enterobacter sakazaki） 致贺氏菌（ Shigella ） 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus） 空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni） 梭菌（Clostridium） 产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens） 蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus ） 白假丝酵母（Candida albicans）
摇匀、冷凝 在琼脂柱表面倾倒一层灭菌 液体石蜡和固体石蜡的混合物
培养后，菌落形成在琼脂柱的中间
液体培养基分离
不能在固体培养基上生长的微生物仍需要用液
体培养基分离来获得纯培养。
稀释法是液体培养基分离纯化常用的方法。
在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数
（一般应超过95%）表现为不生长。
单细胞（孢子）分离
图1: 基于ITS DNA序列的黑色曲霉N-J树 Figure 1: A Neighbor Joining Tree of Black Aspergilli based on Their ITS DNA Sequences. 注：图片来源于Reclassification of ATCC® 16404TM and ATCC® 9642TM as Aspergillus brasiliensis. Pharmaceutical Microbiology Forum Newsletter, 2008, Vol. 14 (10): 2-14
ATCC16404 黑曲霉 Aspergillus
niger
2007年 Aspergillus brasiliensis sp.nov.新种发表 2008年 ATCC 16404 鉴定为 Aspergillus brasiliensis sp.nov. 2010年 WDCM 将ATCC 16404 更名 2010年 USP 将ATCC 16404 更名
微生物菌种鉴定技术
表征（表型）特征 形态特征 生理和代谢特征 生态特征 遗传（基因型）特征 蛋白质比较 核酸碱基组成 核酸序列
分子标尺
多相鉴定技术 Polyphasic Identification Technology
Erko Stackebrandt, DSMZ, Braunschweig, Germany
规范的检测鉴定方法 GB/T 4789.3-4.5.6.7.9.10.13.14.30.40
常规鉴定
首先掌握菌株的基本特征，如细胞的形状、革兰 氏染色及其他形态学特征；营养类型、需氧性等 生理生化特征。 在此基础上查阅分类（鉴定）手册，确定菌株属 于哪一大类（群、组），进行特征测定。 根据测定结果逐步缩小菌株的归属范围，初步确 定科、属。 如菌株需鉴定至种，则进一步测定种的鉴别特征。 如鉴定结果涉及新的分类单元，则进行包括基因 型在内的全面鉴定。
单细胞（孢子）分离
选择培养基分离
传统选择性培养基
血平板：适于各类细菌的生长，一般细菌检验标本的分离，都应接种此平板。 巧克力血平板：其中含有V和X因子，适于接种疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的标 本。 中国蓝平板或伊红美蓝平板：可抑制革兰阳性细菌，有选择地促进G-菌生长， 是较好的弱选择性培养基。 麦康凯平板：具中等强度选择性，抑菌力略强，有较少革兰阴性菌不生长。 SS琼脂：有较强的抑菌力，用于志贺菌和沙门菌的分离。 碱性琼脂：用于从粪便中分离霍乱弧菌及其它弧菌。 血液增菌培养基：用于从血液、骨髓中分离常见病原菌。 营养肉汤：用于标本及各类细菌的增菌
微生物快速分离、计数方SUI)
微生物快速分离、计数方法
Compact Dry (NISSUI)
微生物菌种鉴定技术
细菌
真核生物
古菌
分类等级
界（Domain）
门（Phylum） 纲（Class）
科（Family） 属（Genus）
种（Species）
用于鉴定的生理生化特征
碳源和氮源 细胞壁组成
能源 发酵产物 一般营养类型 最适生长温度和范围 发光 能量转换机制 贮藏内含物
运动性 渗透耐性
氧关系 最适pH和生长范围 光合作用色素 盐需求及耐性 次级代谢产物形成 对代谢抑制剂和抗生素的敏感性
微生物菌种鉴定的问题
随着分类学的发展，微生物分类越来越多的以核 酸序列系统发育分析来建立新的分类单元和对原 有分类单元进行调整。 产生新的问题：将有越来越多的分类单元不能只 以表型特征进行鉴别，必须结合基因型测定才能 鉴定。
新型显色培养基：
利用微生物自身代谢产生的酶与相应显色底物反应显色的原理来检测微生物 的培养基 。
微生物快速分离、计数方法
Petrifilm Plate (3M)
微生物快速分离、计数方法
3M Petrifilm Plate
Aerobic Count Plate Coliform Count Plate Rapid Coliform Count Plate E. coli /Coliform Count Plate Enterbacteriaceae Count Plate Yeast and Mold Count Plate Staph. aureus Express Count Plate Environmental Listeria Plate
微生物菌种鉴定技术
1923(1)、1925(2)、1930(3)、1934(4)、1939(5)、1948(6)、1957(7)、 1974(8)、1994(9)
伯杰氏鉴定细菌学手册
Bergey's Manual of Determinative Bacteriology
伯杰氏系统细菌学手册
Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 1984-1989(1)、2001-2010(2)
三界系统发育树
“种”微生物基本分类类群
微生物菌种鉴定技术
“种” 的定义：一个种（基因型种）是有相似 G+C组成并通过DNA杂交试验判断有70%或 更大相似性的菌株的集合。
表征分类 （Phenotic system ）
数值分类 （Numerical Taxonomy）
系统发育分类 （Phylogenetic）
方法冗长 结果不稳定 易污染
很多细菌不能 在土豆上生长
明胶高温易溶化 不能37°C培养