CRISPR-Cas9基因敲除小鼠(行业精制)
《2024年利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》范文
《利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》篇一一、引言基因编辑技术近年来在生物学和医学领域取得了巨大的突破，其中CRISPR-Cas9系统因其高效、精确的特性，已成为基因编辑的主要工具之一。
本文旨在探讨利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系的方法和过程，为基因编辑技术的进一步应用提供参考。
二、DUSP9基因与小鼠胚胎干细胞DUSP9基因是一种重要的蛋白磷酸酶基因，其编码的蛋白在细胞信号传导过程中具有重要作用。
小鼠胚胎干细胞（Mouse Embryonic Stem Cells, mESCs）是研究发育生物学和基因编辑的重要工具。
通过构建DUSP9基因敲除的小鼠胚胎干细胞系，可以研究DUSP9基因在细胞发育、分化以及疾病发生过程中的作用。
三、CRISPR-Cas9系统简介CRISPR-Cas9系统是一种基于细菌免疫系统的基因编辑技术，其原理是通过将特定的RNA与Cas9蛋白结合，形成复合物，然后识别并切割DNA序列，从而实现对基因的敲除或修改。
CRISPR-Cas9系统具有精确度高、效率高、成本低等优点，是现代基因编辑的主要手段。
四、构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系的步骤1. 载体构建：设计并合成针对DUSP9基因的特异性gRNA 序列，并将其与Cas9蛋白的表达载体一起构建成CRISPR-Cas9表达系统。
2. 细胞培养与转染：将小鼠胚胎干细胞培养至适当状态，然后利用转染技术将CRISPR-Cas9表达系统导入细胞中。
3. 基因编辑：通过CRISPR-Cas9系统识别并切割DUSP9基因的DNA序列，实现DUSP9基因的敲除。
4. 克隆筛选与鉴定：筛选并培养获得成功的DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞克隆，通过PCR、测序等方法鉴定敲除效果。
5. 细胞系建立与保存：将成功构建的DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系进行保存与扩大培养，以备后续研究使用。
《利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》范文
《利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》篇一一、引言随着基因编辑技术的发展，CRISPR-Cas9系统已成为一种强大的工具，用于在生物医学研究中精确地编辑基因组。
DUSP9基因作为一种重要的基因，其功能在多种生物学过程中起着关键作用。
因此，构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系，对于研究DUSP9基因的功能及其在疾病发生发展中的作用具有重要意义。
本文旨在详细介绍利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系的过程。
二、材料与方法1. 材料小鼠胚胎干细胞（mESCs）、CRISPR-Cas9系统、相关基因编辑工具、培养基、生长因子等。
2. 方法（1）设计CRISPR-Cas9系统：根据DUSP9基因的序列信息，设计合适的CRISPR-Cas9系统，包括sgRNA和Cas9蛋白。
（2）制备mESCs细胞：培养mESCs细胞至合适的状态，以便进行基因编辑。
（3）转染与编辑：将CRISPR-Cas9系统转染至mESCs细胞中，利用Cas9蛋白对DUSP9基因进行切割。
（4）筛选与鉴定：通过PCR、Western blot、qRT-PCR等方法，筛选出成功敲除DUSP9基因的mESCs细胞，并进行鉴定。
三、实验过程1. 设计并构建CRISPR-Cas9系统，选择合适的sgRNA序列和Cas9蛋白表达载体。
2. 培养mESCs细胞至合适的状态，进行转染。
3. 观察转染后的细胞生长情况，确保Cas9蛋白的表达。
4. 利用PCR、Western blot、qRT-PCR等方法筛选出成功敲除DUSP9基因的mESCs细胞。
5. 对筛选出的细胞进行扩增培养，并保存于液氮中备用。
四、结果与讨论1. 结果（1）成功构建了CRISPR-Cas9系统，并将其转染至mESCs 细胞中。
（2）成功筛选出敲除DUSP9基因的mESCs细胞，并通过PCR、Western blot、qRT-PCR等方法进行了鉴定。
《利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》范文
《利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》篇一一、引言随着基因编辑技术的发展，CRISPR-Cas9系统已成为现代生物医学研究中常用的基因编辑工具之一。
它为科研人员提供了强大的基因敲除、插入或突变的能力，在多种模型动物制备及疾病研究领域具有广泛的应用前景。
本文旨在介绍利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系的过程，为相关研究提供技术参考。
二、材料与方法1. 材料(1) CRISPR-Cas9系统相关组件（包括Cas9蛋白、sgRNA 等）；(2) 小鼠胚胎干细胞系；(3) DUSP9基因特异性敲除载体；(4) 培养基、试剂及其他实验耗材。
2. 方法(1) 设计并构建DUSP9基因敲除载体；(2) 准备小鼠胚胎干细胞系并进行细胞培养；(3) 将DUSP9基因敲除载体与胚胎干细胞共培养，实现基因编辑；(4) 筛选并扩增成功敲除DUSP9基因的胚胎干细胞；(5) 对敲除细胞进行鉴定及保存。
三、实验过程1. DUSP9基因敲除载体的构建根据DUSP9基因序列，设计并合成sgRNA序列，构建DUSP9基因敲除载体。
通过PCR扩增获得目的片段，将其克隆至载体中，构建成功后的载体通过测序验证其准确性。
2. 小鼠胚胎干细胞的培养与准备将小鼠胚胎干细胞置于适宜的培养条件下进行培养，待细胞生长至适宜状态时进行后续实验。
3. 基因编辑及筛选将DUSP9基因敲除载体与小鼠胚胎干细胞共培养，通过CRISPR-Cas9系统实现DUSP9基因的敲除。
随后，通过PCR、测序等方法筛选出成功敲除DUSP9基因的胚胎干细胞。
4. 鉴定与保存对筛选出的成功敲除DUSP9基因的胚胎干细胞进行鉴定，包括细胞形态观察、生长曲线绘制、基因型鉴定等。
将鉴定合格的细胞进行保存，以备后续实验使用。
四、结果与讨论1. 结果通过CRISPR-Cas9系统成功构建了DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系，并筛选出成功敲除DUSP9基因的细胞。
基因敲除型小鼠缩写
基因敲除型小鼠缩写基因敲除型小鼠（Knockout Mouse）是一种在实验室中经过基因编辑技术制造的小鼠模型。
通过敲除特定基因，科学家可以研究该基因在生物体发育、生理功能和疾病发展中的作用。
基因敲除型小鼠的出现为生命科学研究提供了重要工具，有助于我们更深入地理解基因对生命活动的影响。
在基因敲除型小鼠的制备过程中，科学家会选择目标基因，并使用基因编辑技术（如CRISPR/Cas9技术）将其敲除。
通过这种方式，小鼠的基因组中将不再包含目标基因的正常拷贝，从而使得该基因无法正常表达。
这样一来，科学家便可以观察到在缺失该基因的小鼠体内所产生的生理和行为变化。
基因敲除型小鼠的制备需要经过一系列复杂的实验操作。
首先，科学家需要设计合适的引物和合成寡核苷酸，用于引导CRISPR/Cas9系统精确剪切目标基因。
然后，利用载体将CRISPR/Cas9系统导入小鼠的受精卵中，使其在早期胚胎发育阶段就发挥作用。
经过一段时间的培养和发育，科学家便可以获得具有基因敲除突变的小鼠。
基因敲除型小鼠的制备不仅需要技术娴熟的实验操作，还需要对基因功能和细胞生物学等领域的深入理解。
科学家需要充分了解目标基因在生物体中的作用机制，以及其与其他基因的相互作用关系。
只有在对基因功能有清晰认识的基础上，才能准确选择目标基因，并制备出具有特定基因敲除突变的小鼠模型。
基因敲除型小鼠的应用范围非常广泛。
它们可以用于研究基因在发育过程中的作用，探究基因在特定组织和器官中的功能，以及揭示基因与疾病之间的关联。
通过对基因敲除型小鼠进行行为学、生理学和病理学等多方面的分析，科学家可以获取大量关于基因功能的宝贵信息。
基因敲除型小鼠是生命科学研究中的重要工具，为我们研究基因功能和疾病发展提供了有力支持。
通过制备基因敲除型小鼠模型，科学家可以更深入地了解基因的作用机制，从而为疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法。
基因敲除型小鼠的研究将继续推动生命科学领域的发展，为人类健康做出更大的贡献。
crispr-cas9基因敲除小鼠原理
CRISPR—CAS9基因敲除原理
CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是最新出现的一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。
CRISPR 是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。
在这一系统中,crRNA（CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA）结合形成双链RNA，此tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶定位点剪切双链DNA达到对基因组DNA进行修饰的目的。
Cas9结合gRNA，gRNA 的长度约为80个核苷酸,包含两个区域:gRNA 5' 端前20个核苷酸对应于靶标DNA，能结合在靶DNA 上的约60个核苷酸（gRNA 长度取决于表达gRNA 的质粒）形成一个发夹结构，这个结构能帮助gRNA 与Cas9结合,并由此指导与DNA 的结合.
通过gRNA上的靶点序列，在目标基因组上找到靶点序列，并揭开双螺旋，Cas9将剪切DNA双链，造成DNA双链断裂。
Cas9使用简单，可满足多个靶点同时操作。
Insertion /deletion NHEJ HDR
gRNA
Cas9
Donor vector
基因敲除小鼠流程：。
基于CRISPR Cas9技术基因敲除小鼠(Cas9-KO)的制作方法-2018-2-28
基于CRISPR Cas9技术基因敲除小鼠（Cas9-KO）的制作方法一、CRISPR/Cas9靶向基因敲除小鼠制作的基本技术原理：通过CRISPR/Cas9基因敲除技术，crRNA通过碱基配对与tracrRNA（trans-activating RNA）结合，形成双链RNA。
这一tracrRNA:crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶标的特定位点剪切双链DNA。
在与crRNA引导序列互补的位点，Cas9蛋白的HNH核酸酶结构域剪切互补链而Cas9 RuvC-like 结构域剪切非互补链，实现敲除目的基因的功能，制备基因敲除小鼠模型。
二、具体步骤如下：一）模型制作策略制作：利用生物信息学手段(NCBI&IMPC&MGI)，分别仔细分析目的基因敲除后小鼠的生存能力及繁育能力，并结合邻近基因的影响，最终选择合适的敲除区域进行敲除方案的设计，出具相应的制作策略。
二）载体的设计和构建：使用麻省理工学院的CRISPR Design工具（/），依据中靶Score的高低及脱靶Score的高低设计一对长度为20bp的针对靶标DNA的寡聚核苷酸链序列用于制备sgRNA，并在该靶区域设计引物用于后续阳性小鼠的基因鉴定。
1、制备sgRNA的实验方法步骤：1）线性化pUC57-GDNA-T7载体中提pUC57-GDNA-T7载体，用BsaI线性化过夜。
胶回收保存备用。
2）引物退火及加磷酸将上下游引物（干粉）稀释，再进行引物退火及加磷酸。
3）连接&阳性菌落筛选取步骤二中的加磷酸产物与线性化载体pUC57-GDNA-T7进行连接，该连接反应在干式恒温器中进行。
对连接产物进行转化，涂板，37°C培养箱过夜培养。
再用PCR&测序的方法筛选阳性克隆，再将测序正确的克隆进行甘油菌保种，-80°C保存备用4）制备转录模板以构建好的sgRNA载体为模板进行PCR扩增，将PCR产物切胶回收，回收产物离心后倒掉上清留DNA沉淀，再溶解DNA。
《2024年利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》范文
《利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》篇一一、引言在生物学研究领域，基因编辑技术日益显示出其巨大的潜力和应用前景。
CRISPR-Cas9系统作为一种强大的基因编辑工具，已在多个物种中成功用于构建基因敲除模型。
本文旨在介绍如何利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系，为相关研究提供参考。
二、材料与方法1. 材料（1）小鼠胚胎干细胞（mESCs）；（2）CRISPR-Cas9系统相关试剂；（3）DUSP9基因敲除载体；（4）显微操作设备及试剂；（5）实验动物（小鼠）。
2. 方法（1）设计并构建DUSP9基因敲除载体；（2）将载体与mESCs共转染，使DUSP9基因发生双链断裂；（3）利用CRISPR-Cas9系统对断裂的DUSP9基因进行修复，形成基因敲除突变；（4）筛选并扩增基因敲除的mESCs；（5）将基因敲除的mESCs注射到小鼠囊胚中，生成转基因小鼠。
三、实验过程1. 载体构建及转染首先，设计并构建DUSP9基因敲除载体。
该载体应包含靶向DUSP9基因的识别序列、切割位点及修复模板。
随后，将载体与mESCs共转染，使DUSP9基因发生双链断裂。
此过程需在显微操作下进行，确保转染效率和准确性。
2. CRISPR-Cas9系统修复及筛选利用CRISPR-Cas9系统对断裂的DUSP9基因进行修复。
通过非同源末端连接或同源重组等方式，使基因发生突变，形成DUSP9基因敲除的突变体。
随后，通过PCR、测序等方法筛选并扩增基因敲除的mESCs。
3. 转基因小鼠生成及鉴定将扩增得到的基因敲除的mESCs注射到小鼠囊胚中，通过胚胎移植技术生成转基因小鼠。
随后，通过PCR、免疫组化等方法对转基因小鼠进行鉴定，确认DUSP9基因是否成功敲除。
四、结果与讨论1. 结果利用CRISPR-Cas9系统成功构建了DUSP9基因敲除的小鼠胚胎干细胞系。
通过PCR、测序等方法验证了DUSP9基因的敲除效率及准确性。
CRISPR-Cas9基因敲除小鼠
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CHENLI
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Thanks！
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设计了两个剪切位点
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有转入目的基因的
小鼠大多细胞目的基 因发生移码突变，目 的基因转录和翻译都 明显下调。
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二、腺病毒转入大脑皮层额叶
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目标基因是NeuN
CHENLI
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目的基因发生的改变
✓ 缺失一位 ✓ 缺失多位 ✓ 插入一位 ✓ 插入多位
2021/3/7
• 多为移码突变
CHENLI
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Kras的基因变化
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P53和Lkb1不断被损坏， Kras则被修补变得越发 优势
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最终肺中出现肿瘤
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总结
• 事实证明将Cre-dependent引入Cas9工具中， 可以大大扩展Cas9的用途。
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CRISPR-Cas9系统的原理
sgRNA
通过设计sgRNA来确定剪切位点 设计简单快速，无需重复构建核酸内切酶
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3
Cas9的局限性
• 受限于转基因范围，Cas9往往只用与细胞或胚 胎层面的实验。
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CRISPR-Cas9系统的原理
crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基 配对与 tracrRNA （trans-activating RNA ） 结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引 导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶 位点剪切双链 DNA。而通过人工设计这两种 RNA， 可以改造形成具有引导作用的sgRNA （short guide RNA ），足以引导 Cas9 对 DNA 的定点 切割。
• 使得CRISPR-Cas9应用更广泛。
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Cre-dependent Cas9 Rosa26 targeting 矢量图
Rosa26，使转 录可被诱导
荧光蛋白
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转入Cas9后与野生小鼠对比
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神经系统荧光对比
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7
三种实验测试效果：
三种转接方法： 纳米粒子、腺病毒转导、 慢病毒转导。 三个系统（器官）： 免疫、神经、肺（癌）。
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2
CRISPR-Cas9系统的原理
sgRNA
通过设计sgRNA来确定剪切位点 设计简单快速，无需重复构建核酸内切酶
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target
3
Cas9的局限性
• 受限于转基因范围，Cas9往往只用与细胞或胚 胎层面的实验。
• 本实验采用Cre-dependent Rosa26 Cas9 knockin mouse克服了这个局限性。
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一、慢病毒转入树突状细胞
——转入树突状细胞实验过程
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通过荧光蛋白EGFP可以鉴别 Cas9是否转导成功
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10
设计了两个剪切位点
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11
有转入目的基因 的小鼠大多细胞目的 基因发生移码突变， 目的基因转录和翻译 都明显下调。
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12
二、腺病毒转入大脑皮层额叶
目标基因是NeuN
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多数为两个等位基因都被破坏，且其 中多为移码突变。
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三、腺病毒转入肺
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sgKras
sgp53
sgLkb1
Kras同源 修补
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19
P53的基因变化
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• 多为移码突变
20
Lkb1的基因变化
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• 多为移码突变
21
Kras的基因变化
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22
P53和Lkb1不断被损坏， Kras则被修补变得越发优势
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23
最终肺中出现肿瘤
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24
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25
总结
• 事实证明将Cre-dependent引入Cas9工具中， 可以大大扩展Cas9的用途。
• 以后用此方法可以更好的对基因进行修整， 已达成更多的实验，为人类医学和生物学作 出贡献。
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13
目的基因发生的改变
✓ 缺失一位 ✓ 缺失多位 ✓ 插入一位 ✓ 插入多位
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14
荧光显示含有Cre/Cas9 的组织中NeuN表达明显减
少，而非转入非目标的 sgRNA则目标蛋白无影响
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NeuN被破坏的比例十分大
Indel=insertions(插入) and deletions(删除)